Name: application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd DP2DK116645 (til BSS), Dunn Foundation pilot award og NASA grant 80NSSC22K0250 (til BSS). Dette prosjektet ble også støttet av Cytometry and Cell Sorting Core ved Baylor College of Medicine med finansiering fra CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 og RR024574), og assistanse fra Joel M. Sederstrom, pluss et instrumenteringsstipend for LPS NIH-stipendet (S10 OD025251). Noen stammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

1. Fremstilling av mikrobiomblanding
<ol><li>Stemple eller streke ut bakterier fra en glyserolfrysestokk på en lysogen buljongplate (LB), eller passende vekstmedium, og vokse over natten ved en optimal temperatur basert på bakteriestammer av interesse (vanligvis 25 ° C for C. elegans naturlige mikrober).</li>
	<li>Fra LB-platen bruker du en enkelt koloni fra hvert bakterieisolat (f.eks. 12 bakterier fra CeMbio-samlingen) for å inokulere 800 μL LB-medium i separate brønner på en 1 ml dyp...

<ol>
	<li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+in+a+bacterial+world,+a+new+imperative+for+the+life+sciences.">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li><li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut.">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li><li>B&#228;ckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage.">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome.">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans.">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li><li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Team+R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li><li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> tidyverse. , (2019).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome.">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages.">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877 (2018).</li><li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ.">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids.">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li><li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIP-MAP:+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes.">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li></ol>

Flow vermimetry har blitt brukt til å karakterisere C. elegans gener og veier mot patogen kolonisering og toksisitet i flere studier21,22. Her presenteres en høy gjennomstrømnings mottagelig tilnærming som bruker C. elegans for å undersøke hvordan intestinale mikrobiomer modulerer vertsfysiologien. Sammenlignet med eksisterende metoder som bruker kolonidannende enheter (CFU) eller 16S rRNA-amplikonsekvensering 9,16,17,23,24<sup...

Dyrs evolusjon er under konstant mikrobiell påvirkning1. Fra ulike mikrober i miljøet får dyreverter spesifikke partnere2 som utvider vertens evner og driver dens fysiologi og følsomhet for sykdom3. For eksempel avdekket metagenomiske analyser av tarmmikrobiomet berikede metabolske klasser av mikrobielle gener som kan gi større energihøsting og lagring hos overvektige mus4, hvorav mange også finnes i det humane tarmmikrobiomet5. Det er fortsatt et stort behov for å etablere årsakssammenhenger og finne molekylære determinanter for mikrobiompåvirkningen, selv om fremgangen har blitt hindret av mikrobiometkompleksiteten og trekkbarheten til vertssystemer til storskala screening.
Modellorganismen C. elegans gir en plattform for å fremme molekylær forståelse av koblinger mellom mikrobiom og vertsfysiologi. C. elegans har 20 tarmceller med et slimhinnelag og villi-strukturer. Disse cellene er utstyrt med rikelig kjemoreceptorgener som sanser mikrobielle produkter og produserer antimikrobielle molekyler som potensielt regulerer tarmkolonisatorene 6,7. Denne konserverte biologien til C. elegans har ført til et enormt antall funn i vertssignalering som regulerer tarmmikrober, inkludert insulinsignalering, TGF-beta og MAP Kinase 8,9,10.
C. elegans bruker mikrober som både deres diett for vekst under utvikling og mikrobiom som voksne. Med alderdommen kan noen mikrober overakkumuleres i tarmlumen, og vertsmikrobeforholdet skifter fra symbiose til patogenese11. I sine naturlige habitater møter C. elegans et bredt spekter av bakteriearter12,13. Sekvensering av 16S rDNA fra representative prøver samlet inn i naturlige habitater (råtne frukter, plantestamme og dyrevektorer) avslørte at det naturlige mikrobiomet til C. elegans domineres av fire bakterielle phyla: Proteobakterier, Bacteroidetes, Firmicutes og Actinobacteria. Innenfor disse divisjonene ligger stor variasjon i bakteriens mangfold og rikdom basert på habitatet12,13,14,15. Flere definerte samfunn har blitt etablert, inkludert samlingene med 63 medlemmer (BIGbiome)16 og 12-medlemmer (CeMbio) som representerer de beste mikrobiomslektene opprettet for C. elegans forskningssamfunn17. Både mikrobiomer og komponentstammer kan ha en variert innvirkning på fysiologien til C. elegans som kroppsstørrelse, vekstrater og stressresponser 9,16,17. Disse studiene gir ressurser og eksempler for å etablere C. elegans som en modell for mikrobiomforskning.
Her presenteres en stor partikkelsorterer (LPS) basert arbeidsflyt (figur 1) som bruker C. elegans-systemet til samtidig å måle mikrobiomsammensetning og grunnleggende mål på vertsfysiologi på populasjonsskalaen. Fra den mikrobielle siden kan arbeidsflyten tilpasses for å sette sammen et definert mikrobiom eller enkeltmikrober for å teste robustheten og plastisiteten i samfunnet med økende mikrobielle interaksjoner. Fra vertssiden muliggjør arbeidsflyten høye gjennomstrømningsanalyser for å måle koloniseringsnivåer av fluorescerende mikrober i mikrobiomet og vertsfysiologisk avlesning når det gjelder utvikling, kroppsstørrelse og reproduksjon. Samlet sett muliggjør C. elegans mikrobiommodell skjermer med høy gjennomstrømning for å finne de metabolske og genetiske determinantene som modulerer vertsfysiologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (1 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-11-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (2 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Costar plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Standard bacteriology agar is also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating manifold</td>
			<td>V&#38;P scientific</td>
			<td>VP1171A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Bacterial OD measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>For 96 well plate and conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.</td>
			<td>R package</td>
			<td>Version 3.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Autosampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Sorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066</td>
			<td>Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
			<td>RPI</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>GNU</td>
			<td>Version 1.3.1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome

Sammensetningen av tarmmikrobiomet kan ha en dramatisk innvirkning på vertsfysiologien gjennom utviklingen og dyrets liv. Måling av sammensetningsendringer i mikrobiomet er avgjørende for å identifisere de funksjonelle forholdene mellom disse fysiologiske endringene. Caenorhabditis elegans har dukket opp som et kraftig vertssystem for å undersøke molekylære drivere av vertsmikrobiominteraksjoner. Med sin gjennomsiktige kroppsplan og fluorescerende merkede naturlige mikrober, kan de relative nivåene av mikrober i tarmmikrobiomet til et individuelt C. elegans-dyr enkelt kvantifiseres ved hjelp av en stor partikkelsortering. Her beskriver vi prosedyrene for eksperimentelt oppsett av et mikrobiom, innsamling og analyse av C. elegans-populasjoner i ønsket livsstadium, drift og vedlikehold av sortereren, og statistiske analyser av de resulterende datasettene. Vi diskuterer også hensyn for optimalisering av sorteringsinnstillinger basert på mikrober av interesse, utvikling av effektive gatingstrategier for C. elegans livsstadier, og hvordan man kan utnytte sorteringsevner for å berike dyrepopulasjoner basert på tarmmikrobiomsammensetning. Eksempler på potensielle applikasjoner vil bli presentert som en del av protokollen, inkludert potensialet for skalerbarhet til applikasjoner med høy gjennomstrømning.

Definere populasjonsporter for voksne og larver Her ble synkroniserte C. elegans L1 dyrket på en NGM-plate sådd med E. coli OP50 (Eco), en standard laboratoriediett. C. elegans-populasjoner ble samlet for LPS-analyse etter 96 timer eller 120 timers vekst ved 20 °C (figur 2A). Et punktplott av utryddelse (EXT, en proxy for kroppstetthet) versus time-of-flight (TOF, en proxy av kroppslengde) skaper to visuelt separerte skyer av dyr. Hver prikk ...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans er en kraftig modell for å undersøke molekylære determinanter som driver vertsmikrobiom-interaksjoner. Vi presenterer en rørledning med høy gjennomstrømning som profilerer enkeltdyrnivåene av tarmmikrobiomkolonisering sammen med viktige aspekter ved C. elegans-fysiologien.

Anvendelse av strømningsvermimetri for kvantifisering og analyse av Caenorhabditis elegans tarmmikrobiom

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

Tarmmikrobiomet spiller viktige roller i å forme vertsfysiologien. Denne protokollen tillater spesielt høy gjennomstrømningsvurdering av fluorescerende tarmmikrobekoloniseringsnivåer i enkelte, cellulære dyr i stor skala. En stor fordel med denne metoden er evnen til å overvåke tarmmikrobiomet til levende dyr i sanntid, noe som gjør det mulig å identifisere og korrelere eventuelle endringer med vertens fysiologi.Demonstrere prosedyren vil være Dana Blackburn, en forskningsassistent fra laboratoriet mitt. Begynn med å vaske ormene av bakterieplenen med en til to milliliter M9-TX. Overfør ormene til en sterilisert to milliliter 96 brønn dyp plate.Pellet dem ved 300 G i ett minutt og fjern væsken ved hjelp av en aspirasjonsmanifold. Bruk en 1,2 milliliter flerkanals pipette, tilsett 1,8 ml M9-TX til hver brønn på den dype brønnplaten blandet ved pipettering et par ganger og sentrifuge ved 300 G i ett minutt. Etter den endelige vasken, ta volumet i hver brønn til 100 mikroliter ved hjelp av aspirasjonsmanifolden.Tilsett 100 mikroliter 10 millimolar levamisol og M9-T til hver brønn, og la ormene lamme i fem minutter. Deretter tilsettes 4% blekemiddel løsning til hver brønn i to minutter for å redusere bakterieklumper. Etter blekemiddelbehandlingen, tilsett M9-TX i hver brønn på platen for å vaske ormene.Sentrifuger platen og aspirer til et endelig volum på 100 mikroliter etter den andre vasken. Overfør ormene til en flatbunn 96 brønnplate, som inneholder 150 mikroliter 10 millimol levamisol og M9-TX. Hold ormtettheten på 50 til 100 ormer per brønn og del ormene i flere brønner hvis befolkningen er for overfylt.Slå på luftkompressoren, datamaskinen og LPS-instrumentet. Sjekk og tøm avfallstanken. Kontroller og fyll på kappe og vanntanker hvis volumet er lavt.Forsikre deg om at 250 mikrometer fluidisk og optisk kjerneenhet er på plass. Koble til og slå på den automatiske prøvetakeren. Åpne programvaren for automatisk prøvetakerinstrument for å åpne den automatiske prøvetakeren og LPS-programvaren.I LPS-programvarevinduet går du til fil og klikker på nytt eksperiment, velger deretter fil igjen og klikker på ny prøvekontroll. Gjør det mulig for lasere å slå på 488 og 561 nanometer lasere hvis det ikke allerede er gjort. Opprett nå maler for anskaffelsespunktplott, ved hjelp av flytid, utryddelse og fluorescerende kanaler i LPS-programvarevinduet.Høyreklikk i brødteksten i en graf for å endre skaleringen. Deretter laster du inn kontrolleksemplene. I vinduet for automatisk prøvetaker velger du prime, går til fil, klikker åpne skript for å velge riktig innebygd skript og klikker ok.Gå til platemal på prøvetakerprogramvaremenyen for å velge de ønskede brønnene for analyse. Etter at du har lastet og sikret platen på det automatiske prøvetakertrinnet, trykker du på kjøreplaten i det automatiske prøvetakervinduet og lagrer filen når du blir bedt om det, og deretter klikker du på lagre gjeldende data knappen på det øverste båndet i LPS-programvarevinduet og lagrer dataene igjen. Åpne LPS-programvaren.Naviger til fil og velg nytt eksperiment, gå deretter tilbake til filen og klikk på nytt eksempel. Lag et punktdiagram med flytiden på X-aksen og utryddelse på Y-aksen. Opprett et nytt punktdiagram med flytiden på X-aksen og rød på Y-aksen.Sørg for å sjekke aktivere lasere for å aktivere 488 og 561 nanometer lasere. Plasser kontrollprøverøret på prøveporten, og klikk deretter Hent i dialogboksen Hent og dispenser. Når du blir bedt om det, må du huske å lagre filen.Når nok ormer er målt til å skille populasjoner, velger du abort i punktplottet som viser tidspunktet for flukt versus utryddelse. Tegn en port rundt området som representerer den voksne befolkningen. Naviger deretter for å se, klikk på gating-hierarkiet og kontroller at fluorescerende porter er riktig oppført under den voksne befolkningsporten.I tiden for flukt versus rødprikkplott, opprett porter rundt områdene med høy og lav rød verdi for å markere interesseområdene som viser mikrobiomkolonisering i voksne ormer. Når innstillingene er optimalisert, fortsett til fil og klikk lagre eksperiment, klikk deretter på fil og velg lagre prøve. For å laste oppsamlingsapparatet, velg lastplate A for å la oppsamlingstrinnet bevege seg i en posisjon som er primet for lasting av enten et oppsamlingsrør eller en 96-brønnplate.For dispensering til en 96 brønnplate, gå til oppsettseksjonen og velg plater, klikk deretter på kalibrerte plater og velg 96 brønnplate. Velg deretter brønnene som ormene skal sorteres til, og skriv inn antall objekter som skal sorteres i hver brønn. Sørg for å spesifisere de inngjerdede områdene av interesse også.Hvis det er flere gated regioner som sorteres i samme plate, må du sørge for å merke av i boksen merket gate hver brønn. Klikk ok for å lagre endringene. Etter å ha sortert tall og tildelt stedene, legger du prøven på prøveporten og klikker på fyllplateknappene fra dialogboksen Hent og dispenser for å starte dispensering i en 96-brønnplate.Høyere ekstensjons- og flygetid observeres hos voksne sammenlignet med larver. Forfedre fra to dager gamle voksne var dominert av L1- og L2-stadier, mens de fleste avkom fra tre dager gamle voksne nådde L3- og L4-stadier. Når den ble dyrket på E.coli, økte flytiden og forlengelsesverdiene på dag tre sammenlignet med dag to.Når dyrket på ochrobactrum, BH tre og blandede kulturer, viste cenor abdidas allegands forskjeller i flytid og forlengelsesverdier. Økt okrobaktrum BH3-kolonisering ble observert i blandet tilstand enn i ochrobactrum BH3 alene. I motsetning til dette indikerte grønne, fluorescerende verdier lavere OP50-kolonisering i blandet tilstand enn i OP50 alene.Ormene er sterkt skjevt mot Y-aksen, noe som tyder på at OP50-kolonisering er lav i de fleste ormer, mens nivåene av okrobaktrum, BH3-kolonisering er jevnt fordelt i befolkningen. Forholdet mellom ochrobactrum, BH3 koloniseringsnivåer og vertens utvikling som kroppstetthet og forskjellene i reproduksjonsmønstre ble også observert. De tre dager gamle voksne vokst på de to medlemsblandingene, viste mikrobiomet et bredt spekter av RFP-intensitet, noe som indikerer individuelle variasjoner i ochrobactrum kolonisering i gruppen.RFP-bilder av brønnene som inneholder 15 sorterte og individuelle ormer fra høye og lave RFP-porter vises. Det viktigste er å huske å bruke passende kontroller for alle trinnene for å sikre at protokollen og maskinen fungerer som den skal. I sanntid kan dyr med spesifikke egenskaper brukes til å isolere stammer fra verts- eller mikrobielle mutantbassenger for å identifisere gener som regulerer postmikrobeinteraksjoner.Isolerte dyr kan også brukes til enkeltdyr eller berikede fenotypiske bassengbaserte nedstrømsanalyser, som RNA-seq eller lignende. Virkelig, mulighetene er virkelig uendelige.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grunnleggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og observasjon

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Utvinning og analyse i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

dyrking av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensjoner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Kvantifisering av Lipid overflod og evaluering av Lipid distribusjon i Caenorhabditis elegans av Nilen rød og olje Red O flekker

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensing og analyse av Caenorhabditis elegans Ekstracellulære vesikler

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Bruke Caenorhabditis elegans til å screene for vevsspesifikke chaperone interaksjoner

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisere aggregert kvantifisering i Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolering og karakterisering av den naturlige mikrobiotaen til modellen Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Superoppløsningsmikroskopi av det synaptonemale komplekset i Caenorhabditis elegans germline

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...