Name: application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами NIH DP2DK116645 (для B.S.S.), Dunn Foundation Pilot Award и грантом NASA 80NSSC22K0250 (для B.S.S.). Этот проект также был поддержан Центром цитометрии и сортировки клеток в Медицинском колледже Бэйлора при финансировании со стороны CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 и RR024574) и помощи Джоэла М. Седерстрома, а также гранта на инструментарий для гранта LPS NIH (S10 OD025251). Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется Управлением программ исследовательской инфраструктуры NIH (P40 OD010440).

1. Приготовление смеси микробиома
<ol><li>Выдавите или выдавите бактерии из глицериновой морозильной камеры на тарелку для лизогенного бульона (LB) или соответствующую питательную среду и выращивайте в течение ночи при оптимальной температуре в зависимости от интересующих штам?...

<ol>
	<li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+in+a+bacterial+world,+a+new+imperative+for+the+life+sciences.">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li><li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut.">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li><li>B&#228;ckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage.">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome.">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans.">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li><li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Team+R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li><li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> tidyverse. , (2019).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome.">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages.">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877 (2018).</li><li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ.">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids.">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li><li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIP-MAP:+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes.">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li></ol>

В нескольких исследованиях для характеристики генов и путей C. elegans против колонизации и токсичности патогенов использовалась проточная вермиметрия21,22. Здесь представлен высокопроизводительный подход, который использует C. elegans для изучения то...

Эволюция животных находится под постоянным микробным влиянием1. Из разнообразных микробов в окружающей среде животные-хозяева приобретают специфическихпартнеров2 , которые расширяют возможности хозяина и управляют его физиологией и восприимчивостью к болезням3. Например, метагеномный анализ микробиома кишечника выявил обогащенные метаболические классы микробных генов, которые могут обеспечить больший сбор и хранение энергии у мышей с ожирением4, многие из которых также обнаружены в микробиоме кишечника человека5. По-прежнему существует большая потребность в установлении причинно-следственных связей и определении молекулярных детерминант воздействия на микробиом, хотя прогресс затруднен из-за сложности микробиома и восприимчивости систем хозяев к широкомасштабному скринингу.
Модельный организм C. elegans обеспечивает платформу для углубления молекулярного понимания связей между микробиомом и физиологией хозяина. C. elegans обладает 20 клетками кишечника со слоем слизистой оболочки и ворсинчатыми структурами. Эти клетки оснащены многочисленными генами хеморецепторов, которые воспринимают микробные продукты и вырабатывают антимикробные молекулы, которые потенциально регулируют их кишечные колонизаторы. Эта консервативная биология C. elegans привела к огромному количеству открытий в области передачи сигналов хозяина, которые регулируют кишечные микробы, включая передачу сигналов инсулина, TGF-бета и MAP-киназу 8,9,10.
C. elegans используют микробы как пищу для роста во время развития и микробиом во взрослом возрасте. С возрастом некоторые микробы могут чрезмерно накапливаться в просвете кишечника, и отношения между хозяином и микробом смещаются от симбиоза к патогенезу11. В естественной среде обитания C. elegans встречает широкий спектр видов бактерий12,13. Секвенирование 16S рДНК из репрезентативных образцов, собранных в естественной среде обитания (гнилые плоды, стебли растений и животные переносчики), показало, что в природном микробиоме C. elegans доминируют четыре типа бактерий: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes и Actinobacteria. В пределах этих подразделений лежит большая вариативность в разнообразии и богатстве бактерий в зависимости от среды обитания12,13,14,15. Было создано несколько определенных сообществ, в том числе коллекции из 63 членов (BIGbiome)16 и 12 членов (CeMbio), представляющие ведущие роды микробиома, созданные для исследовательского сообщества C. elegans 17. Как микробиомы, так и компонентные штаммы могут оказывать различное влияние на физиологию C. elegans, например, на размер тела, скорость роста и реакцию на стресс 9,16,17. Эти исследования предоставляют ресурсы и примеры, позволяющие установить C. elegans в качестве модели для исследования микробиома.
Здесь представлен рабочий процесс, основанный на сортировщике больших частиц (LPS) (рис. 1), который использует систему C. elegans для одновременного измерения состава микробиома и основных показателей физиологии хозяина в масштабе популяции. С микробной стороны рабочий процесс адаптируется для сборки определенного микробиома или отдельных микробов для проверки надежности и пластичности сообщества с увеличением микробных взаимодействий. На стороне хозяина рабочий процесс позволяет проводить высокопроизводительные анализы для измерения уровней колонизации флуоресцентных микробов в микробиоме и физиологического считывания хозяина с точки зрения развития, размера тела и размножения. В совокупности модель микробиома C. elegans позволяет проводить высокопроизводительные скрининги для выявления метаболических и генетических детерминант, модулирующих физиологию хозяина.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (1 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-11-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (2 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Costar plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Standard bacteriology agar is also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating manifold</td>
			<td>V&#38;P scientific</td>
			<td>VP1171A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Bacterial OD measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>For 96 well plate and conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.</td>
			<td>R package</td>
			<td>Version 3.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Autosampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Sorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066</td>
			<td>Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
			<td>RPI</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>GNU</td>
			<td>Version 1.3.1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome

Состав микробиома кишечника может оказывать существенное влияние на физиологию хозяина на протяжении всего развития и жизни животного. Измерение изменений состава микробиома имеет решающее значение для выявления функциональных взаимосвязей между этими физиологическими изменениями. Caenorhabditis elegans стал мощной системой хозяина для изучения молекулярных факторов взаимодействия микробиома хозяина. Благодаря прозрачному строению тела и флуоресцентным меткам естественных микробов, относительные уровни микробов в микробиоме кишечника отдельного животного C. elegans могут быть легко количественно определены с помощью большого сортировщика частиц. В этой статье мы опишем процедуры экспериментальной настройки микробиома, сбора и анализа популяций C. elegans на желаемой стадии жизни, эксплуатации и обслуживания сортировщика, а также статистического анализа полученных наборов данных. Мы также обсудим соображения по оптимизации настроек сортировщика на основе интересующих микробов, разработку эффективных стратегий стробирования для этапов жизни C. elegans и то, как использовать возможности сортировщика для обогащения популяций животных на основе состава микробиома кишечника. В рамках протокола будут представлены примеры потенциальных приложений, в том числе потенциал масштабируемости для приложений с высокой пропускной способностью.

Определение ворот популяции взрослых особей и личинок Здесь синхронизированные C. elegans L1 выращивали на планшете NGM, засеянном E. coli OP50 (Eco), стандартной лабораторной диетой. Популяции C. elegans собирали для анализа ЛПС через 96 ч или 120 ч роста при 20 °C (рис. 2А</...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans является мощной моделью для изучения молекулярных детерминант, управляющих взаимодействием между хозяином и микробиомом. Мы представляем высокопроизводительный конвейер, профилирующий уровни колонизации микробиома кишечника у отдельных животных, а также ключевые аспекты физиологии C. elegans.

Применение проточной вермиметрии для количественной оценки и анализа микробиома кишечника Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

Микробиом кишечника играет важную роль в формировании физиологии хозяина. Этот протокол, в частности, позволяет с высокой пропускной способностью оценивать уровни колонизации флуоресцентных кишечных микробов у одиночных клеточных животных в больших масштабах. Одним из основных преимуществ этого метода является возможность мониторинга микробиома кишечника живых животных в режиме реального времени, что позволяет идентифицировать и соотносить любые изменения с физиологией хозяина.Процедуру будет демонстрировать Дана Блэкберн, научный сотрудник моей лаборатории. Начните с смывания червей с бактериального газона одним-двумя миллилитрами M9-TX. Переложите червей в стерилизованную двухмиллилитровую тарелку глубиной 96 лунок.Гранулируйте их при 300 G в течение одной минуты и удалите жидкость с помощью аспирационного коллектора. Используя многоканальную пипетку объемом 1,2 миллилитра, добавьте 1,8 миллилитра M9-TX в каждую лунку глубокой лунки, перемешайте пипеткой пару раз и центрифугируйте при 300 G в течение одной минуты. После окончательной промывки доведите объем в каждой лунке до 100 микролитров, используя аспирационный коллектор.Добавьте в каждую лунку по 100 микролитров 10 миллимолярного левамизола и М9-Т и дайте червям парализоваться в течение пяти минут. Затем добавьте 4%-ный раствор отбеливателя в каждую лунку на две минуты, чтобы уменьшить скопление бактерий. После обработки отбеливателем добавьте M9-TX в каждое углубление пластины, чтобы промыть червей.Центрифугируйте пластину и аспирируйте до конечного объема 100 микролитров после второй промывки. Переложите червей на плоскодонную 96-луночную пластину, содержащую 150 микролитров 10 миллимоль левамизола и M9-TX. Поддерживайте плотность червей на уровне от 50 до 100 червей на лунку и разделяйте червей на несколько лунок, если популяция слишком скучена.Включите воздушный компрессор, компьютер и прибор LPS. Проверьте и опорожните бак для отходов. Проверьте и заправьте чехол и резервуары для воды, если объем недостаточен.Убедитесь, что 250-микрометровый жидкостный и оптический сердечник на месте. Подключите и включите автосамплер. Откройте программное обеспечение автосамплера, чтобы открыть автосамплер и программное обеспечение LPS.В окне программного обеспечения LPS перейдите в файл и нажмите кнопку «Новый эксперимент», затем снова выберите файл и нажмите кнопку «Новая проверка образца». Включите лазеры с длиной волны 488 и 561 нм, если это еще не сделано. Теперь создайте шаблоны для точечных диаграмм захвата, используя каналы времени пролета, экстинкции и флуоресцентные каналы в окне программного обеспечения LPS.Щелкните правой кнопкой мыши в теле диаграммы, чтобы изменить масштабирование. Далее загружают контрольные образцы. В окне автосамплера выбираем prime, переходим к файлу, нажимаем открыть скрипт, чтобы выбрать нужный встроенный скрипт и нажимаем ОК.Перейдите к шаблону пластины в меню программного обеспечения пробоотборника, чтобы выбрать нужные лунки для анализа. После загрузки и закрепления пластины на столике автосамплера нажмите кнопку запуска пластины в окне автосамплера и сохраните файл при появлении запроса, затем нажмите кнопку сохранения текущих данных на верхней ленте в окне программного обеспечения LPS и снова сохраните данные. Откройте программное обеспечение LPS.Перейдите к файлу и выберите новый эксперимент, затем вернитесь к файлу и нажмите кнопку Создать образец. Постройте точечную диаграмму со временем пролета по оси X и затуханием по оси Y. Создайте еще одну точечную диаграмму со временем полета на оси X и красным цветом на оси Y.Обязательно установите флажок включения лазеров для активации лазеров 488 и 561 нм. Поместите пробирку с контрольным образцом на отверстие для отбора проб, затем нажмите кнопку «Получить» в диалоговом окне «Получение и дозирование». При появлении запроса обязательно сохраните файл.После того, как будет измерено достаточное количество червей для дифференциации популяций, выберите abort на точечной диаграмме, показывающей время полета и вымирания. Нарисуйте ворота вокруг области, представляющей взрослое население. Затем перейдите к просмотру, щелкните иерархию стробирования и убедитесь, что флуоресцентные вентили правильно перечислены под гейтом взрослой популяции.На графике «Время полета и красная точка» создайте ворота вокруг областей с высоким и низким значением красного цвета, чтобы выделить интересующие области, показывающие колонизацию микробиома у взрослых червей. После оптимизации настроек перейдите к файлу и нажмите кнопку Сохранить эксперимент, затем нажмите кнопку Файл и выберите Сохранить образец. Чтобы загрузить сборное устройство, выберите загрузочную пластину A, чтобы позволить ступени сбора переместиться в положение, подготовленное для загрузки либо сборной трубы, либо 96-луночной пластины.Для дозирования на 96-луночный планшет перейдите в раздел настройки и выберите пластины, затем нажмите на калиброванные планшеты и выберите 96-луночный планшет. Далее выбираем лунки, в которые будут сортироваться черви, и вводим количество объектов, которые нужно отсортировать в каждую лунку. Не забудьте также указать интересующие вас закрытые регионы.Если в одну и ту же пластину сортировано несколько закрытых областей, обязательно установите флажок с надписью «Затвор» в каждом колодце. Нажмите кнопку ОК, чтобы сохранить изменения. После сортировки номеров и назначения местоположений загрузите пробу в отверстие для отбора проб и нажмите кнопки заполнения пластины в диалоговом окне получения и дозирования, чтобы начать дозирование в планшет на 96 лунок.Более высокие значения удлинения и времени лёта наблюдаются у взрослых особей по сравнению с личинками. У потомства от двухдневных взрослых особей преобладали стадии L1 и L2, в то время как большинство потомства от трехдневных взрослых достигли стадий L3 и L4. При выращивании на E.coli время полета и удлинение увеличивались на третий день по сравнению со вторым.При выращивании на охробактруме, BH 3 и смешанных культурах cenor abdidas allegands показали различия во времени полета и значениях удлинения. Повышенная колонизация ochrobactrum BH3 наблюдалась в смешанном состоянии, чем при использовании только ochrobactrum BH3. Напротив, зеленые флуоресцентные значения указывали на более низкую колонизацию OP50 в смешанном состоянии, чем только в OP50.Черви сильно перекошены к оси Y, что позволяет предположить, что колонизация OP50 у большинства червей низкая, в то время как уровни колонизации ochrobactrum, BH3 равномерно распределены в популяции. Также наблюдалась взаимосвязь между охробактрумом, уровнями колонизации BH3 и развитием хозяина, таким как плотность тела и различия в моделях размножения. У трехдневных взрослых особей, выращенных на смеси из двух членов, микробиом демонстрировал широкий диапазон интенсивности RFP, что указывает на индивидуальные различия в колонизации охробактрума в группе.Показаны RFP-изображения скважин, содержащих 15 отсортированных и отдельных шнеков из верхних и низких затворов RFP. Самое главное — не забывать использовать соответствующие элементы управления для всех шагов, чтобы убедиться, что протокол и машина работают правильно. В режиме реального времени животные со специфическими особенностями могут быть использованы для выделения штаммов из пулов хозяев или микробных мутантов для выявления генов, которые регулируют постмикробные взаимодействия.Изолированные животные также могут быть использованы для анализа одного животного или обогащенного фенотипического пула на основе последующих потоков, таких как РНК-секвенирование и т.. Действительно, возможности поистине безграничны.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Добыча простагландинов и анализа в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Выращивание<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В трех измерениях в лаборатории

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Количественное определение липидного изобилия и оценки распределения липидов в Caenorhabditis elegans Нила красный и нефти красный O пятнать

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Очищение и анализ Caenorhabditis elegans Внеклеточные Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Использование Caenorhabditis elegans для скрининга тканеспецифических взаимодействий шаперонов

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Автоматизация количественной оценки агрегатов в Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Выделение и характеристика естественной микробиоты модельной нематоды Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Микроскопия со сверхвысоким разрешением синаптонемального комплекса в зародышевой линии Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...