Name: application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH DP2DK116645 (ל- B.S.S.), פרס הטייס של קרן דאן ומענק נאס"א 80NSSC22K0250 (ל- B.S.S). פרויקט זה נתמך גם על ידי Cytometry and Cell Sorting Core במכללת ביילור לרפואה במימון פרס CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), ה-NIH (S10 OD025251, CA125123 ו-RR024574), ובסיועו של ג'ואל מ. סדרסטרום, בתוספת מענק מכשור למענק LPS NIH (S10 OD025251). חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440).

1. הכנת תערובת מיקרוביום
<ol><li>הטביעו או הוציאו חיידקים ממלאי גליצרול במקפיא על צלחת ציר ליזוגני (LB), או מדיום גידול מתאים, וגדלו במשך הלילה בטמפרטורה אופטימלית המבוססת על זני חיידקים מעניינים (בדרך כלל 25°C עבור חיידקים טבעיים של C. elegans ).</li>
	<li>מצלחת LB, השתמש במושבה אחת מכל מבודד...

<ol>
	<li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+in+a+bacterial+world,+a+new+imperative+for+the+life+sciences.">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li><li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut.">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li><li>B&#228;ckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage.">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome.">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans.">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li><li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Team+R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li><li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> tidyverse. , (2019).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome.">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages.">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877 (2018).</li><li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ.">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids.">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li><li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIP-MAP:+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes.">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li></ol>

ורמימטריית זרימה שימשה לאפיון גנים ומסלולים של C. elegans כנגד התיישבות פתוגנים ורעילות במספר מחקרים21,22. כאן, מוצגת גישה מקובלת בעלת תפוקה גבוהה המשתמשת ב- C. elegans כדי לחקור כיצד מיקרוביום המעי מווסת את הפיזיולוגיה המארחת שלהם. בהשוואה לשיטות קיימות המ?...

אבולוציה של בעלי חיים נמצאת תחת השפעה מיקרוביאלית מתמדת1. ממיקרובים מגוונים בסביבה, פונדקאים של בעלי חיים רוכשים שותפים ספציפיים2 המרחיבים את יכולותיו של הפונדקאי ומניעים את הפיזיולוגיה והרגישות שלו למחלות3. לדוגמה, ניתוחים מטאגנומיים של מיקרוביום המעי חשפו סוגים מטבוליים מועשרים של גנים מיקרוביאליים שעשויים להעניק קצירת אנרגיה גדולה יותר ואחסון בעכברים שמנים4, שרבים מהם נמצאים גם במיקרוביום המעי האנושי5. עדיין יש צורך גדול לבסס קשרים סיבתיים ולאתר את הגורמים המולקולריים של השפעת המיקרוביום, אם כי ההתקדמות עוכבה על ידי מורכבות המיקרוביום והיכולת של מערכות מארחות לבצע בדיקות סקר בקנה מידה גדול.
אורגניזם המודל C. elegans מספק פלטפורמה לקידום הבנה מולקולרית של הקשרים בין מיקרוביום ופיזיולוגיה של המאכסן. C. elegans בעל 20 תאי מעיים עם שכבה רירית ומבנים villi. תאים אלה מצוידים בשפע גנים כימורצפטורים החשים תוצרים מיקרוביאליים ומייצרים מולקולות אנטי-מיקרוביאליות שעשויות לווסת את מושבות המעיים שלהם 6,7. הביולוגיה השמורה הזו של C. elegans הובילה למספר עצום של תגליות באיתות מארח המווסתות את חיידקי המעי, כולל איתות אינסולין, TGF-beta ו-MAP Kinase 8,9,10.
C. elegans משתמשים במיקרובים הן כתזונה לגדילה במהלך ההתפתחות והן כמיקרוביום כמבוגרים. עם הזקנה, חלק מהחיידקים עלולים להצטבר יתר על המידה בלומן המעי והקשר בין הפונדקאי למיקרוב עובר מסימביוזה לפתוגנזה11. בבתי הגידול הטבעיים שלהם, C. elegans פוגש מגוון רחב של מיני חיידקים12,13. ריצוף rDNA 16S מדגימות מייצגות שנאספו בבתי גידול טבעיים (פירות רקובים, גזע צמח ווקטורים של בעלי חיים) גילה כי המיקרוביום הטבעי של C. elegans נשלט על ידי ארבעה פילות חיידקים: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, ו Actinobacteria. בתוך חלוקות אלה טמונה שונות רבה במגוון ובעושר של חיידקים המבוססים על בית הגידול12,13,14,15. מספר קהילות מוגדרות הוקמו, כולל אוספי 63 חברים (BIGbiome)16 ו-12 חברים (CeMbio) המייצגים את סוגי המיקרוביום המובילים שנוצרו עבור קהילת המחקר C. elegans 17. גם למיקרוביום וגם לזני רכיבים יכולה להיות השפעה מגוונת על הפיזיולוגיה של C. elegans, כמו גודל הגוף, קצב הגדילה ותגובות סטרס 9,16,17. מחקרים אלה מספקים משאבים ודוגמאות לביסוס C. elegans כמודל לחקר המיקרוביום.
כאן מוצג תהליך עבודה מבוסס ממיין חלקיקים גדול (LPS) (איור 1) המשתמש במערכת C. elegans כדי למדוד בו-זמנית את הרכב המיקרוביום ואת המדדים הבסיסיים של הפיזיולוגיה של המאכסן בקנה מידה של האוכלוסייה. מהצד המיקרוביאלי, זרימת העבודה ניתנת להתאמה כדי להרכיב מיקרוביום מוגדר או מיקרואורגניזמים בודדים כדי לבחון את החוסן והפלסטיות של הקהילה עם אינטראקציות מיקרוביאליות הולכות וגדלות. מהצד המארח, זרימת העבודה מאפשרת מבחני תפוקה גבוהה למדידת רמות הקולוניזציה של מיקרובים פלואורסצנטיים במיקרוביום וקריאה פיזיולוגית של המארח במונחים של התפתחות, גודל גוף ורבייה. יחד, מודל המיקרוביום של C. elegans מאפשר למסכים בעלי תפוקה גבוהה לאתר את הגורמים המטבוליים והגנטיים המווסתים את הפיזיולוגיה של המאכסן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (1 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-11-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (2 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Costar plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Standard bacteriology agar is also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating manifold</td>
			<td>V&#38;P scientific</td>
			<td>VP1171A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Bacterial OD measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>For 96 well plate and conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.</td>
			<td>R package</td>
			<td>Version 3.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Autosampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Sorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066</td>
			<td>Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
			<td>RPI</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>GNU</td>
			<td>Version 1.3.1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome

להרכב מיקרוביום המעי יכולה להיות השפעה דרמטית על הפיזיולוגיה של המאכסן לאורך ההתפתחות והחיים של החיה. מדידת השינויים בהרכב המיקרוביום חיונית לזיהוי הקשרים התפקודיים בין השינויים הפיזיולוגיים הללו. Caenorhabditis elegans התפתחה כמערכת מארחת רבת עוצמה לבחינת המניעים המולקולריים של אינטראקציות מיקרוביום מארח. בעזרת תוכנית הגוף השקופה שלו והמיקרובים הטבעיים המתויגים כפלואורסצנטיים, ניתן לכמת בקלות את הרמות היחסיות של מיקרובים בתוך מיקרוביום המעי של בעל חיים בודד מסוג C. elegans באמצעות ממיין חלקיקים גדול. כאן אנו מתארים את ההליכים להקמה ניסיונית של מיקרוביום, איסוף וניתוח של אוכלוסיות C. elegans בשלב החיים הרצוי, תפעול ותחזוקת המיון, וניתוחים סטטיסטיים של מערכי הנתונים המתקבלים. כמו כן, נדון בשיקולים לאופטימיזציה של הגדרות המיון בהתבסס על המיקרובים המעניינים, בפיתוח אסטרטגיות גטינג יעילות לשלבי החיים של C. elegans , וכיצד לנצל את יכולות המיון להעשרת אוכלוסיות בעלי חיים בהתבסס על הרכב מיקרוביום המעי. דוגמאות ליישומים פוטנציאליים יוצגו כחלק מהפרוטוקול, כולל פוטנציאל למדרגיות ליישומים בעלי תפוקה גבוהה.

הגדרת שערי אוכלוסייה של בוגרים וזחלים כאן, C. elegans L1s מסונכרנים גודלו על צלחת NGM שנזרעה עם E. coli OP50 (Eco), דיאטת מעבדה סטנדרטית. אוכלוסיות C. elegans נאספו לניתוח LPS לאחר 96 שעות או 120 שעות של צמיחה ב-20°C (איור 2A). חלקת נקודה של הכחדה (EXT, פרוקסי של צפיפות הגוף) לעומת...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans הוא מודל רב-עוצמה לבחינת הדטרמיננטים המולקולריים המניעים אינטראקציות בין המארח למיקרוביום. אנו מציגים צינור בתפוקה גבוהה המתאר את רמות ההתיישבות של מיקרוביום המעי בבעלי חיים בודדים יחד עם היבטים מרכזיים של הפיזיולוגיה של C. elegans.

יישום של ורמימטריית זרימה לכימות וניתוח של מיקרוביום המעי Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

מיקרוביום המעי ממלא תפקידים חשובים בעיצוב הפיזיולוגיה של הפונדקאי. פרוטוקול זה, בפרט, מאפשר הערכה בתפוקה גבוהה של רמות התיישבות חיידקי מעיים פלואורסצנטיים בבעלי חיים תאיים בודדים בקנה מידה גדול. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא היכולת לנטר את מיקרוביום המעי של בעלי חיים בזמן אמת, מה שמאפשר זיהוי והתאמה של כל שינוי עם הפיזיולוגיה של הפונדקאי.מי שתדגים את ההליך תהיה דנה בלקבורן, עמיתת מחקר מהמעבדה שלי. התחילו בשטיפת התולעים מהדשא החיידקי עם מיליליטר אחד עד שניים של M9-TX. מעבירים את התולעים לצלחת מעוקרת של שני מיליליטר 96 עמוק היטב.גלולה אותם ב 300 גרם במשך דקה אחת ולהסיר את הנוזל באמצעות סעפת שאיפה. באמצעות פיפטה רב-ערוצית של 1.2 מיליליטר, הוסף 1.8 מיליליטר של M9-TX לכל באר של צלחת הבאר העמוקה מעורבבת על ידי פיפטינג כמה פעמים וצנטריפוגה ב 300 גרם למשך דקה אחת. לאחר השטיפה הסופית, להביא את נפח כל באר ל 100 מיקרוליטר, באמצעות סעפת שאיפה.הוסיפו 100 מיקרוליטר של 10 מילימולר levamisole ו-M9-T לכל באר, ואפשרו לתולעים לשתק למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו תמיסת אקונומיקה 4% לכל באר למשך שתי דקות כדי להפחית את גושי החיידקים. לאחר הטיפול באקונומיקה, הוסיפו M9-TX לכל באר של הצלחת כדי לשטוף את התולעים.צנטריפוגו את הצלחת ושאפו לנפח סופי של 100 מיקרוליטר לאחר השטיפה השנייה. מעבירים את התולעים לצלחת באר 96 תחתונה שטוחה, המכילה 150 מיקרוליטר של 10 מילימול של levamisole ו- M9-TX. שמרו על צפיפות התולעים על 50 עד 100 תולעים לבאר ופצלו את התולעים למספר בארות אם האוכלוסייה צפופה מדי.הפעל את מדחס האוויר, המחשב ומכשיר LPS. בדוק ורוקן את מיכל האשפה. בדוק ומלא מחדש את הנדן ואת מיכלי המים אם הנפח נמוך.ודא שמכלול הליבה הנוזלית והאופטית של 250 מיקרומטר נמצא במקומו. חבר והפעל את הדוגם האוטומטי. פתח את תוכנת ההתקן autosampler כדי לפתוח את autosampler ואת תוכנת LPS.בחלון תוכנת LPS, עבור אל קובץ ולחץ על ניסוי חדש, ולאחר מכן בחר קובץ שוב ולחץ על בדיקת דוגמה חדשה. אפשר לייזרים להפעיל לייזרים של 488 ו- 561 ננומטר אם זה עדיין לא נעשה. כעת צור תבניות עבור חלקות נקודות רכישה, תוך שימוש בזמן טיסה, הכחדה ותעלות פלורסנט בחלון תוכנת LPS.לחצו לחיצה ימנית בתוך גוף התרשים כדי לשנות את קנה המידה. לאחר מכן, טען את דגימות הבקרה. בחלון הדגימה האוטומטית, בחר ראשוני, עבור לקובץ, לחץ על סקריפט פתוח כדי לבחור את הסקריפט המובנה הנכון ולחץ על אישור.עבור אל תבנית צלחת בתפריט תוכנת הדגימה כדי לבחור את הבארות הרצויות לניתוח. לאחר טעינה ואבטחת הלוחית על במת הדוגם האוטומטי, לחץ על לוחית ההפעלה בחלון הדוגם האוטומטי ושמור את הקובץ כשתתבקש, ולאחר מכן לחץ על לחצן אחסן נתונים נוכחיים ברצועת הכלים העליונה בחלון תוכנת LPS ושמור שוב את הנתונים. פתח את תוכנת LPS.נווט אל קובץ ובחר ניסוי חדש, ולאחר מכן חזור לקובץ ולחץ על דגימה חדשה. צור תרשים נקודה עם זמן הטיסה על ציר X והכחדה על ציר Y. צור תרשים נקודות נוסף עם זמן הטיסה על ציר X ואדום על ציר Y.הקפד לבדוק את הפעלת הלייזרים 488 ו- 561 ננומטר. מקם את צינור הדגימה של הבקרה ביציאת הדגימה ולאחר מכן לחץ על רכישה בתיבת הדו-שיח רכישה וניפוק. כשתתבקש, הקפד לשמור את הקובץ.לאחר שנמדדו מספיק תולעים כדי להבדיל בין אוכלוסיות, בחרו להפיל בחלקת הנקודות המציגה את זמן התעופה לעומת הכחדה. ציירו שער סביב האזור המייצג את האוכלוסייה הבוגרת. לאחר מכן נווט כדי להציג, לחץ על היררכיית gating ובדוק שהשערים הפלואורסצנטיים רשומים כראוי תחת שער האוכלוסייה הבוגרת.בזמן טיסה לעומת תרשים נקודה אדומה, צרו שערים סביב אזורי הערך האדום הגבוה והנמוך כדי להדגיש את אזורי העניין המראים התיישבות מיקרוביום בתולעים בוגרות. לאחר מיטוב ההגדרות, המשך לקובץ ולחץ על שמור ניסוי, ולאחר מכן לחץ על קובץ ובחר שמור דגימה. כדי לטעון את מנגנון האיסוף, בחר לוחית טעינה A כדי לאפשר לשלב האיסוף לעבור למצב מוכן לטעינת צינור איסוף או צלחת באר 96.עבור חלוקה צלחת 96 באר, עבור אל סעיף ההתקנה ובחר צלחות, ולאחר מכן לחץ על צלחות מכוילות ובחר צלחת 96 היטב. לאחר מכן, בחר את הבארות שאליהן ימוינו התולעים והזן את מספר החפצים שיש למיין לכל באר. הקפד לציין גם את אזורי העניין המגודרים.אם ישנם מספר אזורים מגודרים הממוינים לאותה לוחית, הקפד לבדוק את התיבה המסומנת שער כל באר. לחץ על אישור כדי לשמור את השינויים. לאחר מיון מספרים והקצאת המיקומים, טען את הדגימה ליציאת הדגימה ולחץ על כפתורי צלחת המילוי מתיבת הדו-שיח רכישה וחלוקה כדי ליזום חלוקה לצלחת באר 96.ערכי הארכה וזמן טיסה גבוהים יותר נצפים אצל מבוגרים בהשוואה לזחלים. צאצאים מבוגרים בני יומיים נשלטו על ידי שלבי L1 ו- L2, בעוד שרוב הצאצאים ממבוגרים בני שלושה ימים הגיעו לשלבי L3 ו- L4. כאשר גדלו על E.coli, זמן הטיסה וערכי ההארכה עלו ביום השלישי בהשוואה ליום השני.כאשר גדלו על ochrobactrum, BH שלוש ותרבויות מעורבות, cenor abdidas allegands הראו הבדלים בזמן הטיסה ואת ערכי ההרחבה. נשאות מוגברת של ochrobactrum BH3 נצפתה במצב מעורב מאשר ב- ochrobactrum BH3 בלבד. לעומת זאת, ערכים ירוקים פלואורסצנטיים הצביעו על נשאות נמוכה יותר של OP50 במצב המעורב מאשר ב-OP50 בלבד.התולעים מוטות בכבדות לכיוון ציר Y, מה שמרמז על כך שההתיישבות של OP50 נמוכה ברוב התולעים, בעוד שרמות ההתיישבות של אוכרוביקטרום, BH3 מפוזרות באופן שווה באוכלוסייה. כמו כן נצפה הקשר בין אוכרובקטרום, רמות ההתיישבות של BH3 והתפתחות הפונדקאי כגון צפיפות הגוף וההבדלים בדפוסי הרבייה. הבוגרים בני שלושת הימים שגדלו על תערובת שני החברים, מיקרוביום הציג מגוון רחב של עוצמת RFP, מה שמצביע על שינויים אינדיבידואליים בהתיישבות האוכrobactrum בתוך הקבוצה.מוצגות תמונות RFP של הבארות המכילות 15 תולעים ממוינות ובודדות משערי RFP גבוהים ונמוכים. הדבר החשוב ביותר הוא לזכור להשתמש בבקרות מתאימות עבור כל השלבים כדי להבטיח כי הפרוטוקול והמכונה פועלים כראוי. בזמן אמת, בעלי חיים עם תכונות ספציפיות יכולים לשמש לבידוד זנים ממאגרים של מוטציות פונדקאיות או מיקרוביאליות כדי לזהות גנים המווסתים אינטראקציות פוסט-מיקרוביות.בעלי חיים מבודדים יכולים לשמש גם לבעל חיים בודד או לבריכה פנוטיפית מועשרת המבוססת על ניתוחים במורד הזרם, כמו RNA-seq וכדומה. באמת, ההזדמנויות הן באמת אינסופיות.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

טיפוח<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד של קומפלקס סינפטונמלי בתוך נבט Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...