Name: application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH DP2DK116645 (a BSS), dal premio pilota della Fondazione Dunn e dalla sovvenzione NASA 80NSSC22K0250 (a BSS). Questo progetto è stato anche sostenuto dal Cytometry and Cell Sorting Core presso il Baylor College of Medicine con il finanziamento del CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), del NIH (S10 OD025251, CA125123 e RR024574) e l'assistenza di Joel M. Sederstrom, oltre a una sovvenzione per la strumentazione per la sovvenzione LPS NIH (S10 OD025251). Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440).

1. Preparazione della miscela di microbioma
<ol><li>Timbrare o striare i batteri da un brodo congelato di glicerolo su una piastra di brodo di lisogenia (LB) o su un terreno di crescita appropriato e far crescere durante la notte a una temperatura ottimale in base ai ceppi batterici di interesse (in genere 25 °C per i microbi naturali di C. elegans ).</li>
	<li>Dalla piastra LB, utilizzare una singola colonia di ciascun isolato batterico (ad esempio, 12 batteri della collezione CeMbio) per in...

<ol>
	<li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+in+a+bacterial+world,+a+new+imperative+for+the+life+sciences.">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li><li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut.">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li><li>B&#228;ckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage.">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome.">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans.">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li><li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Team+R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li><li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> tidyverse. , (2019).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome.">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages.">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877 (2018).</li><li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ.">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids.">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li><li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIP-MAP:+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes.">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li></ol>

La vermimetria a flusso è stata utilizzata per caratterizzare i geni e le vie di C. elegans contro la colonizzazione e la tossicità dei patogeni in diversi studi21,22. Qui, viene presentato un approccio ad alto rendimento che utilizza C. elegans per studiare come i microbiomi intestinali modulano la fisiologia dell'ospite. Rispetto ai metodi esistenti che utilizzano unità formanti colonie (CFU) o il sequenziamento dell'amplicone dell'rRNA 16S...

L'evoluzione animale è sotto costante influenza microbica1. Da diversi microbi presenti nell'ambiente, gli ospiti animali acquisiscono partner specifici2 che estendono le capacità dell'ospite e guidano la sua fisiologia e suscettibilità alle malattie3. Ad esempio, le analisi metagenomiche del microbioma intestinale hanno scoperto classi metaboliche arricchite di geni microbici che possono conferire una maggiore raccolta e immagazzinamento di energia nei topi obesi4, molti dei quali si trovano anche nel microbioma intestinale umano5. C'è ancora un grande bisogno di stabilire relazioni causali e individuare i determinanti molecolari dell'impatto del microbioma, anche se i progressi sono stati ostacolati dalle complessità del microbioma e dalla trattabilità dei sistemi ospiti per lo screening su larga scala.
L'organismo modello C. elegans fornisce una piattaforma per far progredire la comprensione molecolare dei legami tra microbioma e fisiologia dell'ospite. C. elegans possiede 20 cellule intestinali con uno strato mucoso e strutture di villi. Queste cellule sono dotate di abbondanti geni chemorecettori che rilevano i prodotti microbici e producono molecole antimicrobiche che potenzialmente regolano i loro colonizzatori intestinali 6,7. Questa biologia conservata di C. elegans ha portato a un numero enorme di scoperte nella segnalazione dell'ospite che regola i microbi intestinali, tra cui la segnalazione dell'insulina, il TGF-beta e la MAP chinasi 8,9,10.
C. elegans utilizza i microbi sia come dieta per la crescita durante lo sviluppo che come microbioma da adulti. Con l'avanzare dell'età, alcuni microbi possono accumularsi eccessivamente nel lume intestinale e la relazione ospite-microbo si sposta dalla simbiosi alla patogenesi11. Nel suo habitat naturale, C. elegans incontra una vasta gamma di specie batteriche12,13. Il sequenziamento dell'rDNA 16S da campioni rappresentativi raccolti in habitat naturali (frutti marci, fusto vegetale e vettori animali) ha rivelato che il microbioma naturale di C. elegans è dominato da quattro phyla batterici: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes e Actinobacteria. All'interno di queste divisioni si trova una grande variazione nella diversità e nella ricchezza dei batteri in base all'habitat12,13,14,15. Sono state istituite diverse comunità definite, tra cui le collezioni di 63 membri (BIGbiome)16 e 12 membri (CeMbio) che rappresentano i principali generi di microbioma creati per la comunità di ricerca di C. elegans 17. Sia i microbiomi che i ceppi componenti possono avere un impatto diverso sulla fisiologia di C. elegans, come le dimensioni corporee, i tassi di crescita e le risposte allo stress 9,16,17. Questi studi forniscono risorse ed esempi per stabilire C. elegans come modello per la ricerca sul microbioma.
Qui viene presentato un flusso di lavoro basato su Large Particle Sorter (LPS) (Figura 1) che utilizza il sistema C. elegans per misurare simultaneamente la composizione del microbioma e le misure di base della fisiologia dell'ospite su scala di popolazione. Dal punto di vista microbico, il flusso di lavoro è adattabile per assemblare un microbioma definito o singoli microbi per testare la robustezza e la plasticità della comunità con interazioni microbiche crescenti. Dal punto di vista dell'ospite, il flusso di lavoro consente saggi ad alto rendimento per misurare i livelli di colonizzazione dei microbi fluorescenti nel microbioma e la lettura fisiologica dell'ospite in termini di sviluppo, dimensioni corporee e riproduzione. Nel complesso, il modello di microbioma di C. elegans consente di individuare i determinanti metabolici e genetici che modulano la fisiologia dell'ospite.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (1 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-11-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (2 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Costar plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Standard bacteriology agar is also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating manifold</td>
			<td>V&#38;P scientific</td>
			<td>VP1171A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Bacterial OD measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>For 96 well plate and conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.</td>
			<td>R package</td>
			<td>Version 3.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Autosampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Sorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066</td>
			<td>Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
			<td>RPI</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>GNU</td>
			<td>Version 1.3.1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome

La composizione del microbioma intestinale può avere un impatto drammatico sulla fisiologia dell'ospite durante lo sviluppo e la vita dell'animale. Misurare i cambiamenti di composizione nel microbioma è fondamentale per identificare le relazioni funzionali tra questi cambiamenti fisiologici. Caenorhabditis elegans è emerso come un potente sistema ospite per esaminare i driver molecolari delle interazioni ospite-microbioma. Con la sua pianta corporea trasparente e i microbi naturali marcati con fluorescenza, i livelli relativi di microbi all'interno del microbioma intestinale di un singolo animale di C. elegans possono essere facilmente quantificati utilizzando un grande selezionatore di particelle. Qui descriviamo le procedure per l'impostazione sperimentale di un microbioma, la raccolta e l'analisi delle popolazioni di C. elegans nella fase di vita desiderata, il funzionamento e la manutenzione del selezionatore e le analisi statistiche dei set di dati risultanti. Discutiamo anche le considerazioni per l'ottimizzazione delle impostazioni del selezionatore in base ai microbi di interesse, lo sviluppo di strategie di gating efficaci per le fasi di vita di C. elegans e come utilizzare le capacità del selezionatore per arricchire le popolazioni animali in base alla composizione del microbioma intestinale. Esempi di potenziali applicazioni saranno presentati come parte del protocollo, incluso il potenziale di scalabilità per applicazioni ad alto throughput.

Definizione dei gate di popolazione di adulti e larve Qui, i C. elegans L1 sincronizzati sono stati coltivati su una piastra NGM seminata con E. coli OP50 (Eco), una dieta standard di laboratorio. Le popolazioni di C. elegans sono state raccolte per l'analisi LPS dopo 96 o 120 ore di crescita a 20 °C (Figura 2A). Un dot plot dell'estinzione (EXT, un proxy della densità del corpo) rispetto al tempo di volo (TOF, un proxy della lunghezza del cor...

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Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans è un potente modello per esaminare i determinanti molecolari che guidano le interazioni ospite-microbioma. Presentiamo una pipeline ad alto rendimento che profila i livelli di colonizzazione del microbioma intestinale dei singoli animali insieme ad aspetti chiave della fisiologia di C. elegans.

Applicazione della vermimetria a flusso per la quantificazione e l'analisi del microbioma intestinale di Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

Il microbioma intestinale svolge un ruolo importante nel plasmare la fisiologia dell'ospite. Questo protocollo, in particolare, consente una valutazione ad alto rendimento dei livelli di colonizzazione dei microbi intestinali fluorescenti in singoli animali cellulari su larga scala. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è la capacità di monitorare il microbioma intestinale degli animali vivi in tempo reale, il che consente l'identificazione e la correlazione di eventuali cambiamenti con la fisiologia dell'ospite.A dimostrare la procedura sarà Dana Blackburn, un ricercatore associato del mio laboratorio. Inizia lavando via i vermi dal prato batterico con uno o due millilitri di M9-TX. Trasferire i vermi in una piastra sterilizzata da due millilitri a 96 pozzetti.Pellettatele a 300 G per un minuto e rimuovete il liquido utilizzando un collettore di aspirazione. Utilizzando una pipetta multicanale da 1,2 millilitri, aggiungere 1,8 millilitri di M9-TX a ciascun pozzetto della piastra a pozzetti profondi miscelata mediante pipettaggio un paio di volte e centrifugare a 300 G per un minuto. Dopo il lavaggio finale, portare il volume in ogni pozzetto a 100 microlitri, utilizzando il collettore di aspirazione.Aggiungere 100 microlitri di levamisolo 10 millimolari e M9-T a ciascun pozzetto e lasciare che i vermi si paralizzino per cinque minuti. Quindi aggiungere una soluzione di candeggina al 4% in ciascun pozzetto per due minuti per ridurre i grumi batterici. Dopo il trattamento con candeggina, aggiungere M9-TX in ogni pozzetto della piastra per lavare i vermi.Centrifugare la piastra e aspirare fino a un volume finale di 100 microlitri dopo il secondo lavaggio. Trasferire i vermi in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, contenente 150 microlitri di 10 millimoli di levamisolo e M9-TX. Mantenere la densità dei vermi a 50-100 vermi per pozzetto e dividere i vermi in più pozzetti se la popolazione è troppo affollata.Accendere il compressore d'aria, il computer e lo strumento LPS. Controllare e svuotare il serbatoio di scarico. Controllare e riempire la guaina e i serbatoi dell'acqua se il volume è basso.Assicurarsi che il gruppo nucleo fluidico e ottico da 250 micrometri sia in posizione. Collegare e accendere l'autocampionatore. Aprire il software dello strumento autocampionatore per aprire l'autocampionatore e il software LPS.Nella finestra del software LPS, vai su file e fai clic su nuovo esperimento, quindi seleziona di nuovo file e fai clic su nuovo controllo campione. Abilita i laser per accendere i laser a 488 e 561 nanometri se non è già stato fatto. Ora è possibile creare modelli per i dot plot di acquisizione, utilizzando il tempo di volo, l'estinzione e i canali fluorescenti nella finestra del software LPS.Fare clic con il pulsante destro del mouse all'interno del corpo di un grafico per modificare la scala. Successivamente, caricare i campioni di controllo. Nella finestra del campionatore automatico, selezionare prime, andare su file, fare clic su Apri script per selezionare lo script incorporato corretto e fare clic su OK.Andare al modello di piastra nel menu del software del campionatore per selezionare i pozzetti desiderati per l'analisi. Dopo aver caricato e fissato la piastra sul tavolino dell'autocampionatore, premere Esegui piastra nella finestra dell'autocampionatore e salvare il file quando richiesto, quindi fare clic sul pulsante Memorizza dati correnti sulla barra multifunzione superiore nella finestra del software LPS e salvare nuovamente i dati. Aprire il software LPS.Passare al file e selezionare un nuovo esperimento, quindi tornare al file e fare clic su nuovo campione. Crea un grafico a punti con il tempo di volo sull'asse X e l'estinzione sull'asse Y. Crea un altro dot plot con il tempo di volo sull'asse X e il rosso sull'asse Y.Assicurati di selezionare abilita i laser per attivare i laser a 488 e 561 nanometri. Posizionare la provetta del campione di controllo sulla porta del campione, quindi fare clic su acquisisci nella finestra di dialogo Acquisisci ed eroga. Quando richiesto, assicurati di salvare il file.Una volta che è stato misurato un numero sufficiente di vermi per differenziare le popolazioni, selezionare l'aborto nel dot plot che mostra il tempo di volo rispetto all'estinzione. Disegna un cancello intorno all'area che rappresenta la popolazione adulta. Quindi vai alla vista, fai clic su gerarchia di controllo e controlla che i cancelli fluorescenti siano elencati correttamente sotto il cancello della popolazione adulta.Nel grafico del tempo di volo rispetto al punto rosso, creare cancelli intorno alle aree con valore rosso alto e basso per evidenziare le regioni di interesse che mostrano la colonizzazione del microbioma nei vermi adulti. Una volta ottimizzate le impostazioni, procedi al file e fai clic su Salva esperimento, quindi fai clic su File e seleziona Salva campione. Per caricare l'apparecchio di raccolta, selezionare la piastra di carico A per consentire alla fase di raccolta di spostarsi in una posizione preparata per il caricamento di una provetta di raccolta o di una piastra a 96 pozzetti.Per l'erogazione su una piastra a 96 pozzetti, andare alla sezione di configurazione e selezionare le piastre, quindi fare clic su piastre calibrate e scegliere la piastra a 96 pozzetti. Successivamente, selezionare i pozzetti in cui verranno smistati i vermi e inserire il numero di oggetti da smistare in ciascun pozzetto. Assicurarsi di specificare anche le aree chiuse di interesse.Se ci sono più regioni recintate ordinate nella stessa piastra, assicurarsi di selezionare la casella contrassegnata con gate ogni pozzetto. Fare clic su OK per salvare le modifiche. Dopo aver ordinato i numeri e assegnato le posizioni, caricare il campione sulla porta del campione e fare clic sui pulsanti della piastra di riempimento dalla finestra di dialogo Acquisisci ed eroga per avviare l'erogazione in una piastra a 96 pozzetti.Negli adulti si osservano valori di estensione e tempo di volo più elevati rispetto alle larve. La progenie degli adulti di due giorni è stata dominata dagli stadi L1 e L2, mentre la maggior parte della progenie degli adulti di tre giorni ha raggiunto gli stadi L3 e L4. Quando è stato coltivato con E.coli, il tempo di volo e i valori di estensione sono aumentati il terzo giorno rispetto al secondo giorno.Quando sono stati coltivati su colture ochrobactrum, BH three e miste, cenor abdidas allegands hanno mostrato differenze nel tempo di volo e nei valori di estensione. L'aumento della colonizzazione di ochrobactrum BH3 è stato osservato nella condizione mista rispetto all'ochrobactrum BH3 da solo. Al contrario, i valori fluorescenti verdi indicavano una minore colonizzazione di OP50 nella condizione mista rispetto al solo OP50.I vermi sono fortemente inclinati verso l'asse Y, suggerendo che la colonizzazione di OP50 è bassa nella maggior parte dei vermi, mentre i livelli di colonizzazione di ochrobactrum, BH3 sono distribuiti uniformemente nella popolazione. È stata inoltre osservata la relazione tra l'ocrobaccrum, i livelli di colonizzazione di BH3 e lo sviluppo dell'ospite, come la densità corporea e le differenze nei modelli di riproduzione. Gli adulti di tre giorni cresciuti sul microbioma a due membri hanno mostrato un'ampia gamma di intensità RFP, indicando variazioni individuali nella colonizzazione dell'ochrobactrum all'interno del gruppo.Vengono mostrate le immagini RFP dei pozzi contenenti 15 worm ordinati e singoli da gate RFP alti e bassi. La cosa più importante è ricordarsi di utilizzare controlli appropriati per tutti i passaggi per garantire che il protocollo e la macchina funzionino correttamente. In tempo reale, gli animali con caratteristiche specifiche possono essere utilizzati per isolare ceppi da pool di ospiti o mutanti microbici per identificare i geni che regolano le interazioni post-microbiche.Gli animali isolati possono anche essere utilizzati per analisi a valle basate su un singolo animale o su pool fenotipici arricchiti, come RNA-seq o simili. Davvero, le opportunità sono davvero infinite.

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