Name: application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies DP2DK116645 (aan BSS), Dunn Foundation pilot award en NASA-subsidie 80NSSC22K0250 (aan BSS). Dit project werd ook ondersteund door de Cytometry and Cell Sorting Core van het Baylor College of Medicine met financiering van de CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), de NIH (S10 OD025251, CA125123 en RR024574), en de hulp van Joel M. Sederstrom, plus een instrumentatiesubsidie voor de LPS NIH-subsidie (S10 OD025251). Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

1. Bereiding van het microbioommengsel
<ol><li>Stamp of streep bacteriën uit een glycerol-diepvriesbouillon op een lysogene bouillon (LB)-plaat, of een geschikt groeimedium, en kweek 's nachts bij een optimale temperatuur op basis van bacteriestammen die van belang zijn (meestal 25 °C voor natuurlijke microben van C. elegans ).</li>
	<li>Gebruik van de LB-plaat een enkele kolonie van elk bacterie-isolaat (bijv. 12 bacteriën van de CeMbio-collectie) om 800 μL LB-medium te inoculeren in afzo...

<ol>
	<li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+in+a+bacterial+world,+a+new+imperative+for+the+life+sciences.">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li><li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut.">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li><li>B&#228;ckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage.">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome.">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans.">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li><li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Team+R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li><li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> tidyverse. , (2019).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome.">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages.">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877 (2018).</li><li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ.">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids.">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li><li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIP-MAP:+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes.">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li></ol>

Flowvermimetrie is gebruikt om C. elegans-genen en -routes tegen pathogene kolonisatie en toxiciteit in verschillende onderzoeken te karakteriseren21,22. Hier wordt een 'high throughput alife' benadering gepresenteerd die C. elegans gebruikt om te onderzoeken hoe darmmicrobiomen hun gastheerfysiologie moduleren. Vergeleken met bestaande methoden die gebruik maken van kolonievormende eenheden (CFU) of 16S rRNA-ampliconsequencing 9,16,...

De evolutie van dieren staat onder constante microbiële invloed1. Van diverse microben in de omgeving verwerven dierlijke gastheren specifieke partners2 die de mogelijkheden van de gastheer uitbreiden en zijn fysiologie en vatbaarheid voor ziekten stimuleren3. Metagenomische analyses van het darmmicrobioom brachten bijvoorbeeld verrijkte metabole klassen van microbiële genen aan het licht die een grotere energieoogst en -opslag kunnen opleveren bij zwaarlijvige muizen4, waarvan er vele ook worden aangetroffen in het menselijke darmmicrobioom5. Er is nog steeds een grote behoefte om causale verbanden vast te stellen en de moleculaire determinanten van de impact van het microbioom vast te stellen, hoewel de vooruitgang wordt belemmerd door de complexiteit van het microbioom en de traceerbaarheid van gastheersystemen voor grootschalige screening.
Het modelorganisme C. elegans biedt een platform om het moleculaire begrip van verbanden tussen microbioom en gastheerfysiologie te bevorderen. C. elegans bezit 20 darmcellen met een slijmvlieslaag en villistructuren. Deze cellen zijn uitgerust met overvloedige chemoreceptorgenen die microbiële producten detecteren en antimicrobiële moleculen produceren die mogelijk hun darmkolonisatoren reguleren 6,7. Deze geconserveerde biologie van C. elegans heeft geleid tot een enorm aantal ontdekkingen in gastheersignalering die darmmicroben reguleren, waaronder insulinesignalering, TGF-bèta en MAP-kinase 8,9,10.
C. elegans gebruiken microben als zowel hun dieet voor groei tijdens de ontwikkeling als het microbioom als volwassenen. Naarmate ouder worden, kunnen sommige microben zich te veel ophopen in het darmlumen en verschuift de relatie tussen gastheer en microbe van symbiose naar pathogenese11. In hun natuurlijke habitat komt C. elegans een breed scala aan bacteriesoorten tegen12,13. Sequencing van 16S rDNA van representatieve monsters verzameld in natuurlijke habitats (rot fruit, plantenstengel en dierlijke vectoren) onthulde dat het natuurlijke microbioom van C. elegans wordt gedomineerd door vier bacteriële phyla: Proteobacteriën, Bacteroidetes, Firmicutes en Actinobacteriën. Binnen deze divisies ligt een grote variatie in de diversiteit en rijkdom van bacteriën op basis van de habitat12,13,14,15. Er zijn verschillende gedefinieerde gemeenschappen opgericht, waaronder de 63-leden (BIGbiome)16 en 12-leden (CeMbio) collecties die de belangrijkste microbioomgeslachten vertegenwoordigen die zijn gecreëerd voor de C. elegans-onderzoeksgemeenschap 17. Zowel microbiomen als samenstellende stammen kunnen een diverse invloed hebben op de fysiologie van C. elegans, zoals lichaamsgrootte, groeisnelheid en stressreacties9,16,17. Deze studies bieden middelen en voorbeelden om C. elegans vast te stellen als een model voor microbioomonderzoek.
Hier wordt een op grote deeltjessorteerder (LPS) gebaseerde workflow (Figuur 1) gepresenteerd die gebruik maakt van het C. elegans-systeem om tegelijkertijd de samenstelling van het microbioom en basismetingen van de fysiologie van de gastheer op populatieschaal te meten. Aan de microbiële kant is de workflow aanpasbaar om een gedefinieerd microbioom of enkele microben samen te stellen om de robuustheid en plasticiteit van de gemeenschap te testen met toenemende microbiële interacties. Aan de kant van de gastheer maakt de workflow high-throughput-assays mogelijk om kolonisatieniveaus van fluorescerende microben in het microbioom te meten en de fysiologische uitlezing van de gastheer in termen van ontwikkeling, lichaamsgrootte en reproductie. Alles bij elkaar maakt het microbioommodel van C. elegans high-throughput screens mogelijk om de metabole en genetische determinanten te lokaliseren die de fysiologie van de gastheer moduleren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (1 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-11-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (2 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Costar plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Standard bacteriology agar is also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating manifold</td>
			<td>V&#38;P scientific</td>
			<td>VP1171A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Bacterial OD measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>For 96 well plate and conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.</td>
			<td>R package</td>
			<td>Version 3.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Autosampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Sorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066</td>
			<td>Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
			<td>RPI</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>GNU</td>
			<td>Version 1.3.1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome

De samenstelling van het darmmicrobioom kan een dramatische invloed hebben op de fysiologie van de gastheer tijdens de ontwikkeling en het leven van het dier. Het meten van veranderingen in de samenstelling van het microbioom is cruciaal bij het identificeren van de functionele relaties tussen deze fysiologische veranderingen. Caenorhabditis elegans is naar voren gekomen als een krachtig gastheersysteem om de moleculaire drijfveren van gastheer-microbioominteracties te onderzoeken. Met zijn transparante lichaamsplan en fluorescerend gelabelde natuurlijke microben kunnen de relatieve niveaus van microben in het darmmicrobioom van een individueel C. elegans-dier gemakkelijk worden gekwantificeerd met behulp van een grote deeltjessorteerder. Hier beschrijven we de procedures voor het experimenteel opzetten van een microbioom, het verzamelen en analyseren van C. elegans-populaties in de gewenste levensfase, de werking en het onderhoud van de sorteerder, en statistische analyses van de resulterende datasets. We bespreken ook overwegingen voor het optimaliseren van sorteerinstellingen op basis van de microben die van belang zijn, de ontwikkeling van effectieve poortstrategieën voor de levensfasen van C. elegans en hoe sorteermogelijkheden kunnen worden gebruikt om dierpopulaties te verrijken op basis van de samenstelling van het darmmicrobioom. Voorbeelden van mogelijke toepassingen zullen worden gepresenteerd als onderdeel van het protocol, waaronder het potentieel voor schaalbaarheid naar toepassingen met een hoge doorvoer.

Definiëren van populatiepoorten voor volwassen dieren en larven Hier werden gesynchroniseerde C. elegans L1's gekweekt op een NGM-plaat bezaaid met E. coli OP50 (Eco), een standaard laboratoriumdieet. C. elegans-populaties werden verzameld voor LPS-analyse na 96 uur of 120 uur groei bij 20 °C (figuur 2A). Een dot plot van uitsterven (EXT, een proxy van lichaamsdichtheid) versus time-of-flight (TOF, een proxy van lichaamslengte) creëert twee v...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans is een krachtig model om de moleculaire determinanten te onderzoeken die de interacties tussen gastheer en microbioom aansturen. We presenteren een pijplijn met hoge doorvoer die de niveaus van darmmicrobioomkolonisatie bij één dier profileert, samen met belangrijke aspecten van de fysiologie van C. elegans.

Toepassing van flowvermimetrie voor kwantificering en analyse van het darmmicrobioom van Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

Het darmmicrobioom speelt een belangrijke rol bij het vormgeven van de fysiologie van de gastheer. Dit protocol maakt met name een hoge doorvoerbeoordeling mogelijk van fluorescerende darmmicrobenkolonisatieniveaus in enkelvoudige, cellulaire dieren op grote schaal. Een groot voordeel van deze methode is de mogelijkheid om het darmmicrobioom van levende dieren in realtime te volgen, waardoor eventuele veranderingen met de fysiologie van de gastheer kunnen worden geïdentificeerd en gecorreleerd.De procedure wordt gedemonstreerd door Dana Blackburn, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium. Begin met het wassen van de wormen van het bacteriële gazon met één tot twee milliliter M9-TX. Breng de wormen over naar een gesteriliseerde plaat van twee milliliter met 96 putjes diep.Pellet ze gedurende één minuut op 300 G en verwijder de vloeistof met behulp van een aanzuigspruitstuk. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet van 1,2 milliliter 1,8 milliliter M9-TX toe aan elk putje van de deepwell-plaat dat is gemengd door een paar keer te pipetteren en centrifugeer gedurende één minuut op 300 G. Breng na de laatste wasbeurt het volume in elk putje op 100 microliter met behulp van het aanzuigspruitstuk.Voeg 100 microliter 10 millimolaire levamisol en M9-T toe aan elk putje en laat de wormen vijf minuten verlammen. Voeg vervolgens gedurende twee minuten 4% bleekoplossing toe aan elk putje om bacterieklonten te verminderen. Voeg na de bleekbehandeling M9-TX toe aan elk putje van de plaat om de wormen te wassen.Centrifugeer de plaat en zuig aan tot een eindvolume van 100 microliter na de tweede wasbeurt. Breng de wormen over naar een platte bodem met 96 putjes, die 150 microliter van 10 millimol levamisol en M9-TX bevat. Houd de wormdichtheid op 50 tot 100 wormen per put en splits de wormen in meerdere putten als de populatie te druk is.Schakel de luchtcompressor, de computer en het LPS-instrument in. Controleer en leeg de afvaltank. Controleer en vul de schede en watertanks bij als het volume laag is.Zorg ervoor dat de 250 micrometer fluïdische en optische kerneenheid op zijn plaats zit. Sluit de autosampler aan en zet hem aan. Open de autosampler-instrumentsoftware om de autosampler en de LPS-software te openen.Ga in het LPS-softwarevenster naar bestand en klik op nieuw experiment, selecteer vervolgens opnieuw bestand en klik op nieuwe voorbeeldcontrole. Schakel lasers in om lasers van 488 en 561 nanometer in te schakelen als dit nog niet is gedaan. Maak nu sjablonen voor acquisitiepuntplots, met behulp van vluchttijd, extinctie en fluorescerende kanalen in het LPS-softwarevenster.Klik met de rechtermuisknop in de hoofdtekst van een grafiek om de schaal te wijzigen. Laad vervolgens de controlemonsters. Selecteer in het autosampler-venster prime, ga naar bestand, klik op script openen om het juiste ingebouwde script te selecteren en klik op OK.Ga naar het plaatsjabloon in het menu van de samplersoftware om de gewenste putjes voor analyse te selecteren. Nadat u de plaat op de autosampler-fase hebt geladen en vastgezet, drukt u op run-plaat in het autosampler-venster en slaat u het bestand op wanneer daarom wordt gevraagd, klikt u vervolgens op de knop huidige gegevens opslaan op het bovenste lint in het LPS-softwarevenster en slaat u de gegevens opnieuw op. Open de LPS-software.Navigeer naar bestand en selecteer nieuw experiment, ga vervolgens terug naar bestand en klik op nieuw voorbeeld. Maak een puntplot met de vluchttijd op de X-as en extinctie op de Y-as. Maak nog een stipplot met de vluchttijd op de X-as en rood op de Y-as.Zorg ervoor dat u de lasers inschakelt om de lasers van 488 en 561 nanometer te activeren. Plaats het controlemonsterbuisje op de monsterpoort en klik vervolgens op verwerven in het dialoogvenster Verkrijgen en doseren. Zorg ervoor dat u het bestand opslaat wanneer daarom wordt gevraagd.Zodra er voldoende wormen zijn gemeten om populaties te onderscheiden, selecteert u afbreken in de stippengrafiek die de tijd van vlucht versus uitsterven weergeeft. Teken een poort rond het gebied dat de volwassen bevolking vertegenwoordigt. Navigeer vervolgens naar weergave, klik op poorthiërarchie en controleer of de fluorescerende poorten correct worden vermeld onder de poort voor volwassen bevolking.Maak in de tijd van vlucht versus rode stip poorten rond de gebieden met hoge en lage rode waarden om de interessegebieden te markeren die microbioomkolonisatie bij volwassen wormen laten zien. Zodra de instellingen zijn geoptimaliseerd, gaat u verder met bestand en klikt u op experiment opslaan, klikt u vervolgens op bestand en selecteert u voorbeeld opslaan. Om het opvangapparaat te laden, selecteert u laadplaat A om de verzameltafel in een positie te laten gaan die is voorbereid voor het laden van een opvangbuis of een plaat met 96 putjes.Voor het doseren naar een plaat met 96 putjes, gaat u naar het installatiegedeelte en selecteert u platen, klikt u vervolgens op gekalibreerde platen en kiest u plaat met 96 putjes. Selecteer vervolgens de putten waarnaar de wormen zullen worden gesorteerd en voer het aantal objecten in dat in elk putje moet worden gesorteerd. Zorg ervoor dat u ook de gated regio's van belang specificeert.Als er meerdere omheinde gebieden op dezelfde plaat worden gesorteerd, zorg er dan voor dat u het vakje met de poort voor elke put aanvinkt. Klik op OK om de wijzigingen op te slaan. Nadat u de nummers hebt gesorteerd en de locaties hebt toegewezen, laadt u het monster op de monsterpoort en klikt u op de vulplaatknoppen in het dialoogvenster Verkrijgen en doseren om de dosering in een plaat met 96 putjes te starten.Hogere extensie- en vluchttijdwaarden worden waargenomen bij volwassenen in vergelijking met larven. Nakomelingen van volwassen kinderen van twee dagen oud werden gedomineerd door L1- en L2-stadia, terwijl de meeste nakomelingen van volwassen volwassenen van drie dagen oud L3- en L4-stadia bereikten. Bij kweek op E.coli namen de vluchttijd en extensiewaarden op dag drie toe in vergelijking met dag twee.Bij kweek op ochrobactrum, BH drie en gemengde culturen vertoonden cenor abdidas allegands verschillen in vluchttijd en extensiewaarden. Verhoogde ochrobactrum BH3-kolonisatie werd waargenomen in de gemengde toestand dan in ochrobactrum BH3 alleen. Daarentegen duidden groene, fluorescerende waarden op een lagere OP50-kolonisatie in gemengde toestand dan in OP50 alleen.De wormen zijn sterk scheef in de richting van de Y-as, wat suggereert dat de kolonisatie van OP50 bij de meeste wormen laag is, terwijl de kolonisatie van ochrobactrum en BH3 gelijkmatig verdeeld is over de populatie. De relatie tussen ochrobactrum, BH3-kolonisatieniveaus en de ontwikkeling van de gastheer, zoals lichaamsdichtheid en de verschillen in voortplantingspatronen, werd ook waargenomen. De drie dagen oude volwassenen die op het microbioom van de tweekoppige mix groeiden, vertoonden een breed scala aan RFP-intensiteit, wat wijst op individuele variaties in ochrobactrum-kolonisatie binnen de groep.RFP-beelden van de putten met 15 gesorteerde en individuele wormen van hoge en lage RFP-poorten worden getoond. Het belangrijkste is om te onthouden dat u de juiste bedieningselementen gebruikt voor alle stappen om ervoor te zorgen dat het protocol en de machine goed werken. In realtime kunnen dieren met specifieke kenmerken worden gebruikt om stammen uit gastheer- of microbiële mutantenpools te isoleren om genen te identificeren die post-microbe-interacties reguleren.Geïsoleerde dieren kunnen ook worden gebruikt voor enkelvoudige of verrijkte fenotypische poolgebaseerde stroomafwaartse analyses, zoals RNA-seq of iets dergelijks. Echt, de mogelijkheden zijn echt eindeloos.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur in 96 Well microtiterplaten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandine-extractie en analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

teelt van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In drie dimensies in het Laboratorium

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Kwantificering van lipide overvloed en evaluatie van de distributie van het lipide in Caenorhabditis elegans door Nile rood en olie Red O kleuring

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Zuivering en analyse van Caenorhabditis elegans Extracellular Blaasjes

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Aggregaatkwantificering automatiseren bij Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolatie en karakterisering van de natuurlijke microbiota van het modelnematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Superresolutiemicroscopie van het synaptonemale complex binnen de Caenorhabditis elegans kiembaan

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...