Name: application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00
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इस काम को एनआईएच अनुदान DP2DK116645 (बीएसएस को), डन फाउंडेशन पायलट अवार्ड और नासा अनुदान 80एनएसएससी 22के0250 (बीएसएस को) द्वारा समर्थित किया गया था। इस परियोजना को बायलर कॉलेज ऑफ मेडिसिन में साइटोमेट्री और सेल सॉर्टिंग कोर द्वारा भी समर्थित किया गया था, जिसमें सीपीआरआईटी कोर सुविधा समर्थन पुरस्कार (सीपीआरआईटी -RP180672), एनआईएच (एस 10 OD025251, CA125123 और RR024574) और जोएल एम सेडरस्ट्रॉम की सहायता से एलपीएस एनआईएच अनुदान (एस 10 OD025251) के लिए एक इंस्ट्रूमेंटेशन अनुदान शामिल था। कुछ उपभेदों को सीजीसी द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम (पी 40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया गया है।

1. माइक्रोबायोम मिश्रण की तैयारी
<ol><li>ग्लिसरॉल फ्रीजर स्टॉक से बैक्टीरिया को एक लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) प्लेट, या उचित विकास माध्यम पर स्टैम्प या स्ट्रीक करें, और रुचि के जीवाणु उपभेदों (आमतौर पर स...

<ol>
	<li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+in+a+bacterial+world,+a+new+imperative+for+the+life+sciences.">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li><li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut.">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li><li>B&#228;ckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage.">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome.">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans.">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li><li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Team+R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li><li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> tidyverse. , (2019).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome.">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages.">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877 (2018).</li><li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ.">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids.">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li><li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIP-MAP:+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes.">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li></ol>

फ्लो वर्मिमेट्री का उपयोग कईअध्ययनों में रोगज़नक़ उपनिवेशीकरण और विषाक्तता के खिलाफ सी एलिगेंस जीन और मार्गों को चिह्नित करने के लिए किया गया है। यहां, एक उच्च थ्रूपुट उत्त?...

पशु विकास निरंतर माइक्रोबियल प्रभाव में है1. पर्यावरण में विविध रोगाणुओं से, पशु मेजबानविशिष्ट भागीदारों 2 का अधिग्रहण करते हैं जो मेजबान की क्षमताओं का विस्तार करते हैं और इसके शरीर विज्ञान और रोग3 के लिए संवेदनशीलता को चलाते हैं। उदाहरण के लिए, आंत माइक्रोबायोम के मेटाजेनोमिक विश्लेषण ने माइक्रोबियल जीन के समृद्ध चयापचय वर्गों को उजागर किया जो मोटापे सेग्रस्त चूहों में अधिक ऊर्जा फसल और भंडारण प्रदान कर सकते हैं4, जिनमें से कई मानव आंत माइक्रोबायोम5 में भी पाए जाते हैं। अभी भी कारण संबंधों को स्थापित करने और माइक्रोबायोम प्रभाव के आणविक निर्धारकों को इंगित करने की बहुत आवश्यकता है, हालांकि माइक्रोबायोम जटिलताओं और बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए मेजबान प्रणालियों की ट्रैक्टेबिलिटी से प्रगति बाधित हुई है।
एलिगेंस माइक्रोबायोम और मेजबान शरीर विज्ञान के बीच संबंधों की आणविक समझ को आगे बढ़ाने के लिए एक मंच प्रदान करता है। एलिगेंस में एक म्यूकोसल परत और विली संरचनाओं के साथ 20 आंतों की कोशिकाएं होती हैं। ये कोशिकाएं प्रचुर मात्रा में केमोसेप्टर जीन से लैस होती हैं जो माइक्रोबियल उत्पादों को समझती हैं और रोगाणुरोधी अणुओं का उत्पादन करती हैं जो संभावित रूप से अपने आंत कॉलोनाइज़र 6,7 को नियंत्रित करती हैं। एलिगेंस के इस संरक्षित जीव विज्ञान ने मेजबान सिग्नलिंग में जबरदस्त संख्या में खोजों को जन्म दिया है जो इंसुलिन सिग्नलिंग, टीजीएफ-बीटा और एमएपी काइनेज 8,9,10 सहित आंत रोगाणुओं को नियंत्रित करते हैं।
एलिगेंस विकास के दौरान विकास के लिए अपने आहार और वयस्कों के रूप में माइक्रोबायोम दोनों के रूप में रोगाणुओं का उपयोग करते हैं। बुढ़ापे के साथ, कुछ रोगाणु आंत लुमेन में अधिक जमा हो सकते हैं और मेजबान-माइक्रोब संबंध सहजीवन से रोगजनन11 में बदल जाता है। अपने प्राकृतिक आवासों में, सी एलिगेंस बैक्टीरिया प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला का सामना करता है12,13. प्राकृतिक आवासों (सड़े हुए फल, पौधे के तने और पशु वैक्टर) में एकत्र किए गए प्रतिनिधि नमूनों से अनुक्रमण 16 एस आरडीएनए से पता चला है कि सी एलिगेंस के प्राकृतिक माइक्रोबायोम में चार बैक्टीरियल फ़ाइला का वर्चस्व है: प्रोटियोबैक्टीरिया, बैक्टेरोइड्स, फर्मिक्यूट्स और एक्टिनोबैक्टीरिया। इन विभाजनों के भीतर निवास स्थान12,13,14,15 के आधार पर बैक्टीरिया की विविधता और समृद्धि में बहुत भिन्नता है। कई परिभाषित समुदायों की स्थापना की गई है, जिसमें 63-सदस्यीय (BIGbiome) 16 और 12-सदस्यीय (CeMbio) संग्रह शामिल हैं जो सी एलिगेंस अनुसंधान समुदाय17 के लिए बनाए गए शीर्ष माइक्रोबायोम जेनेरा का प्रतिनिधित्व करते हैं। माइक्रोबायोम और घटक उपभेददोनों सी एलिगेंस के शरीर विज्ञान पर विविध प्रभाव डाल सकते हैं जैसे कि शरीर का आकार, विकास दर और तनाव प्रतिक्रियाएं 9,16,17। ये अध्ययन माइक्रोबायोम अनुसंधान के लिए एक मॉडल के रूप में सी एलिगेंस को स्थापित करने के लिए संसाधन और उदाहरण प्रदान करते हैं।
यहां एक बड़े कण सॉर्टर (एलपीएस) आधारित वर्कफ़्लो (चित्रा 1) प्रस्तुत किया गया है जो जनसंख्या पैमाने पर माइक्रोबायोम संरचना और मेजबान शरीर विज्ञान के बुनियादी उपायों को एक साथ मापने के लिए सी एलिगेंस सिस्टम का उपयोग करता है। माइक्रोबियल पक्ष से, वर्कफ़्लो बढ़ते माइक्रोबियल इंटरैक्शन के साथ समुदाय की मजबूती और प्लास्टिसिटी का परीक्षण करने के लिए एक परिभाषित माइक्रोबायोम या एकल रोगाणुओं को इकट्ठा करने के लिए अनुकूलनीय है। मेजबान पक्ष से, वर्कफ़्लो माइक्रोबायोम में फ्लोरोसेंट रोगाणुओं के उपनिवेशस्तर को मापने और विकास, शरीर के आकार और प्रजनन के संदर्भ में मेजबान शारीरिक रीडआउट को मापने के लिए उच्च थ्रूपुट परख को सक्षम बनाता है। एलिगेंस माइक्रोबायोम मॉडल उच्च थ्रूपुट स्क्रीन को मेजबान शरीर विज्ञान को संशोधित करने वाले चयापचय और आनुवंशिक निर्धारकों को इंगित करने में सक्षम बनाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (1 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-11-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (2 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Costar plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Standard bacteriology agar is also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating manifold</td>
			<td>V&#38;P scientific</td>
			<td>VP1171A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Bacterial OD measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>For 96 well plate and conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.</td>
			<td>R package</td>
			<td>Version 3.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Autosampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Sorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066</td>
			<td>Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
			<td>RPI</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>GNU</td>
			<td>Version 1.3.1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome

आंत माइक्रोबायोम की संरचना पूरे विकास और जानवर के जीवन में मेजबान शरीर विज्ञान पर नाटकीय प्रभाव डाल सकती है। माइक्रोबायोम में संरचनात्मक परिवर्तनों को मापना इन शारीरिक परिवर्तनों के बीच कार्यात्मक संबंधों की पहचान करने में महत्वपूर्ण है। केनोरहाब्डिस एलिगेंस मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन के आणविक ड्राइवरों की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली मेजबान प्रणाली के रूप में उभरा है। इसकी पारदर्शी शरीर योजना और फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्राकृतिक रोगाणुओं के साथ, एक व्यक्तिगत सी एलिगेंस जानवर के आंत माइक्रोबायोम के भीतर रोगाणुओं के सापेक्ष स्तर को एक बड़े कण सॉर्टर का उपयोग करके आसानी से निर्धारित किया जा सकता है। यहां हम एक माइक्रोबायोम के प्रयोगात्मक सेटअप, वांछित जीवन चरण, सॉर्टर के संचालन और रखरखाव में सी एलिगेंस आबादी के संग्रह और विश्लेषण और परिणामी डेटासेट के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। एलिगेंस जीवन चरणों के लिए प्रभावी गेटिंग रणनीतियों के विकास, और आंत माइक्रोबायोम संरचना के आधार पर पशु आबादी को समृद्ध करने के लिए सॉर्टर क्षमताओं का उपयोग कैसे करें, इसके आधार पर सॉर्टर सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए विचारों पर भी चर्चा करते हैं। संभावित अनुप्रयोगों के उदाहरण प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में प्रस्तुत किए जाएंगे, जिसमें उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए स्केलेबिलिटी की क्षमता शामिल है।

वयस्क और लार्वा आबादी द्वार को परिभाषित करना। एलिगेंस एल 1 एस को एक मानक प्रयोगशाला आहार ई कोलाई ओपी 50 (इको) के साथ बीजित एनजीएम प्लेट पर उगाया गया था। एलिगेंस आबादी को 20 डिग्री सेल्सियस...

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Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

केनोरहाब्डिस एलिगेंस मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन को चलाने वाले आणविक निर्धारकों की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है। एलिगेंस फिजियोलॉजी के प्रमुख पहलुओं के साथ आंत माइक्रोबायोम उपनिवेशीकरण के एकल पशु स्तर की रूपरेखा तैयार करने वाली एक उच्च थ्रूपुट पाइपलाइन प्रस्तुत करते हैं।

"केनोरहाब्डिस एलिगेंस आंत माइक्रोबायोम के परिमाणीकरण और विश्लेषण के लिए फ्लो वर्मिमेट्री का अनुप्रयोग"।

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

मेजबान के शरीर विज्ञान को आकार देने में आंत माइक्रोबायोम महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह प्रोटोकॉल, विशेष रूप से, बड़े पैमाने पर एकल, सेलुलर जानवरों में फ्लोरोसेंट आंत माइक्रोब उपनिवेशस्तर के उच्च थ्रूपुट मूल्यांकन की अनुमति देता है। इस विधि का एक बड़ा लाभ वास्तविक समय में जीवित जानवरों के आंत माइक्रोबायोम की निगरानी करने की क्षमता है, जो मेजबान के शरीर विज्ञान के साथ किसी भी परिवर्तन की पहचान और सहसंबंध की अनुमति देता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन मेरी प्रयोगशाला से एक शोध सहयोगी दाना ब्लैकबर्न होगा। एक से दो मिलीलीटर एम 9-टीएक्स के साथ बैक्टीरियल लॉन से कीड़े धोने से शुरू करें। कीड़े को एक निष्फल दो मिलीलीटर 96 अच्छी तरह से गहरी प्लेट में स्थानांतरित करें।उन्हें एक मिनट के लिए 300 ग्राम पर पेलेट करें और एस्पिरेटिंग मैनिफोल्ड का उपयोग करके तरल को हटा दें। 1.2 मिलीलीटर मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके, डीप वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1.8 मिलीलीटर एम 9-टीएक्स जोड़ें, जिसे कुछ बार पाइप करके और एक मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करके मिश्रित किया जाए। अंतिम धोने के बाद, प्रत्येक कुएं में मात्रा को 100 माइक्रोलीटर तक लाएं, एस्पिरेटिंग मैनिफोल्ड का उपयोग करें।प्रत्येक कुएं में 10 मिलीमोलर लेवामिसोल और एम 9-टी के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कीड़े को पांच मिनट के लिए लकवाग्रस्त होने दें। फिर बैक्टीरिया के झुरमुट को कम करने के लिए दो मिनट के लिए प्रत्येक कुएं में 4% ब्लीच घोल जोड़ें। ब्लीच उपचार के बाद, कीड़े धोने के लिए प्लेट के प्रत्येक कुएं में एम 9-टीएक्स जोड़ें।प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें और दूसरे धोने के बाद 100 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में एस्पिरेट करें। कीड़े को एक सपाट तल 96 वेल प्लेट में स्थानांतरित करें, जिसमें 150 माइक्रोलीटर 10 मिलीमोल लेवामिसोल और एम 9-टीएक्स शामिल हैं। कीड़े का घनत्व प्रति कुएं 50 से 100 कीड़े रखें और यदि आबादी बहुत अधिक है तो कीड़े को कई कुओं में विभाजित करें।एयर कंप्रेसर, कंप्यूटर और एलपीएस उपकरण चालू करें। कचरे के टैंक की जाँच करें और खाली करें। यदि मात्रा कम है तो म्यान और पानी के टैंक की जांच करें और फिर से भरें।सुनिश्चित करें कि 250 माइक्रोमीटर फ्लूडिक और ऑप्टिकल कोर असेंबली जगह पर है। कनेक्ट करें और ऑटोसैंपलर चालू करें। ऑटोसैंपलर और एलपीएस सॉफ्टवेयर खोलने के लिए ऑटोसैंपलर उपकरण सॉफ्टवेयर खोलें।LPS सॉफ़्टवेयर विंडो पर, फ़ाइल पर जाएँ और नया प्रयोग क्लिक करें, फिर फ़ाइल का फिर से चयन करें और नया नमूना जाँच क्लिक करें. यदि यह पहले से नहीं किया गया है तो लेजर को 488 और 561 नैनोमीटर लेजर चालू करने के लिए सक्षम करें। अब एलपीएस सॉफ्टवेयर विंडो में उड़ान के समय, विलुप्त होने और फ्लोरोसेंट चैनलों का उपयोग करके डॉट प्लॉट के अधिग्रहण के लिए टेम्पलेट बनाएं।स्केलिंग को संशोधित करने के लिए ग्राफ़ के मुख्य भाग के भीतर राइट क्लिक करें। इसके बाद, नियंत्रण नमूने लोड करें। ऑटोसैंपलर विंडो पर, प्राइम का चयन करें, फ़ाइल पर जाएं, सही अंतर्निहित स्क्रिप्ट का चयन करने के लिए ओपन स्क्रिप्ट पर क्लिक करें और ठीक पर क्लिक करें।विश्लेषण के लिए वांछित कुओं का चयन करने के लिए नमूना सॉफ्टवेयर मेनू पर प्लेट टेम्पलेट पर जाएं। ऑटोसैंपलर चरण पर प्लेट को लोड करने और सुरक्षित करने के बाद, ऑटोसैंपलर विंडो पर रन प्लेट दबाएं और संकेत दिए जाने पर फ़ाइल को सहेजें, फिर एलपीएस सॉफ़्टवेयर विंडो में शीर्ष रिबन पर स्टोर वर्तमान डेटा बटन पर क्लिक करें और डेटा को फिर से सहेजें। LPS सॉफ़्टवेयर खोलें।फ़ाइल पर नेविगेट करें और नए प्रयोग का चयन करें, फिर फ़ाइल पर वापस जाएं और नया नमूना क्लिक करें. एक्स अक्ष पर उड़ान के समय और वाई अक्ष पर विलुप्त होने के साथ एक डॉट प्लॉट बनाएं। एक्स अक्ष पर उड़ान के समय के साथ एक और डॉट प्लॉट बनाएं और वाई अक्ष पर लाल।488 और 561 नैनोमीटर लेजर को सक्रिय करने के लिए लेजर को सक्षम करना सुनिश्चित करें। नमूना पोर्ट पर नियंत्रण नमूना ट्यूब रखें, फिर अधिग्रहण और वितरण संवाद बॉक्स के भीतर अधिग्रहण पर क्लिक करें। संकेत दिए जाने पर, फ़ाइल को सहेजना सुनिश्चित करें।एक बार आबादी को अलग करने के लिए पर्याप्त कीड़े को मापा गया है, तो उड़ान बनाम विलुप्त होने का समय दिखाते हुए डॉट प्लॉट में गर्भपात का चयन करें। वयस्क आबादी का प्रतिनिधित्व करने वाले क्षेत्र के चारों ओर एक गेट खींचें। फिर देखने के लिए नेविगेट करें, गेटिंग पदानुक्रम पर क्लिक करें और जांचें कि फ्लोरोसेंट गेट वयस्क जनसंख्या गेट के नीचे सही ढंग से सूचीबद्ध हैं।उड़ान बनाम लाल डॉट प्लॉट के समय में, वयस्क कीड़े में माइक्रोबायोम उपनिवेशीकरण दिखाने वाले रुचि के क्षेत्रों को उजागर करने के लिए उच्च और निम्न लाल मूल्य वाले क्षेत्रों के आसपास गेट बनाएं। एक बार सेटिंग्स ऑप्टिमाइज़ हो जाने के बाद, फ़ाइल पर आगे बढ़ें और प्रयोग सहेजें पर क्लिक करें, फिर फ़ाइल क्लिक करें और नमूना सहेजें का चयन करें। संग्रह उपकरण को लोड करने के लिए, लोड प्लेट ए का चयन करें ताकि संग्रह चरण को संग्रह ट्यूब या 96 वेल प्लेट लोड करने के लिए प्राइम की स्थिति में ले जाया जा सके।96 वेल प्लेट देने के लिए, सेटअप सेक्शन में जाएं और प्लेटों का चयन करें, फिर कैलिब्रेटेड प्लेटों पर क्लिक करें और 96 वेल प्लेट चुनें। इसके बाद, उन कुओं का चयन करें जिनमें कीड़े को क्रमबद्ध किया जाएगा और प्रत्येक कुएं में क्रमबद्ध की जाने वाली वस्तुओं की संख्या इनपुट करें। रुचि के गेटेड क्षेत्रों को भी निर्दिष्ट करना सुनिश्चित करें।यदि एक ही प्लेट में कई गेटेड क्षेत्रों को क्रमबद्ध किया जा रहा है, तो प्रत्येक बॉक्स चिह्नित गेट को अच्छी तरह से जांचना सुनिश्चित करें। परिवर्तन सहेजने के लिए ठीक क्लिक करें. संख्याओं को सॉर्ट करने और स्थानों को असाइन करने के बाद, नमूना पोर्ट पर नमूना लोड करें और 96 वेल प्लेट में वितरण शुरू करने के लिए अधिग्रहण और वितरण संवाद बॉक्स से फिल प्लेट बटन पर क्लिक करें।लार्वा की तुलना में वयस्कों में उड़ान मूल्यों का उच्च विस्तार और समय देखा जाता है। दो दिन के वयस्कों की संतानों में एल 1 और एल 2 चरणों का वर्चस्व था, जबकि तीन दिन के वयस्कों से अधिकांश संतान एल 3 और एल 4 चरणों तक पहुंच गई थी। जब ई.कोलाई पर उगाया जाता है, तो उड़ान का समय और विस्तार मूल्य दूसरे दिन की तुलना में तीसरे दिन बढ़ जाते हैं।जब ओक्रोबैक्ट्रम, बीएच तीन और मिश्रित संस्कृतियों पर उगाया जाता है, तो सेनोर एबिडास एलेगेंड ने उड़ान के समय और विस्तार मूल्यों में अंतर दिखाया। अकेले ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 की तुलना में मिश्रित स्थिति में बढ़ी हुई ओक्रोबैक्ट्रम बीएच 3 उपनिवेशीकरण देखा गया था। इसके विपरीत, हरे, फ्लोरोसेंट मूल्यों ने अकेले ओपी 50 की तुलना में मिश्रित स्थिति में कम ओपी 50 उपनिवेशीकरण का संकेत दिया।कीड़े वाई अक्ष की ओर भारी तिरछे होते हैं, जिससे पता चलता है कि ओपी 50 उपनिवेशीकरण अधिकांश कीड़े में कम है, जबकि ओक्रोबैक्ट्रम, बीएच 3 उपनिवेशीकरण के स्तर आबादी में समान रूप से वितरित किए जाते हैं। ओक्रोबैक्ट्रम, बीएच 3 उपनिवेशीकरण स्तर और मेजबान के विकास जैसे शरीर घनत्व और प्रजनन पैटर्न में अंतर के बीच संबंध भी देखा गया था। दो सदस्यीय मिश्रण, माइक्रोबायोम पर उगाए गए तीन दिन के वयस्कों ने आरएफपी तीव्रता की एक विस्तृत श्रृंखला का प्रदर्शन किया, जो समूह के भीतर ओक्रोबैक्ट्रम उपनिवेशीकरण में व्यक्तिगत भिन्नताओं का संकेत देता है।उच्च और निम्न आरएफपी गेट ों से 15 क्रमबद्ध और अलग-अलग कीड़े वाले कुओं की आरएफपी छवियां दिखाई गई हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रोटोकॉल और मशीन ठीक से काम कर रहे हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए सभी चरणों के लिए उचित नियंत्रण का उपयोग करना याद रखें। वास्तविक समय में, विशिष्ट विशेषताओं वाले जानवरों का उपयोग मेजबान या माइक्रोबियल उत्परिवर्ती पूल से उपभेदों को अलग करने के लिए किया जा सकता है ताकि जीन की पहचान की जा सके जो पोस्ट माइक्रोब इंटरैक्शन को नियंत्रित करते हैं।पृथक जानवरों का उपयोग एकल जानवर या समृद्ध फेनोटाइपिक पूल आधारित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए भी किया जा सकता है, जैसे आरएनए-सेक या इसी तरह। वास्तव में, अवसर वास्तव में अंतहीन हैं।

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

माप Caenorhabditis एलिगेंस 96 खैर microtiter प्लेट्स में लाइफ स्पैन

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

बुनियादी<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em&gt; तरीके तुल्यकालन और निरीक्षण:

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

में प्रोस्टाग्लैंडीन निष्कर्षण और विश्लेषण<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

की खेती<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</emप्रयोगशाला में तीन आयामों में&gt;

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

ठहराव लिपिड बहुतायत और लिपिड वितरण के मूल्यांकन में Caenorhabditis एलिगेंस द्वारा नील लाल और तेल लाल ओ धुंधला

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस एक्सिटेलर वेसिकल्स का शुद्धिकरण और विश्लेषण

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

ऊतक-विशिष्ट चैपरवन इंटरैक्शन के लिए स्क्रीन करने के लिए कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस का उपयोग करना

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस में कुल मात्रा का ठहराव स्वचालित करना

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

मॉडल नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस के प्राकृतिक माइक्रोबायोटा का अलगाव और लक्षण वर्णन

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

केनोरहाब्डिस एलिगेंस जर्मलाइन के भीतर सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स की सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...