Name: application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH-anslag DP2DK116645 (till B.S.S.), Dunn Foundation pilot award och NASA-anslag 80NSSC22K0250 (till B.S.S.). Detta projekt stöddes också av Cytometry and Cell Sorting Core vid Baylor College of Medicine med finansiering från CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 och RR024574) och assistans av Joel M. Sederstrom, plus ett instrumenteringsbidrag för LPS NIH-anslaget (S10 OD025251). Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

1. Beredning av mikrobiomblandning
<ol><li>Stämpla eller strö ut bakterier från en glycerolfrysbuljong på en lysogenibuljong (LB) eller lämpligt odlingsmedium och odla över natten vid en optimal temperatur baserat på bakteriestammar av intresse (vanligtvis 25 °C för naturliga mikrober av C. elegans ).</li>
	<li>Från LB-plattan, använd en enda koloni från varje bakterieisolat (t.ex. 12 bakterier från CeMbio-samlingen) för att inokulera 800 μL LB-medium i separata brunnar på en 1...

<ol>
	<li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+in+a+bacterial+world,+a+new+imperative+for+the+life+sciences.">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li><li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut.">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li><li>B&#228;ckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage.">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome.">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans.">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li><li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Team+R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li><li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> tidyverse. , (2019).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome.">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages.">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877 (2018).</li><li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ.">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids.">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li><li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIP-MAP:+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes.">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li></ol>

Flödesvermimetri har använts för att karakterisera C. elegans-gener och vägar mot patogenkolonisering och toxicitet i flera studier21,22. Här presenteras ett tillvägagångssätt som använder C. elegans för att undersöka hur tarmmikrobiom modulerar sin värdfysiologi. Jämfört med befintliga metoder som använder kolonibildande enheter (CFU) eller 16S rRNA-amplikonsekvensering 9,16,17,23,24<sup class=...

Djurens evolution är under konstant mikrobiell påverkan1. Från olika mikrober i miljön får djurvärdar specifika partners2 som utökar värdens kapacitet och driver dess fysiologi och mottaglighet för sjukdomar3. Till exempel avslöjade metagenomiska analyser av tarmmikrobiomet berikade metaboliska klasser av mikrobiella gener som kan ge större energiskörd och lagring hos överviktiga möss4, av vilka många också finns i människans tarmmikrobiom5. Det finns fortfarande ett stort behov av att fastställa orsakssamband och fastställa de molekylära bestämningsfaktorerna för mikrobiomets påverkan, även om framstegen har hämmats av mikrobiomkomplexiteten och hanterbarheten hos värdsystem för storskalig screening.
Modellorganismen C. elegans utgör en plattform för att främja molekylär förståelse av kopplingar mellan mikrobiom och värdfysiologi. C. elegans har 20 tarmceller med ett slemhinneskikt och villistrukturer. Dessa celler är utrustade med rikligt med kemoreceptorgener som känner av mikrobiella produkter och producerar antimikrobiella molekyler som potentiellt reglerar deras tarmkolonisatörer 6,7. Denna bevarade biologi av C. elegans har lett till ett enormt antal upptäckter inom värdsignalering som reglerar tarmmikrober, inklusive insulinsignalering, TGF-beta och MAP-kinas 8,9,10.
C. elegans använder mikrober som både sin diet för tillväxt under utvecklingen och mikrobiom som vuxna. Med hög ålder kan vissa mikrober överackumuleras i tarmlumen och förhållandet mellan värd och mikrob skiftar från symbios till patogenes11. I sina naturliga livsmiljöer stöter C. elegans på ett brett spektrum av bakteriearter12,13. Sekvensering av 16S rDNA från representativa prover som samlats in i naturliga livsmiljöer (ruttna frukter, växtstam och djurvektorer) avslöjade att det naturliga mikrobiomet hos C. elegans domineras av fyra bakteriella fyla: Proteobakterier, Bacteroidetes, Firmicutes och Actinobacteria. Inom dessa indelningar ligger stor variation i mångfalden och rikedomen av bakterier baserat på livsmiljön12,13,14,15. Flera definierade samhällen har etablerats, inklusive samlingarna med 63 medlemmar (BIGbiome)16 och 12 medlemmar (CeMbio) som representerar de bästa mikrobiomsläktena som skapats för C. elegans-forskarsamhället 17. Både mikrobiom och komponentstammar kan ha en varierad inverkan på fysiologin hos C. elegans såsom kroppsstorlek, tillväxthastighet och stressreaktioner 9,16,17. Dessa studier ger resurser och exempel för att etablera C. elegans som en modell för mikrobiomforskning.
Här presenteras ett stort partikelsorterarbaserat arbetsflöde (Figur 1) (Figur 1) som använder C. elegans-systemet för att samtidigt mäta mikrobiomsammansättning och grundläggande mått på värdfysiologi på populationsskala. Från den mikrobiella sidan är arbetsflödet anpassningsbart för att sätta ihop ett definierat mikrobiom eller enskilda mikrober för att testa robustheten och plasticiteten i samhället med ökande mikrobiella interaktioner. Från värdsidan möjliggör arbetsflödet analyser med hög genomströmning för att mäta koloniseringsnivåer av fluorescerande mikrober i mikrobiomet och värdens fysiologiska avläsning när det gäller utveckling, kroppsstorlek och reproduktion. Sammantaget möjliggör mikrobiommodellen för C. elegans skärmar med hög genomströmning för att lokalisera de metaboliska och genetiska determinanter som modulerar värdfysiologin.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (1 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-11-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (2 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Costar plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Standard bacteriology agar is also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating manifold</td>
			<td>V&#38;P scientific</td>
			<td>VP1171A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Bacterial OD measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>For 96 well plate and conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.</td>
			<td>R package</td>
			<td>Version 3.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Autosampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Sorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066</td>
			<td>Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
			<td>RPI</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>GNU</td>
			<td>Version 1.3.1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome

Sammansättningen av tarmmikrobiomet kan ha en dramatisk inverkan på värdens fysiologi under djurets utveckling och liv. Att mäta sammansättningsförändringar i mikrobiomet är avgörande för att identifiera de funktionella sambanden mellan dessa fysiologiska förändringar. Caenorhabditis elegans har dykt upp som ett kraftfullt värdsystem för att undersöka de molekylära drivkrafterna för värd-mikrobiominteraktioner. Med sin transparenta kroppsplan och fluorescerande märkta naturliga mikrober kan de relativa nivåerna av mikrober i tarmmikrobiomet hos ett enskilt C. elegans-djur enkelt kvantifieras med hjälp av en stor partikelsorterare. Här beskriver vi procedurerna för experimentell uppställning av ett mikrobiom, insamling och analys av C . elegans-populationer i önskat livsstadium, drift och underhåll av sorteraren och statistiska analyser av de resulterande datauppsättningarna. Vi diskuterar också överväganden för att optimera sorteringsinställningar baserat på de mikrober som är av intresse, utvecklingen av effektiva grindstrategier för C. elegans livsstadier och hur man kan utnyttja sorteringsfunktioner för att berika djurpopulationer baserat på tarmmikrobiomsammansättning. Exempel på potentiella tillämpningar kommer att presenteras som en del av protokollet, inklusive potentialen för skalbarhet till applikationer med hög genomströmning.

Definition av populationsportar för vuxna och larver Här odlades synkroniserade C. elegans L1 på en NGM-platta sådd med E. coli OP50 (Eco), en standarddiet för laboratorier. C. elegans-populationer samlades in för LPS-analys efter 96 eller 120 timmars tillväxt vid 20 °C (figur 2A). Ett punktdiagram över utdöende (EXT, en proxy för kroppstäthet) kontra time-of-flight (TOF, en proxy för kroppslängd) skapar två visuellt separerade mo...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans är en kraftfull modell för att undersöka de molekylära determinanter som driver värd-mikrobiominteraktioner. Vi presenterar en pipeline med hög genomströmning som profilerar de enskilda djurnivåerna av tarmmikrobiomkolonisering tillsammans med viktiga aspekter av C. elegans-fysiologin.

Tillämpning av flödesvermimetri för kvantifiering och analys av Caenorhabditis elegans tarmmikrobiom

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

Tarmmikrobiomet spelar en viktig roll för att forma värdens fysiologi. Detta protokoll, i synnerhet, möjliggör hög genomströmning av fluorescerande tarmmikrobkoloniseringsnivåer hos enstaka, cellulära djur i stor skala. En stor fördel med denna metod är möjligheten att övervaka tarmmikrobiomet hos levande djur i realtid, vilket gör det möjligt att identifiera och korrelera eventuella förändringar med värdens fysiologi.Dana Blackburn, en forskningsassistent från mitt laboratorium, kommer att demonstrera proceduren. Börja med att tvätta bort maskarna från bakteriegräsmattan med en till två milliliter M9-TX. Överför maskarna till en steriliserad två milliliter 96 brunnar djup platta.Pelletera dem med 300 G i en minut och ta bort vätskan med ett sugrör. Använd en 1.2 ml flerkanalspipett, tillsätt 1.8 milliliter M9-TX till varje brunn på djupbrunnsplattan blandad genom pipettering ett par gånger och centrifugera vid 300 G i en minut. Efter den sista tvätten, höj volymen i varje brunn till 100 mikroliter med hjälp av suggrenröret.Tillsätt 100 mikroliter 10 millimolar levamisol och M9-T i varje brunn och låt maskarna förlamas i fem minuter. Tillsätt sedan 4 % blekmedelslösning i varje brunn i två minuter för att minska bakterieklumpar. Efter blekmedelsbehandlingen, tillsätt M9-TX i varje brunn på plattan för att tvätta maskarna.Centrifugera plattan och aspirera till en slutlig volym på 100 mikroliter efter den andra tvätten. Överför maskarna till en plattbottnad 96-brunnsplatta, innehållande 150 mikroliter 10 millimol levamisol och M9-TX. Håll masktätheten på 50 till 100 maskar per brunn och dela upp maskarna i flera brunnar om populationen är för trång.Slå på luftkompressorn, datorn och LPS-instrumentet. Kontrollera och töm avfallstanken. Kontrollera och fyll på mantel och vattentankar om volymen är låg.Se till att 250 mikrometers fluidisk och optisk kärnenhet är på plats. Anslut och slå på autosamplern. Öppna instrumentprogramvaran för autosampler för att öppna autosamplern och LPS-programvaran.I LPS-programvarufönstret går du till arkiv och klickar på nytt experiment, väljer sedan fil igen och klickar på ny provkontroll. Gör det möjligt för lasrar att slå på 488 och 561 nanometer lasrar om det inte redan har gjorts. Skapa nu mallar för punktdiagram för förvärv med hjälp av flygtid, utsläckning och fluorescerande kanaler i LPS-programvarufönstret.Högerklicka i brödtexten i ett diagram för att ändra skalningen. Läs sedan in kontrollproverna. I autosampler-fönstret väljer du prime, går till fil, klickar på öppna skript för att välja rätt inbyggt skript och klickar på OK.Gå till plattmallen på sampler-programvarumenyn för att välja önskade brunnar för analys. Efter att ha laddat och fäst plattan på autosampler-stage, tryck på körplattan i autosampler-fönstret och spara file när du uppmanas, klicka sedan på lagra aktuella data knappen på det övre bandet i LPS-programvarufönstret och spara data igen. Öppna LPS-programvaran.Navigera till fil och välj nytt experiment, gå sedan tillbaka till filen och klicka på nytt exempel. Skapa ett punktdiagram med flygtiden på X-axeln och utsläckning på Y-axeln. Skapa ett annat punktdiagram med flygtiden på X-axeln och röd på Y-axeln.Se till att kontrollera aktivera lasrar för att aktivera 488- och 561-nanometerslasrarna. Placera kontrollprovröret på provporten och klicka sedan på hämta i dialogrutan förvärva och dispensera. Se till att spara filen när du uppmanas till det.När tillräckligt många maskar har uppmätts för att skilja populationerna åt, välj abort i punktdiagrammet som visar tiden för flygning kontra utdöende. Rita en grind runt området som representerar den vuxna befolkningen. Navigera sedan till vyn, klicka på grindhierarki och kontrollera att de fluorescerande grindarna är korrekt listade under grinden för vuxna populationer.I flygtiden kontra rödpunktsdiagrammet, skapa grindar runt de områden med högt och lågt rödvärde för att markera de intressanta regionerna som visar mikrobiomkolonisering hos vuxna maskar. När inställningarna har optimerats går du vidare till filen och klickar på spara experiment, klickar sedan på arkiv och väljer spara exempel. För att ladda uppsamlingsapparaten, välj lastplatta A för att låta uppsamlingssteget flyttas till ett läge som är förberett för att ladda antingen ett uppsamlingsrör eller en 96-hålsplatta.För dispensering till en 96-brunnsplatta, gå till inställningssektionen och välj plattor, klicka sedan på kalibrerade plattor och välj 96-brunnsplatta. Välj sedan de brunnar som maskarna ska sorteras till och ange antalet objekt som ska sorteras i varje brunn. Var noga med att ange de gated regioner som är av intresse också.Om det finns flera gated regioner som sorteras i samma platta, se till att markera rutan märkt gate varje brunn. Klicka på OK för att spara ändringarna. Efter att ha sorterat nummer och tilldelat platserna, ladda sample på sample port och klicka på påfyllningsplattans knappar från dialogrutan förvärva och dispensera för att initiera dispensering i en 96-hålsplatta.Högre värden för förlängning och flygtid observeras hos vuxna jämfört med larver. Avkommor från två dagar gamla vuxna individer dominerades av L1- och L2-stadier, medan de flesta avkommor från tre dagar gamla vuxna nådde L3- och L4-stadier. Vid odling på E.coli ökade flygtiden och förlängningsvärdena på dag tre jämfört med dag två.Vid odling på ochrobactrum, BH 3 och blandkulturer uppvisade cenor abdidas allegands skillnader i flygtid och utbredningsvärden. Ökad kolonisering av ochrobactrum BH3 observerades i blandbetingelsen än i enbart ochrobactrum BH3. Däremot indikerade gröna, fluorescerande värden lägre OP50-kolonisering i blandat tillstånd än i enbart OP50.Maskarna är kraftigt skeva mot Y-axeln, vilket tyder på att OP50-koloniseringen är låg hos de flesta maskar, medan nivåerna av ochrobactrum, BH3-kolonisering är jämnt fördelade i populationen. Sambandet mellan ochrobactrum, BH3-koloniseringsnivåer och värdens utveckling såsom kroppstäthet och skillnader i reproduktionsmönster observerades också. De tre dagar gamla vuxna som odlades på tvåmedlemsblandningen, mikrobiomet uppvisade ett brett spektrum av RFP-intensitet, vilket indikerar individuella variationer i ochrobactrumkolonisering inom gruppen.RFP-bilder av brunnarna som innehåller 15 sorterade och individuella maskar från höga och låga RFP-grindar visas. Det viktigaste är att komma ihåg att använda lämpliga kontroller för alla steg för att säkerställa att protokollet och maskinen fungerar korrekt. I realtid kan djur med specifika egenskaper användas för att isolera stammar från värd- eller mikrobiella mutantpooler för att identifiera gener som reglerar interaktioner efter mikrober.Isolerade djur kan också användas för analys av enskilda djur eller anrikade fenotypiska pooler nedströms, t.ex. RNA-seq eller liknande. Möjligheterna är verkligen oändliga.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Mätning Caenorhabditis elegans Livslängd på 96 Tja mikrotiterplattor

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basisk<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering och miljöövervakning

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraktion och analys i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

odling av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensioner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Kvantifiering av Lipid överflöd och utvärdering av Lipid Distribution i Caenorhabditis elegans av Nile rött och olja röd O färgning

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rening och analys av Caenorhabditis elegans Extracellulära blåsor

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Använda Caenorhabditis elegans för att screena för vävnadsspecifika förkläde interaktioner

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisera aggregatkvantifiering i Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolering och karakterisering av den naturliga mikrobiotan i modellen Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Superupplösningsmikroskopi av det synaptonemala komplexet inom Caenorhabditis elegans Germline

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...