Name: application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00
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Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH DP2DK116645 (à B.S.S.), une bourse pilote de la Fondation Dunn et une subvention de la NASA 80NSSC22K0250 (à B.S.S.). Ce projet a également été soutenu par le centre de cytométrie et de tri cellulaire du Baylor College of Medicine avec un financement de la bourse de soutien aux installations de base du CPRIT (CPRIT-RP180672), du NIH (S10 OD025251, CA125123 et RR024574) et de l’aide de Joel M. Sederstrom, ainsi que d’une subvention d’instrumentation pour la subvention LPS NIH (S10 OD025251). Certaines souches ont été fournies par le CCG, qui est financé par le Bureau des programmes d’infrastructure de recherche des NIH (P40 OD010440).

1. Préparation du mélange de microbiome
<ol><li>Tamponnez ou éliminez les bactéries d’un stock de glycérol de congélation sur une plaque de bouillon de lysogénie (LB) ou un milieu de croissance approprié, et cultivez pendant la nuit à une température optimale en fonction des souches bactériennes d’intérêt (généralement 25 °C pour les microbes naturels de C. elegans ).</li>
	<li>À partir de la plaque LB, utiliser une seule colonie de chaque isolat bactérien (p. ex., 12 bac...

<ol>
	<li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+in+a+bacterial+world,+a+new+imperative+for+the+life+sciences.">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li><li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut.">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li><li>B&#228;ckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage.">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome.">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans.">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li><li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Team+R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li><li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> tidyverse. , (2019).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome.">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages.">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877 (2018).</li><li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ.">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids.">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li><li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIP-MAP:+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes.">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li></ol>

La vermimétrie en flux a été utilisée pour caractériser les gènes et les voies de C. elegans contre la colonisation et la toxicité des agents pathogènes dans plusieurs études21,22. Ici, une approche à haut débit est présentée qui utilise C. elegans pour étudier comment les microbiomes intestinaux modulent la physiologie de leur hôte. Par rapport aux méthodes existantes utilisant des unités formant colonie (UFC) ou le séquençag...

L’évolution animale est sous l’influence microbienne constante1. À partir de divers microbes présents dans l’environnement, les hôtes animaux acquièrent des partenaires spécifiques2 qui étendent les capacités de l’hôte et déterminent sa physiologie et sa susceptibilité aux maladies3. Par exemple, les analyses métagénomiques du microbiome intestinal ont révélé des classes métaboliques enrichies de gènes microbiens qui peuvent conférer une plus grande récolte et stockage d’énergie chez les souris obèses4, dont beaucoup se trouvent également dans le microbiome intestinal humain5. Il y a encore un grand besoin d’établir des relations causales et d’identifier les déterminants moléculaires de l’impact du microbiome, bien que les progrès aient été entravés par la complexité du microbiome et la traçabilité des systèmes hôtes au criblage à grande échelle.
L’organisme modèle C. elegans fournit une plate-forme pour faire progresser la compréhension moléculaire des liens entre le microbiome et la physiologie de l’hôte. C. elegans possède 20 cellules intestinales avec une couche muqueuse et des structures de villosités. Ces cellules sont dotées d’abondants gènes chimiorécepteurs qui détectent les produits microbiens et produisent des molécules antimicrobiennes qui régulent potentiellement leurs colonisateurs intestinaux 6,7. Cette biologie conservée de C. elegans a conduit à un grand nombre de découvertes dans la signalisation de l’hôte qui régule les microbes intestinaux, y compris la signalisation de l’insuline, le TGF-bêta et la MAP Kinase 8,9,10.
C. elegans utilise les microbes à la fois comme régime alimentaire pour la croissance pendant le développement et comme microbiome à l’âge adulte. Avec l’âge, certains microbes peuvent s’accumuler trop dans la lumière intestinale et la relation hôte-microbe passe de la symbiose à la pathogenèse11. Dans son habitat naturel, C. elegans rencontre un large éventail d’espèces bactériennes12,13. Le séquençage de l’ADNr 16S à partir d’échantillons représentatifs prélevés dans des habitats naturels (fruits pourris, tiges végétales et vecteurs animaux) a révélé que le microbiome naturel de C. elegans est dominé par quatre phylums bactériens : les protéobactéries, les Bacteroidetes, les Firmicutes et les Actinobactéries. À l’intérieur de ces divisions, il y a une grande variation dans la diversité et la richesse des bactéries en fonction de l’habitat12,13,14,15. Plusieurs communautés définies ont été établies, y compris les collections de 63 membres (BIGbiome)16 et de 12 membres (CeMbio) représentant les principaux genres de microbiome créés pour la communauté de recherche de C. elegans 17. Les microbiomes et les souches constitutives peuvent avoir un impact diversifié sur la physiologie de C. elegans, comme la taille corporelle, les taux de croissance et les réponses au stress 9,16,17. Ces études fournissent des ressources et des exemples pour établir C. elegans comme modèle pour la recherche sur le microbiome.
Ici, un flux de travail basé sur un grand trieur de particules (LPS) (Figure 1) est présenté qui utilise le système C. elegans pour mesurer simultanément la composition du microbiome et les mesures de base de la physiologie de l’hôte à l’échelle de la population. Du côté microbien, le flux de travail est adaptable pour assembler un microbiome défini ou des microbes uniques afin de tester la robustesse et la plasticité de la communauté avec des interactions microbiennes croissantes. Du côté de l’hôte, le flux de travail permet des tests à haut débit pour mesurer les niveaux de colonisation des microbes fluorescents dans le microbiome et la lecture physiologique de l’hôte en termes de développement, de taille corporelle et de reproduction. Dans l’ensemble, le modèle de microbiome de C. elegans permet à des criblages à haut débit d’identifier les déterminants métaboliques et génétiques modulant la physiologie de l’hôte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (1 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-11-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (2 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Costar plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Standard bacteriology agar is also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating manifold</td>
			<td>V&#38;P scientific</td>
			<td>VP1171A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Bacterial OD measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>For 96 well plate and conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.</td>
			<td>R package</td>
			<td>Version 3.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Autosampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Sorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066</td>
			<td>Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
			<td>RPI</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>GNU</td>
			<td>Version 1.3.1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome

La composition du microbiome intestinal peut avoir un impact considérable sur la physiologie de l’hôte tout au long du développement et de la vie de l’animal. La mesure des changements de composition dans le microbiome est cruciale pour identifier les relations fonctionnelles entre ces changements physiologiques. Caenorhabditis elegans est apparu comme un puissant système hôte pour examiner les moteurs moléculaires des interactions hôte-microbiome. Grâce à son plan corporel transparent et à ses microbes naturels marqués par fluorescence, les niveaux relatifs de microbes dans le microbiome intestinal d’un animal C. elegans individuel peuvent être facilement quantifiés à l’aide d’un grand trieur de particules. Nous décrivons ici les procédures de mise en place expérimentale d’un microbiome, la collecte et l’analyse des populations de C. elegans au stade de vie souhaité, le fonctionnement et la maintenance du trieur, ainsi que les analyses statistiques des ensembles de données résultants. Nous discutons également des considérations relatives à l’optimisation des paramètres du trieur en fonction des microbes d’intérêt, du développement de stratégies de contrôle efficaces pour les stades de vie de C. elegans et de la façon d’utiliser les capacités du trieur pour enrichir les populations animales en fonction de la composition du microbiome intestinal. Des exemples d’applications potentielles seront présentés dans le cadre du protocole, y compris le potentiel d’évolutivité vers des applications à haut débit.

Définition des portes des populations d’adultes et de larves Ici, des C. elegans L1 synchronisés ont été cultivés sur une plaque NGM ensemencée avec E. coli OP50 (Eco), un régime alimentaire standard de laboratoire. Les populations de C. elegans ont été prélevées pour l’analyse LPS après 96 h ou 120 h de croissance à 20 °C (figure 2A). Un diagramme à points de l’extinction (EXT, un indicateur de la densité corporelle) en fo...

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Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans est un modèle puissant pour examiner les déterminants moléculaires à l’origine des interactions hôte-microbiome. Nous présentons un pipeline à haut débit profilant les niveaux de colonisation du microbiome intestinal chez un seul animal ainsi que des aspects clés de la physiologie de C. elegans.

Application de la vermimétrie de flux pour la quantification et l’analyse du microbiome intestinal de Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

Le microbiome intestinal joue un rôle important dans la physiologie de l’hôte. Ce protocole, en particulier, permet d’évaluer à haut débit les niveaux de colonisation microbienne intestinale fluorescente chez des animaux cellulaires uniques à grande échelle. L’un des principaux avantages de cette méthode est la capacité de surveiller le microbiome intestinal des animaux vivants en temps réel, ce qui permet d’identifier et de corréler tout changement avec la physiologie de l’hôte.Dana Blackburn, une associée de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par laver les vers de la pelouse bactérienne avec un à deux millilitres de M9-TX. Transférez les vers dans une plaque creuse stérilisée de deux millilitres à 96 puits.Pelletez-les à 300 G pendant une minute et retirez le liquide à l’aide d’un collecteur d’aspiration. À l’aide d’une pipette multicanaux de 1,2 millilitre, ajoutez 1,8 millilitre de M9-TX dans chaque puits de la plaque à puits profonds mélangé en pipetant plusieurs fois et centrifugez à 300 G pendant une minute. Après le lavage final, portez le volume dans chaque puits à 100 microlitres, en utilisant le collecteur d’aspiration.Ajoutez 100 microlitres de lévamisole de 10 millimolaires et de M9-T dans chaque puits, et laissez les vers se paralyser pendant cinq minutes. Ajoutez ensuite une solution d’eau de Javel à 4 % dans chaque puits pendant deux minutes pour réduire les amas bactériens. Après le traitement à l’eau de Javel, ajoutez du M9-TX dans chaque puits de la plaque pour laver les vers.Centrifuger la plaque et aspirer jusqu’à un volume final de 100 microlitres après le deuxième lavage. Transférez les vers dans une plaque à fond plat de 96 puits, contenant 150 microlitres de 10 millimoles de lévamisole et de M9-TX. Maintenez la densité de vers à 50 à 100 vers par puits et divisez les vers en plusieurs puits si la population est trop surpeuplée.Allumez le compresseur d’air, l’ordinateur et l’instrument LPS. Vérifiez et videz le réservoir à déchets. Vérifiez et remplissez la gaine et les réservoirs d’eau si le volume est faible.Assurez-vous que l’ensemble de noyau fluidique et optique de 250 micromètres est en place. Connectez et allumez l’échantillonneur automatique. Ouvrez le logiciel de l’échantillonneur automatique pour ouvrir l’échantillonneur automatique et le logiciel LPS.Dans la fenêtre du logiciel LPS, accédez au fichier et cliquez sur nouvelle expérience, puis sélectionnez à nouveau le fichier et cliquez sur nouvelle vérification d’échantillon. Permettre aux lasers d’allumer des lasers de 488 et 561 nanomètres si cela n’a pas déjà été fait. Créez maintenant des modèles pour les diagrammes de points d’acquisition, en utilisant le temps de vol, l’extinction et les canaux fluorescents dans la fenêtre du logiciel LPS.Cliquez avec le bouton droit de la souris dans le corps d’un graphique pour modifier la mise à l’échelle. Ensuite, chargez les échantillons de contrôle. Dans la fenêtre de l’échantillonneur automatique, sélectionnez principal, accédez au fichier, cliquez sur ouvrir le script pour sélectionner le script intégré approprié, puis cliquez sur OK.Accédez au modèle de plaque dans le menu du logiciel de l’échantillonneur pour sélectionner les puits souhaités pour l’analyse. Après avoir chargé et fixé la plaque sur la platine de l’échantillonneur automatique, appuyez sur exécuter la plaque dans la fenêtre de l’échantillonneur automatique et enregistrez le fichier lorsque vous y êtes invité, puis cliquez sur le bouton Stocker les données actuelles sur le ruban supérieur de la fenêtre du logiciel LPS et enregistrez à nouveau les données. Ouvrez le logiciel LPS.Accédez au fichier et sélectionnez Nouvelle expérience, puis revenez au fichier et cliquez sur nouvel exemple. Créez un diagramme à points avec le temps de vol sur l’axe X et l’extinction sur l’axe Y. Créez un autre diagramme à points avec le temps de vol sur l’axe X et le rouge sur l’axe Y.Assurez-vous de vérifier que les lasers permettent d’activer les lasers 488 et 561 nanomètres. Positionnez le tube d’échantillon de contrôle sur l’orifice d’échantillonnage, puis cliquez sur Acquérir dans la boîte de dialogue d’acquisition et de distribution. Lorsque vous y êtes invité, assurez-vous d’enregistrer le fichier.Une fois qu’un nombre suffisant de vers a été mesuré pour différencier les populations, sélectionnez l’abandon dans le diagramme à points indiquant le moment de la fuite par rapport à l’extinction. Dessinez une barrière autour de la zone représentant la population adulte. Accédez ensuite à la vue, cliquez sur la hiérarchie des portes et vérifiez que les portes fluorescentes sont correctement répertoriées sous la porte de la population adulte.Dans le diagramme du temps de vol par rapport au point rouge, créez des portes autour des zones de valeur rouge élevée et faible pour mettre en évidence les régions d’intérêt montrant la colonisation du microbiome chez les vers adultes. Une fois les paramètres optimisés, passez au fichier et cliquez sur Enregistrer l’expérience, puis cliquez sur Fichier et sélectionnez Enregistrer l’échantillon. Pour charger l’appareil de prélèvement, sélectionnez la plaque de charge A pour permettre à la platine de prélèvement de se déplacer dans une position préparée pour le chargement d’un tube de prélèvement ou d’une plaque à 96 puits.Pour la distribution sur une plaque à 96 puits, accédez à la section de configuration et sélectionnez les plaques, puis cliquez sur les plaques calibrées et choisissez la plaque à 96 puits. Ensuite, sélectionnez les puits dans lesquels les vers seront triés et entrez le nombre d’objets à trier dans chaque puits. Assurez-vous également de spécifier les zones d’intérêt fermées.S’il y a plusieurs régions fermées triées dans la même plaque, assurez-vous de cocher la case marquée porte chaque puits. Cliquez sur OK pour enregistrer les modifications. Après avoir trié les numéros et attribué les emplacements, chargez l’échantillon sur l’orifice d’échantillonnage et cliquez sur les boutons de la plaque de remplissage dans la boîte de dialogue d’acquisition et de distribution pour lancer la distribution dans une plaque à 96 puits.Des valeurs d’extension et de temps de vol plus élevées sont observées chez les adultes que chez les larves. Les descendants d’adultes âgés de deux jours étaient dominés par les stades L1 et L2, tandis que la plupart des descendants d’adultes âgés de trois jours atteignaient les stades L3 et L4. Lorsqu’il a été cultivé sur E. coli, les valeurs de temps de vol et de prolongation ont augmenté le troisième jour par rapport au deuxième jour.Lorsqu’ils ont été cultivés sur des cultures ochrobactrum, BH trois et mixtes, les allegands cenor abdidas ont montré des différences dans le temps de vol et les valeurs d’extension. Une augmentation de la colonisation de l’ochrobactrum BH3 a été observée dans la condition mixte par rapport à l’ochrobactrum BH3 seul. En revanche, les valeurs vertes et fluorescentes indiquaient une colonisation OP50 plus faible dans l’état mixte que dans l’OP50 seul.Les vers sont fortement inclinés vers l’axe Y, ce qui suggère que la colonisation par OP50 est faible chez la plupart des vers, tandis que les niveaux de colonisation par l’ochrobactrum et BH3 sont uniformément répartis dans la population. La relation entre l’ochrobactrum, les niveaux de colonisation de BH3 et le développement de l’hôte, comme la densité corporelle et les différences dans les modèles de reproduction, a également été observée. Les adultes âgés de trois jours cultivés sur le microbiome mixte à deux membres présentaient une large gamme d’intensité RFP, indiquant des variations individuelles dans la colonisation de l’ochrobactrum au sein du groupe.Des images RFP des puits contenant 15 vers triés et individuels provenant de vannes RFP hautes et basses sont présentées. Le plus important est de ne pas oublier d’utiliser les contrôles appropriés pour toutes les étapes afin de s’assurer que le protocole et la machine fonctionnent correctement. En temps réel, des animaux présentant des caractéristiques spécifiques peuvent être utilisés pour isoler des souches de l’hôte ou des pools de mutants microbiens afin d’identifier les gènes qui régulent les interactions post-microbiennes.Les animaux isolés peuvent également être utilisés pour des analyses en aval basées sur un seul animal ou un pool phénotypique enrichi, comme le séquençage de l’ARN ou autre. Vraiment, les possibilités sont vraiment infinies.

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