Name: application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00
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Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse DP2DK116645 (an B.S.S.), Dunn Foundation Pilot Award und NASA-Zuschuss 80NSSC22K0250 (an B.S.S.) unterstützt. Dieses Projekt wurde auch vom Cytometry and Cell Sorting Core am Baylor College of Medicine mit Mitteln aus dem CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), den NIH (S10 OD025251, CA125123 und RR024574) und der Unterstützung von Joel M. Sederstrom sowie einem Instrumentierungszuschuss für den LPS NIH-Zuschuss (S10 OD025251) unterstützt. Einige Stämme wurden vom CGC zur Verfügung gestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird.

1. Vorbereitung der Mikrobiommischung
<ol><li>Stempeln oder streifen Sie Bakterien aus einem Glycerin-Gefrierschrank auf eine Lysogenese-Bouillon (LB)-Platte oder ein geeignetes Wachstumsmedium und lassen Sie sie über Nacht bei einer optimalen Temperatur wachsen, die auf den interessierenden Bakterienstämmen basiert (typischerweise 25 °C für natürliche Mikroben von C. elegans ).</li>
	<li>Verwenden Sie von der LB-Platte eine einzelne Kolonie aus jedem Bakterienisolat (z. B. 12 Bakterien d...

<ol>
	<li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+in+a+bacterial+world,+a+new+imperative+for+the+life+sciences.">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li><li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut.">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li><li>B&#228;ckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage.">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome.">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans.">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li><li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Team+R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li><li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> tidyverse. , (2019).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome.">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages.">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877 (2018).</li><li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ.">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids.">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li><li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIP-MAP:+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes.">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li></ol>

Die Fließvermimetrie wurde in mehreren Studien verwendet, um die Gene und Signalwege von C. elegans gegen die Kolonisierung und Toxizität von Krankheitserregern zu charakterisieren21,22. Hier wird ein Hochdurchsatz-Ansatz vorgestellt, der C. elegans verwendet, um zu untersuchen, wie Darmmikrobiome ihre Wirtsphysiologie modulieren. Im Vergleich zu bestehenden Methoden, die koloniebildende Einheiten (KBE) oder 16S rRNA-Amplikon-Sequenzierung<sup...

Die Evolution von Tieren steht unter ständigem mikrobiellen Einfluss1. Aus verschiedenen Mikroben in der Umwelt erwerben tierische Wirte spezifische Partner2 , die die Fähigkeiten des Wirts erweitern und seine Physiologie und Anfälligkeit für Krankheiten3 vorantreiben. Metagenomische Analysen des Darmmikrobioms deckten beispielsweise angereicherte Stoffwechselklassen mikrobieller Gene auf, die bei adipösen Mäusen zu einer größeren Energiegewinnung und -speicherung führen können4, von denen viele auch im menschlichen Darmmikrobiom zu finden sind5. Es besteht immer noch ein großer Bedarf, kausale Zusammenhänge herzustellen und die molekularen Determinanten des Einflusses auf das Mikrobiom zu bestimmen, obwohl der Fortschritt durch die Komplexität des Mikrobioms und die Eignung von Wirtssystemen für ein groß angelegtes Screening behindert wurde.
Der Modellorganismus C. elegans bietet eine Plattform, um das molekulare Verständnis der Zusammenhänge zwischen Mikrobiom und Wirtsphysiologie zu verbessern. C. elegans besitzt 20 Darmzellen mit einer Schleimhautschicht und Zottenstrukturen. Diese Zellen sind mit reichlich Chemorezeptor-Genen ausgestattet, die mikrobielle Produkte erkennen und antimikrobielle Moleküle produzieren, die möglicherweise ihre Darmkolonisatoren regulieren 6,7. Diese konservierte Biologie von C. elegans hat zu einer enormen Anzahl von Entdeckungen in der Wirtssignalisierung geführt, die Darmmikroben regulieren, einschließlich der Insulinsignalisierung, TGF-beta und der MAP-Kinase 8,9,10.
C. elegans nutzt Mikroben sowohl als Nahrung für das Wachstum während der Entwicklung als auch als Mikrobiom als Erwachsene. Mit zunehmendem Alter können sich einige Mikroben im Darmlumen übermäßig anreichern und die Wirt-Mikroben-Beziehung verschiebt sich von der Symbiose zur Pathogenese11. In ihrem natürlichen Lebensraum trifft C. elegans auf eine Vielzahl von Bakterienarten12,13. Die Sequenzierung von 16S rDNA aus repräsentativen Proben, die in natürlichen Lebensräumen (faule Früchte, Pflanzenstängel und tierische Vektoren) gesammelt wurden, ergab, dass das natürliche Mikrobiom von C. elegans von vier Bakterienstämmen dominiert wird: Proteobakterien, Bacteroidetes, Firmicutes und Actinobakterien. Innerhalb dieser Unterteilungen gibt es große Unterschiede in der Vielfalt und dem Reichtum der Bakterien, basierend auf dem Lebensraum12,13,14,15. Es wurden mehrere definierte Gemeinschaften gegründet, darunter die 63-köpfigen (BIGbiome)16 und 12-köpfigen (CeMbio) Sammlungen, die die wichtigsten Mikrobiom-Gattungen repräsentieren, die für die C. elegans-Forschungsgemeinschaft geschaffen wurden17. Sowohl Mikrobiome als auch Komponentenstämme können einen vielfältigen Einfluss auf die Physiologie von C. elegans haben, wie z. B. Körpergröße, Wachstumsraten und Stressreaktionen 9,16,17. Diese Studien liefern Ressourcen und Beispiele, um C. elegans als Modell für die Mikrobiomforschung zu etablieren.
Hier wird ein auf Large Particle Sorter (LPS) basierender Arbeitsablauf (Abbildung 1) vorgestellt, der das C. elegans-System nutzt, um gleichzeitig die Zusammensetzung des Mikrobioms und grundlegende Messungen der Wirtsphysiologie auf Populationsebene zu messen. Von der mikrobiellen Seite aus ist der Arbeitsablauf anpassungsfähig, um ein definiertes Mikrobiom oder einzelne Mikroben zusammenzusetzen, um die Robustheit und Plastizität der Gemeinschaft mit zunehmenden mikrobiellen Interaktionen zu testen. Auf der Wirtsseite ermöglicht der Arbeitsablauf Hochdurchsatz-Assays zur Messung des Besiedlungsgrades fluoreszierender Mikroben im Mikrobiom und zur physiologischen Auslesung des Wirts in Bezug auf Entwicklung, Körpergröße und Fortpflanzung. Zusammenfassend ermöglicht das Mikrobiommodell von C. elegans Hochdurchsatz-Screenings, um die metabolischen und genetischen Determinanten zu bestimmen, die die Physiologie des Wirts modulieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (1 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-11-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (2 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Costar plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Standard bacteriology agar is also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating manifold</td>
			<td>V&#38;P scientific</td>
			<td>VP1171A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Bacterial OD measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>For 96 well plate and conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.</td>
			<td>R package</td>
			<td>Version 3.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Autosampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Sorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066</td>
			<td>Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
			<td>RPI</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>GNU</td>
			<td>Version 1.3.1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome

Die Zusammensetzung des Darmmikrobioms kann während der gesamten Entwicklung und des Lebens des Tieres einen dramatischen Einfluss auf die Physiologie des Wirts haben. Die Messung von Veränderungen der Zusammensetzung des Mikrobioms ist entscheidend, um die funktionellen Beziehungen zwischen diesen physiologischen Veränderungen zu identifizieren. Caenorhabditis elegans hat sich als leistungsfähiges Wirtssystem erwiesen, um die molekularen Treiber von Wirt-Mikrobiom-Interaktionen zu untersuchen. Mit seinem transparenten Körperplan und den fluoreszenzmarkierten natürlichen Mikroben können die relativen Konzentrationen von Mikroben im Darmmikrobiom eines einzelnen C. elegans-Tieres mit einem großen Partikelsortierer leicht quantifiziert werden . Hier beschreiben wir die Vorgehensweisen für den experimentellen Aufbau eines Mikrobioms, die Sammlung und Analyse von C. elegans-Populationen im gewünschten Lebensstadium, den Betrieb und die Wartung des Sortierers sowie statistische Analysen der resultierenden Datensätze . Wir diskutieren auch Überlegungen zur Optimierung der Sortierereinstellungen auf der Grundlage der interessierenden Mikroben, die Entwicklung effektiver Anschnittstrategien für die Lebensstadien von C. elegans und wie die Fähigkeiten von Sortierern genutzt werden können, um Tierpopulationen auf der Grundlage der Zusammensetzung des Darmmikrobioms anzureichern. Im Rahmen des Protokolls werden Beispiele für potenzielle Anwendungen vorgestellt, einschließlich des Potenzials für die Skalierbarkeit auf Anwendungen mit hohem Durchsatz.

Definition von adulten und larvenartigen Populationstore Hier wurden synchronisierte C. elegans L1s auf einer NGM-Platte gezüchtet, die mit E. coli OP50 (Eco), einer Standard-Labordiät, ausgesät war. C. elegans-Populationen wurden für die LPS-Analyse nach 96 h oder 120 h Wachstum bei 20 °C gesammelt (Abbildung 2A). Ein Punktdiagramm der Extinktion (EXT, ein Proxy für die Körperdichte) im Vergleich zur Flugzeit (TOF, ein Proxy für die Kö...

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Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans ist ein leistungsfähiges Modell, um die molekularen Determinanten zu untersuchen, die Wirt-Mikrobiom-Interaktionen steuern. Wir präsentieren eine Hochdurchsatz-Pipeline, die die Ebenen der Darmmikrobiom-Kolonisierung einzelner Tiere zusammen mit Schlüsselaspekten der Physiologie von C. elegans profiliert.

Anwendung der Flow-Vermimetrie zur Quantifizierung und Analyse des Darmmikrobioms von Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

Das Darmmikrobiom spielt eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der Physiologie des Wirts. Dieses Protokoll ermöglicht insbesondere die Hochdurchsatzbewertung der Besiedlung von fluoreszierenden Darmmikroben in einzelnen, zellulären Tieren in großem Maßstab. Ein großer Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, das Darmmikrobiom von lebenden Tieren in Echtzeit zu überwachen, was die Identifizierung und Korrelation von Veränderungen mit der Physiologie des Wirts ermöglicht.Das Verfahren wird von Dana Blackburn, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstriert. Waschen Sie zunächst die Würmer mit ein bis zwei Millilitern M9-TX vom Bakterienrasen. Die Würmer werden auf eine sterilisierte, zwei Milliliter tiefe Platte mit einer Tiefe von 96 Löchern gegeben.Pelletieren Sie sie eine Minute lang mit 300 g und entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem Ansaugverteiler. Geben Sie mit einer 1,2-Milliliter-Mehrkanalpipette 1,8 Milliliter M9-TX in jede Vertiefung der Tiefbrunnenplatte, die durch mehrmaliges Pipettieren gemischt wurde, und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 300 g. Nach der letzten Wäsche wird das Volumen in jeder Vertiefung mit dem Ansaugverteiler auf 100 Mikroliter gebracht.Geben Sie 100 Mikroliter 10 Millimolar Levamisol und M9-T in jede Vertiefung und lassen Sie die Würmer fünf Minuten lang lähmen. Geben Sie dann zwei Minuten lang 4%ige Bleichlösung in jede Vertiefung, um Bakterienklumpen zu reduzieren. Geben Sie nach der Bleichbehandlung M9-TX in jede Vertiefung der Platte, um die Würmer zu waschen.Zentrifugieren Sie die Platte und saugen Sie nach dem zweiten Waschen auf ein Endvolumen von 100 Mikrolitern ab. Die Würmer werden auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden gegeben, die 150 Mikroliter 10 Millimol Levamisol und M9-TX enthält. Halten Sie die Wurmdichte bei 50 bis 100 Würmern pro Well und teilen Sie die Würmer auf mehrere Löcher auf, wenn die Population zu überfüllt ist.Schalten Sie den Luftkompressor, den Computer und das LPS-Instrument ein. Überprüfen und entleeren Sie den Fäkalientank. Prüfen und füllen Sie die Mantel- und Wassertanks nach, wenn das Volumen gering ist.Stellen Sie sicher, dass die fluidische und optische Kernbaugruppe mit einem Durchmesser von 250 Mikrometern an Ort und Stelle ist. Schließen Sie den Autosampler an und schalten Sie ihn ein. Öffnen Sie die Autosampler-Gerätesoftware, um den Autosampler und die LPS-Software zu öffnen.Wechseln Sie im LPS-Softwarefenster zu Datei, klicken Sie auf Neues Experiment, wählen Sie dann erneut Datei aus, und klicken Sie auf Neue Stichprobenprüfung. Aktivieren Sie das Einschalten von 488- und 561-Nanometer-Lasern durch Laser, falls dies noch nicht geschehen ist. Erstellen Sie nun Vorlagen für Erfassungspunktdiagramme unter Verwendung von Laufzeit-, Extinktions- und Fluoreszenzkanälen im LPS-Softwarefenster.Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den Text eines Diagramms, um die Skalierung zu ändern. Laden Sie als Nächstes die Kontrollbeispiele. Wählen Sie im Autosampler-Fenster Prime aus, gehen Sie zu Datei, klicken Sie auf Skript öffnen, um das richtige integrierte Skript auszuwählen, und klicken Sie auf OK.Gehen Sie im Menü der Probenahmesoftware zur Plattenvorlage, um die gewünschten Vertiefungen für die Analyse auszuwählen. Nachdem Sie die Platte in den Autosampler-Tisch geladen und gesichert haben, drücken Sie im Autosampler-Fenster auf Run Plate und speichern Sie die Datei, wenn Sie dazu aufgefordert werden, klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Aktuelle Daten speichern" im oberen Menüband im LPS-Softwarefenster und speichern Sie die Daten erneut. Öffnen Sie die LPS-Software.Navigieren Sie zu Datei, wählen Sie Neues Experiment aus, kehren Sie dann zu Datei zurück, und klicken Sie auf Neues Beispiel. Erstellen Sie ein Punktdiagramm mit der Laufzeit auf der X-Achse und der Extinktion auf der Y-Achse. Erstellen Sie ein weiteres Punktdiagramm mit der Laufzeit auf der X-Achse und Rot auf der Y-Achse.Stellen Sie sicher, dass die Laser die 488- und 561-Nanometer-Laser aktivieren können. Positionieren Sie das Kontrollprobenröhrchen auf dem Probenanschluss und klicken Sie dann im Dialogfeld "Erfassen und Dispensieren" auf "Erfassen". Wenn Sie dazu aufgefordert werden, stellen Sie sicher, dass Sie die Datei speichern.Sobald genügend Würmer gemessen wurden, um die Populationen zu unterscheiden, wählen Sie im Punktdiagramm, das die Fluchtzeit im Vergleich zum Aussterben zeigt, Abbruch aus. Zeichne ein Tor um den Bereich, der die erwachsene Bevölkerung repräsentiert. Navigieren Sie dann zur Ansicht, klicken Sie auf Gating-Hierarchie und überprüfen Sie, ob die fluoreszierenden Gatter unter dem Adult-Populations-Gate korrekt aufgeführt sind.Erstellen Sie im Vergleich zum Rotpunktdiagramm im Vergleich zur Flugzeit Tore um die Bereiche mit hohem und niedrigem Rotwert, um die interessierenden Regionen hervorzuheben, die eine Mikrobiombesiedlung bei erwachsenen Würmern zeigen. Sobald die Einstellungen optimiert sind, fahren Sie mit Datei fort, klicken Sie auf Experiment speichern, klicken Sie dann auf Datei und wählen Sie Beispiel speichern aus. Um das Sammelgerät zu beladen, wählen Sie die Ladeplatte A, damit sich die Entnahmestufe in eine Position bewegen kann, die für das Laden eines Sammelröhrchens oder einer 96-Well-Platte vorbereitet ist.Um auf eine 96-Well-Platte zu dosieren, gehen Sie zum Einrichtungsbereich und wählen Sie Platten aus, klicken Sie dann auf kalibrierte Platten und wählen Sie 96-Well-Platte. Wählen Sie als Nächstes die Vertiefungen aus, in die die Würmer sortiert werden sollen, und geben Sie die Anzahl der zu sortierenden Objekte in jede Vertiefung ein. Stellen Sie sicher, dass Sie auch die abgegrenzten Bereiche von Interesse angeben.Wenn es mehrere abgegrenzte Bereiche gibt, die in dieselbe Platte einsortiert werden, stellen Sie sicher, dass Sie das Kontrollkästchen mit der Markierung Gate für jede Vertiefung aktivieren. Klicken Sie auf OK, um die Änderungen zu speichern. Nachdem Sie die Nummern sortiert und die Positionen zugewiesen haben, laden Sie die Probe in den Probenanschluss und klicken Sie auf die Schaltflächen zum Füllen der Platte im Dialogfeld "Erfassen und Dispensieren", um die Abgabe in eine 96-Well-Platte zu starten.Bei erwachsenen Tieren werden höhere Ausdehnungs- und Flugzeitwerte beobachtet als bei Larven. Nachkommen von zwei Tage alten Erwachsenen wurden von L1- und L2-Stadien dominiert, während die meisten Nachkommen von drei Tage alten Erwachsenen L3- und L4-Stadien erreichten. Beim Anbau auf E. coli stiegen die Flugzeit- und Verlängerungswerte am dritten Tag im Vergleich zum zweiten Tag an.Beim Anbau auf Ochrobactrum, BH 3 und Mischkulturen zeigten Cenor abdidas allegands Unterschiede in der Flugzeit und den Ausdehnungswerten. In der Mischbedingung wurde eine erhöhte BH3-Besiedlung von Ochrobactrum beobachtet als in Ochrobactrum BH3 allein. Im Gegensatz dazu zeigten grüne, fluoreszierende Werte eine geringere OP50-Besiedlung im Mischzustand als in OP50 allein.Die Würmer sind stark in Richtung der Y-Achse verzerrt, was darauf hindeutet, dass die OP50-Kolonisierung bei den meisten Würmern gering ist, während die Besiedlung mit Ochrobactrum und BH3 gleichmäßig in der Population verteilt ist. Der Zusammenhang zwischen Ochrobactrum, BH3-Kolonisierungsgrad und der Entwicklung des Wirts, wie z.B. der Körperdichte und den Unterschieden in den Fortpflanzungsmustern, wurde ebenfalls beobachtet. Die drei Tage alten Erwachsenen, die mit dem Mikrobiom aus zwei Mitgliedern gezüchtet wurden, zeigten eine große Bandbreite an RFP-Intensitäten, was auf individuelle Variationen in der Ochrobactrum-Kolonisierung innerhalb der Gruppe hindeutet.Es werden RFP-Bilder der Bohrungen gezeigt, die 15 sortierte und einzelne Würmer aus hohen und niedrigen RFP-Gattern enthalten. Das Wichtigste ist, daran zu denken, für alle Schritte geeignete Steuerelemente zu verwenden, um sicherzustellen, dass das Protokoll und der Computer ordnungsgemäß funktionieren. In Echtzeit können Tiere mit spezifischen Merkmalen verwendet werden, um Stämme aus Wirts- oder mikrobiellen Mutantenpools zu isolieren, um Gene zu identifizieren, die postmikrobielle Interaktionen regulieren.Isolierte Tiere können auch für Einzeltier- oder angereicherte phänotypische Pool-basierte Downstream-Analysen wie RNA-seq oder dergleichen verwendet werden. Wirklich, die Möglichkeiten sind wirklich endlos.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Forschung

Biologie

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

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Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

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Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

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der Anbau von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In drei Dimensionen im Labor

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

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Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

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Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Verwendung von Caenorhabditis elegans zum Screening auf gewebespezifische Chaperon-Interaktionen

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisierung der Aggregatquantifizierung bei Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-Resolution-Mikroskopie des synaptonemalen Komplexes in der Keimbahn von Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...