Name: application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00
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Este trabalho foi apoiado por subsídios do NIH DP2DK116645 (para B.S.S.), Dunn Foundation prêmio piloto e NASA grant 80NSSC22K0250 (para B.S.S.). Este projeto também foi apoiado pelo Cytometry and Cell Sorting Core no Baylor College of Medicine com financiamento do CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), do NIH (S10 OD025251, CA125123 e RR024574), e da assistência de Joel M. Sederstrom, além de uma concessão de instrumentação para a concessão LPS NIH (S10 OD025251). Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

1. Preparação da mistura do microbioma
<ol><li>Carimbar ou riscar bactérias de um congelador de glicerol em uma placa de caldo de lisogenia (LB), ou meio de crescimento apropriado, e crescer durante a noite a uma temperatura ideal com base em cepas bacterianas de interesse (tipicamente 25 °C para micróbios naturais de C. elegans ).</li>
	<li>A partir da placa LB, use uma única colônia de cada isolado bacteriano (por exemplo, 12 bactérias da coleção CeMbio) para inocular 800 μL de me...

<ol>
	<li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+in+a+bacterial+world,+a+new+imperative+for+the+life+sciences.">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li><li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut.">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li><li>B&#228;ckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage.">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome.">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans.">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li><li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Team+R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li><li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> tidyverse. , (2019).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome.">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages.">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877 (2018).</li><li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ.">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids.">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li><li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIP-MAP:+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes.">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li></ol>

A vermimetria de fluxo tem sido utilizada para caracterizar genes e vias de C. elegans contra a colonização e toxicidade de patógenos em diversos estudos21,22. Aqui, uma abordagem de alto rendimento é apresentada que usa C. elegans para investigar como os microbiomas intestinais modulam sua fisiologia hospedeira. Em comparação com os métodos existentes que utilizam unidades formadoras de colônias (UFC) ou sequenciamento do amplicon de 16...

A evolução animal está sob constante influência microbiana1. A partir de diversos micróbios no ambiente, os hospedeiros animais adquirem parceiros específicos2 que ampliam as capacidades do hospedeiro e impulsionam sua fisiologia e suscetibilidade a doenças3. Por exemplo, análises metagenômicas do microbioma intestinal descobriram classes metabólicas enriquecidas de genes microbianos que podem conferir maior colheita e armazenamento de energia em camundongos obesos4, muitos dos quais também são encontrados no microbioma intestinal humano5. Ainda há uma grande necessidade de estabelecer relações causais e identificar os determinantes moleculares do impacto do microbioma, embora o progresso tenha sido prejudicado pelas complexidades do microbioma e pela tratabilidade dos sistemas hospedeiros para triagem em larga escala.
O organismo modelo C. elegans fornece uma plataforma para avançar a compreensão molecular das ligações entre o microbioma e a fisiologia do hospedeiro. C. elegans possui 20 células intestinais com camada mucosa e estruturas vilosidades. Essas células são equipadas com abundantes genes quimiorreceptores que detectam produtos microbianos e produzem moléculas antimicrobianas que potencialmente regulam seus colonizadores intestinais 6,7. Essa biologia conservada de C. elegans levou a um grande número de descobertas na sinalização do hospedeiro que regula micróbios intestinais, incluindo sinalização de insulina, TGF-beta e MAP quinase 8,9,10.
C. elegans utilizam micróbios como sua dieta para o crescimento durante o desenvolvimento e microbioma como adultos. Com a velhice, alguns micróbios podem se acumular em excesso no lúmen intestinal e a relação hospedeiro-micróbio muda da simbiose para a patogênese11. Em seus habitats naturais, C. elegans encontra uma grande variedade de espécies bacterianas12,13. O sequenciamento do 16S rDNA a partir de amostras representativas coletadas em habitats naturais (frutos podres, caule de plantas e vetores animais) revelou que o microbioma natural de C. elegans é dominado por quatro filos bacterianos: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes e Actinobacteria. Dentro dessas divisões encontra-se grande variação na diversidade e riqueza de bactérias com base no habitat12,13,14,15. Várias comunidades definidas foram estabelecidas, incluindo as coleções de 63 membros (BIGbiome)16 e 12 membros (CeMbio) representando os principais gêneros de microbioma criados para a comunidade de pesquisa de C. elegans 17. Tanto os microbiomas quanto as linhagens componentes podem ter um impacto diverso na fisiologia de C. elegans, como tamanho corporal, taxas de crescimento e respostas ao estresse 9,16,17. Esses estudos fornecem recursos e exemplos para estabelecer C. elegans como um modelo para a pesquisa do microbioma.
Aqui é apresentado um fluxo de trabalho baseado em grandes classificadores de partículas (LPS) (Figura 1) que utiliza o sistema C. elegans para medir simultaneamente a composição do microbioma e medidas básicas da fisiologia do hospedeiro em escala populacional. Do lado microbiano, o fluxo de trabalho é adaptável para montar um microbioma definido ou micróbios únicos para testar a robustez e plasticidade da comunidade com interações microbianas crescentes. Do lado do hospedeiro, o fluxo de trabalho permite ensaios de alto rendimento para medir os níveis de colonização de micróbios fluorescentes no microbioma e leitura fisiológica do hospedeiro em termos de desenvolvimento, tamanho do corpo e reprodução. Em conjunto, o modelo do microbioma de C. elegans permite que telas de alto rendimento identifiquem os determinantes metabólicos e genéticos que modulam a fisiologia do hospedeiro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (1 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-11-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (2 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Costar plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Standard bacteriology agar is also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating manifold</td>
			<td>V&#38;P scientific</td>
			<td>VP1171A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Bacterial OD measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>For 96 well plate and conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.</td>
			<td>R package</td>
			<td>Version 3.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Autosampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Sorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066</td>
			<td>Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
			<td>RPI</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>GNU</td>
			<td>Version 1.3.1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome

A composição do microbioma intestinal pode ter um impacto dramático na fisiologia do hospedeiro ao longo do desenvolvimento e da vida do animal. Medir as mudanças composicionais no microbioma é crucial para identificar as relações funcionais entre essas mudanças fisiológicas. Caenorhabditis elegans emergiu como um poderoso sistema hospedeiro para examinar os drivers moleculares das interações hospedeiro-microbioma. Com seu plano corporal transparente e micróbios naturais marcados com fluorescência, os níveis relativos de micróbios dentro do microbioma intestinal de um animal de C. elegans individual podem ser facilmente quantificados usando um grande classificador de partículas. Aqui descrevemos os procedimentos para o arranjo experimental de um microbioma, coleta e análise de populações de C. elegans no estágio de vida desejado, operação e manutenção do classificador, e análises estatísticas dos conjuntos de dados resultantes. Também discutimos considerações para otimizar as configurações de classificação com base nos micróbios de interesse, o desenvolvimento de estratégias de confinamento eficazes para os estágios de vida de C. elegans e como utilizar as capacidades de classificação para enriquecer as populações animais com base na composição do microbioma intestinal. Exemplos de aplicações potenciais serão apresentados como parte do protocolo, incluindo o potencial de escalabilidade para aplicativos de alto rendimento.

Definição de portões populacionais de adultos e larvas Aqui, C. elegans L1s sincronizados foram cultivados em uma placa NGM semeada com E. coli OP50 (Eco), uma dieta padrão de laboratório. Populações de C. elegans foram coletadas para análise de LPS após 96 h ou 120 h de crescimento a 20 °C (Figura 2A). Um gráfico de pontos de extinção (EXT, um proxy de densidade corporal) versus tempo de voo (TOF, um proxy de comprimento do corpo) ...

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Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para examinar os determinantes moleculares que conduzem as interações hospedeiro-microbioma. Apresentamos um pipeline de alto rendimento traçando o perfil dos níveis de colonização do microbioma intestinal em um único animal, juntamente com os principais aspectos da fisiologia de C. elegans.

Aplicação da Vermimetria de Fluxo na Quantificação e Análise do Microbioma Intestinal de Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

O microbioma intestinal desempenha papéis importantes na formação da fisiologia do hospedeiro. Este protocolo, em particular, permite a avaliação de alto rendimento dos níveis de colonização por micróbios intestinais fluorescentes em animais celulares únicos em larga escala. Um grande benefício desse método é a capacidade de monitorar o microbioma intestinal de animais vivos em tempo real, o que permite a identificação e correlação de quaisquer alterações com a fisiologia do hospedeiro.Quem demonstrará o procedimento será Dana Blackburn, pesquisadora associada do meu laboratório. Comece lavando os vermes do gramado bacteriano com um a dois mililitros de M9-TX. Transfira os vermes para uma placa esterilizada de dois mililitros 96 bem profunda.Pelotá-los a 300 G por um minuto e remover o líquido usando um coletor de aspiração. Usando uma pipeta multicanal de 1,2 mililitros, adicione 1,8 mililitros de M9-TX a cada poço da placa do poço profundo misturado por pipetagem algumas vezes e centrifugação a 300 G por um minuto. Após a lavagem final, leve o volume em cada poço para 100 microlitros, utilizando o coletor aspirador.Adicione 100 microlitros de levamisol de 10 milimolares e M9-T a cada poço e deixe os vermes paralisarem por cinco minutos. Em seguida, adicione solução de água sanitária a 4% em cada poço por dois minutos para reduzir os aglomerados bacterianos. Após o tratamento com água sanitária, adicione M9-TX em cada poço da placa para lavar as minhocas.Centrifugar a placa e aspirar até um volume final de 100 microlitros após a segunda lavagem. Transfira os vermes para uma placa de fundo plano de 96 poços, contendo 150 microlitros de 10 milimoles de levamisol e M9-TX. Mantenha a densidade de vermes em 50 a 100 vermes por poço e divida os vermes em vários poços se a população estiver muito lotada.Ligue o compressor de ar, o computador e o instrumento LPS. Verifique e esvazie o tanque de resíduos. Verifique e reabasteça bainha e caixas d'água se o volume estiver baixo.Verifique se o conjunto de núcleo fluídico e óptico de 250 micrômetros está no lugar. Conecte e ative o amostrador automático. Abra o software do instrumento do amostrador automático para abrir o amostrador automático e o software LPS.Na janela do software LPS, vá para o arquivo e clique em novo experimento, selecione o arquivo novamente e clique em nova verificação de amostra. Permita que os lasers liguem lasers de 488 e 561 nanômetros, se isso ainda não tiver sido feito. Agora crie modelos para gráficos de pontos de aquisição, usando tempo de voo, extinção e canais fluorescentes na janela do software LPS.Clique com o botão direito do mouse no corpo de um gráfico para modificar o dimensionamento. Em seguida, carregue as amostras de controle. Na janela do amostrador automático, selecione prime, vá para o arquivo, clique em abrir script para selecionar o script interno correto e clique em OK.Vá para o modelo de placa no menu do software amostrador para selecionar os poços desejados para análise. Depois de carregar e fixar a placa no estágio do amostrador automático, pressione a placa de execução na janela do amostrador automático e salve o arquivo quando solicitado, clique no botão armazenar dados atuais na faixa de opções superior na janela do software LPS e salve os dados novamente. Abra o software LPS.Navegue até o arquivo e selecione novo experimento, depois volte para o arquivo e clique em novo exemplo. Crie um gráfico de pontos com o tempo de voo no eixo X e extinção no eixo Y. Crie outro gráfico de pontos com o tempo de voo no eixo X e vermelho no eixo Y.Certifique-se de verificar se os lasers ativam os lasers de 488 e 561 nanômetros. Posicione o tubo de amostra de controle na porta de amostra e, em seguida, clique em adquirir dentro da caixa de diálogo adquirir e dispensar. Quando solicitado, certifique-se de salvar o arquivo.Uma vez que vermes suficientes tenham sido medidos para diferenciar populações, selecione abortar no gráfico de pontos mostrando o tempo de voo versus extinção. Desenhe um portão ao redor da área representando a população adulta. Em seguida, navegue até a exibição, clique em hierarquia de limite e verifique se os portões fluorescentes estão listados corretamente sob o portão da população adulta.No tempo de voo versus gráfico de pontos vermelhos, crie portões ao redor das áreas de alto e baixo valor vermelho para destacar as regiões de interesse que mostram a colonização do microbioma em vermes adultos. Depois que as configurações forem otimizadas, vá para o arquivo e clique em salvar experimento, clique em arquivo e selecione salvar amostra. Para carregar o aparelho de coleta, selecione a placa de carga A para permitir que a etapa de coleta se mova para uma posição preparada para carregar um tubo de coleta ou uma placa de 96 poços.Para dispensar uma placa de 96 poços, vá para a seção de configuração e selecione as placas, depois clique em placas calibradas e escolha a placa de 96 poços. Em seguida, selecione os poços para os quais os vermes serão classificados e insira o número de objetos a serem classificados em cada poço. Certifique-se de especificar as regiões fechadas de interesse também.Se houver várias regiões fechadas sendo classificadas na mesma placa, certifique-se de marcar a caixa marcada portão cada poço. Clique em OK para salvar as alterações. Depois de classificar os números e atribuir os locais, carregue a amostra na porta de amostra e clique nos botões da placa de enchimento da caixa de diálogo de aquisição e distribuição para iniciar a distribuição em uma placa de 96 poços.Maiores valores de extensão e tempo de voo são observados em adultos em comparação com larvas. Progênies de adultos de dois dias de idade foram dominadas pelos estágios L1 e L2, enquanto a maioria das progênies de adultos de três dias de idade atingiu os estágios L3 e L4. Quando cultivada em E.coli, os valores de tempo de voo e extensão aumentaram no terceiro dia em comparação com o segundo dia.Quando cultivados em ochrobactrum, BH três e culturas mistas, cenor abdidas allegands mostrou diferenças nos valores de tempo de voo e extensão. Maior colonização pelo ochrobactrum BH3 foi observada na condição mista do que no ochrobactrum BH3 isoladamente. Em contraste, os valores de verde fluorescente indicaram menor colonização OP50 na condição mista do que na OP50 isoladamente.Os vermes são fortemente inclinados em direção ao eixo Y, sugerindo que a colonização por OP50 é baixa na maioria dos vermes, enquanto os níveis de colonização por ochrobactrum, BH3 estão uniformemente distribuídos na população. A relação entre o ocrobactrum, os níveis de colonização BH3 e o desenvolvimento do hospedeiro, como densidade corporal e as diferenças nos padrões de reprodução, também foi observada. Os adultos de três dias de idade cultivados na mistura de dois membros, microbioma exibiram uma ampla gama de intensidade de RFP, indicando variações individuais na colonização de ochrobactrum dentro do grupo.Imagens de RFP dos poços contendo 15 vermes classificados e individuais de portas RFP altas e baixas são mostradas. O mais importante é lembrar de usar controles apropriados para todas as etapas para garantir que o protocolo e a máquina estejam funcionando corretamente. Em tempo real, animais com características específicas podem ser usados para isolar cepas de pools de hospedeiros ou mutantes microbianos para identificar genes que regulam interações pós-micróbios.Animais isolados também podem ser usados para análises fenotípicas baseadas em pool único ou enriquecido a jusante, como RNA-seq ou similares. Realmente, as oportunidades são realmente infinitas.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

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Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em 96 placas de microtitulação Bem

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Biologia

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

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Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

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