Name: application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Bu çalışma, NIH hibeleri DP2DK116645 (BSS'ye), Dunn Vakfı pilot ödülü ve NASA hibesi 80NSSC22K0250 (BSS'ye) tarafından desteklenmiştir. Bu proje aynı zamanda Baylor Tıp Fakültesi'ndeki Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdeği tarafından CPRIT Çekirdek Tesis Destek Ödülü (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 ve RR024574) ve Joel M. Sederstrom'un yardımı ve ayrıca LPS NIH hibesi (S10 OD025251) için bir enstrümantasyon hibesi. Bazı suşlar, NIH Araştırma Altyapısı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır.

1. Mikrobiyom karışımının hazırlanması
<ol><li>Bir gliserol dondurucu stoğundaki bakterileri bir lizojen et suyu (LB) plakasına veya uygun büyüme ortamına damgalayın veya çizin ve ilgilenilen bakteri suşlarına (tipik olarak 25 ° C) dayalı olarak optimum sıcaklıkta gece boyunca büyütün C . elegans doğal mikroplar).</li>
	<li>LB plakasından, her bir bakteri izolatından tek bir koloni kullanın (ör., CeMbio koleksiyonunun 12 bakterisi) 800 μL LB ortamını 1 mL derin k...

<ol>
	<li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+in+a+bacterial+world,+a+new+imperative+for+the+life+sciences.">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li><li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut.">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li><li>B&#228;ckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage.">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome.">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans.">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li><li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Team+R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li><li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> tidyverse. , (2019).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome.">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages.">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877 (2018).</li><li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ.">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids.">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li><li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIP-MAP:+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes.">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li></ol>

Akış vermimetrisi, çeşitli çalışmalarda C. elegans genlerini ve patojen kolonizasyonuna ve toksisitesine karşı yolakları karakterize etmek için kullanılmıştır21,22. Burada, bağırsak mikrobiyomlarının konakçı fizyolojisini nasıl modüle ettiğini araştırmak için C. elegans'ı kullanan yüksek verimli bir yaklaşım sunulmaktadır. Koloni oluşturan birimler (CFU) veya 16S rRNA amplikon dizilimi 9,16,17,23,24 k...

Hayvan evrimi sürekli mikrobiyal etki altındadır1. Çevredeki çeşitli mikroplardan, hayvan konakçıları, konakçının yeteneklerini genişleten ve fizyolojisini ve hastalığa duyarlılığınıartıran belirli ortaklar2 edinir 3. Örneğin, bağırsak mikrobiyomunun metagenomik analizleri, çoğu insan bağırsak mikrobiyomunda 5 bulunan obez farelerde4 daha fazla enerji hasadı ve depolanması sağlayabilecek zenginleştirilmiş metabolik mikrobiyal gen sınıflarını ortayaçıkardı. Nedensel ilişkiler kurmak ve mikrobiyom etkisinin moleküler belirleyicilerini belirlemek için hala büyük bir ihtiyaç vardır, ancak ilerleme, mikrobiyom karmaşıklıkları ve konakçı sistemlerin büyük ölçekli taramaya izlenebilirliği nedeniyle engellenmiştir.
Model organizma C. elegans, mikrobiyom ve konak fizyolojisi arasındaki bağlantıların moleküler olarak anlaşılmasını ilerletmek için bir platform sağlar. C. elegans, mukozal tabaka ve villus yapılarına sahip 20 bağırsak hücresine sahiptir. Bu hücreler, mikrobiyal ürünleri algılayan ve bağırsak kolonizörlerini potansiyel olarak düzenleyen antimikrobiyal moleküller üreten bol miktarda kemoreseptör genleri ile donatılmıştır 6,7. Bu korunmuş biyoloji C. elegans insülin sinyali, TGF-beta ve MAP Kinaz 8,9,10 dahil olmak üzere bağırsak mikroplarını düzenleyen konakçı sinyallemesinde çok sayıda keşfe yol açmıştır.
C. elegans, mikropları hem gelişim sırasında büyüme için diyetleri hem de yetişkinler olarak mikrobiyom olarak kullanır. Yaşlılıkla birlikte, bazı mikroplar bağırsak lümeninde aşırı birikebilir ve konak-mikrop ilişkisi simbiyozdan patogenezegeçer 11. Doğal ortamlarında, C. elegans çok çeşitli bakteri türleriyle karşılaşır12,13. Doğal habitatlarda (çürük meyveler, bitki sapı ve hayvan vektörleri) toplanan temsili örneklerden 16S rDNA'nın dizilenmesi, C. elegans'ın doğal mikrobiyomuna dört bakteri filumunun hakim olduğunu ortaya koydu: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes ve Actinobacteria. Bu bölümler içinde, habitat 12,13,14,15'e dayalı olarak bakterilerin çeşitliliği ve zenginliğinde büyük farklılıklar vardır. C. elegans araştırma topluluğu17 için oluşturulan en iyi mikrobiyom cinslerini temsil eden 63 üyeli (BIGbiome)16 ve 12 üyeli (CeMbio) koleksiyonları dahil olmak üzere çeşitli tanımlanmış topluluklar oluşturulmuştur. Hem mikrobiyomlar hem de bileşen suşları, vücut büyüklüğü, büyüme oranları ve stres tepkileri gibi C. elegans'ın fizyolojisi üzerinde çeşitli etkilere sahip olabilir 9,16,17. Bu çalışmalar, C. elegans'ı mikrobiyom araştırmaları için bir model olarak kurmak için kaynaklar ve örnekler sağlar.
Burada, popülasyon ölçeğinde mikrobiyom bileşimini ve konakçı fizyolojisinin temel ölçümlerini aynı anda ölçmek için C. elegans sistemini kullanan büyük partikül sıralayıcı (LPS) tabanlı bir iş akışı (Şekil 1) sunulmaktadır. Mikrobiyal açıdan, iş akışı, artan mikrobiyal etkileşimlerle topluluğun sağlamlığını ve plastisitesini test etmek için tanımlanmış bir mikrobiyomu veya tek mikropları bir araya getirmek için uyarlanabilir. Konakçı tarafında, iş akışı, mikrobiyomdaki floresan mikropların kolonizasyon seviyelerini ölçmek ve gelişim, vücut büyüklüğü ve üreme açısından konakçı fizyolojik okumasını sağlamak için yüksek verimli tahliller sağlar. Birlikte ele alındığında, C. elegans mikrobiyom modeli, konakçı fizyolojisini modüle eden metabolik ve genetik belirleyicileri saptamak için yüksek verimli ekranlar sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (1 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-11-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (2 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Costar plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Standard bacteriology agar is also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating manifold</td>
			<td>V&#38;P scientific</td>
			<td>VP1171A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Bacterial OD measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>For 96 well plate and conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.</td>
			<td>R package</td>
			<td>Version 3.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Autosampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Sorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066</td>
			<td>Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
			<td>RPI</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>GNU</td>
			<td>Version 1.3.1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome

Bağırsak mikrobiyomunun bileşimi, hayvanın gelişimi ve yaşamı boyunca konakçı fizyolojisi üzerinde dramatik bir etkiye sahip olabilir. Mikrobiyomdaki bileşimsel değişikliklerin ölçülmesi, bu fizyolojik değişiklikler arasındaki fonksiyonel ilişkilerin belirlenmesinde çok önemlidir. Caenorhabditis elegans , konak-mikrobiyom etkileşimlerinin moleküler itici güçlerini incelemek için güçlü bir konak sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Şeffaf vücut planı ve floresan etiketli doğal mikropları ile, tek bir C. elegans hayvanının bağırsak mikrobiyomundaki nispi mikrop seviyeleri, büyük bir partikül ayırıcı kullanılarak kolayca ölçülebilir. Burada, bir mikrobiyomun deneysel kurulumu, C. elegans popülasyonlarının istenen yaşam evresinde toplanması ve analizi, ayıklayıcının çalıştırılması ve bakımı ve elde edilen veri kümelerinin istatistiksel analizleri için prosedürleri açıklıyoruz. Ayrıca, ilgilenilen mikroplara dayalı olarak sıralayıcı ayarlarını optimize etmeye yönelik hususları, C. elegans yaşam evreleri için etkili geçit stratejilerinin geliştirilmesini ve bağırsak mikrobiyom bileşimine dayalı hayvan popülasyonlarını zenginleştirmek için sıralayıcı yeteneklerinin nasıl kullanılacağını tartışıyoruz. Yüksek verimli uygulamalara ölçeklenebilirlik potansiyeli de dahil olmak üzere protokolün bir parçası olarak potansiyel uygulama örnekleri sunulacaktır.

Ergin ve larva popülasyon kapılarının tanımlanması Burada, senkronize C. elegans L1'ler, standart bir laboratuvar diyeti olan E. coli OP50 (Eco) ile tohumlanmış bir NGM plakası üzerinde büyütüldü. C. elegans popülasyonları, 20 ° C'de 96 saat veya 120 saat büyümeden sonra LPS analizi için toplanmıştır (Şekil 2A). Yok oluşun nokta grafiği (EXT, vücut yoğunluğunun bir temsilcisi) ve uçuş süresi (TOF, vücut uzunluğu...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans , konakçı-mikrobiyom etkileşimlerini yönlendiren moleküler belirleyicileri incelemek için güçlü bir modeldir. C. elegans fizyolojisinin temel yönleriyle birlikte bağırsak mikrobiyom kolonizasyonunun tek hayvan seviyelerinin profilini çıkaran yüksek verimli bir boru hattı sunuyoruz.

Caenorhabditis elegans Bağırsak Mikrobiyomunun Miktar Tayini ve Analizi için Akış Vermimetrisinin Uygulanması

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

Bağırsak mikrobiyomu, konakçının fizyolojisini şekillendirmede önemli rol oynar. Bu protokol, özellikle, tek, hücresel hayvanlarda floresan bağırsak mikrop kolonizasyon seviyelerinin büyük ölçekte yüksek verimli değerlendirmesine izin verir. Bu yöntemin en büyük faydalarından biri, canlı hayvanların bağırsak mikrobiyomunu gerçek zamanlı olarak izleme yeteneğidir, bu da herhangi bir değişikliğin konakçının fizyolojisi ile tanımlanmasına ve korelasyonuna izin verir.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Dana Blackburn olacak. Solucanları bakteri çimlerinden bir ila iki mililitre M9-TX ile yıkayarak başlayın. Solucanları sterilize edilmiş iki mililitrelik 96 kuyu derinliğinde bir plakaya aktarın.Bir dakika boyunca 300 G'de pelet yapın ve bir aspirasyon manifoldu kullanarak sıvıyı çıkarın. 1,2 mililitrelik çok kanallı bir pipet kullanarak, birkaç kez pipetleyerek karıştırılan derin kuyu plakasının her bir oyuğuna 1,8 mililitre M9-TX ekleyin ve bir dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Son yıkamadan sonra, aspirasyon manifoldunu kullanarak her bir oyuktaki hacmi 100 mikrolitreye getirin.Her kuyucuğa 100 mikrolitre 10 milimolar levamisol ve M9-T ekleyin ve solucanların beş dakika boyunca felç olmasına izin verin. Daha sonra bakteri kümelerini azaltmak için her bir oyuğa iki dakika boyunca% 4 ağartma solüsyonu ekleyin. Ağartma işleminden sonra, solucanları yıkamak için plakanın her bir oyuğuna M9-TX ekleyin.Plakayı santrifüjleyin ve ikinci yıkamadan sonra 100 mikrolitrelik son hacme aspire edin. Solucanları, 150 mikrolitre 10 milimol levamisol ve M9-TX içeren düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Solucan yoğunluğunu kuyu başına 50 ila 100 solucanda tutun ve popülasyon çok kalabalıksa solucanları birden fazla kuyuya bölün.Hava kompresörünü, bilgisayarı ve LPS cihazını açın. Atık tankını kontrol edin ve boşaltın. Hacim düşükse kılıf ve su depolarını kontrol edin ve yeniden doldurun.250 mikrometre akışkan ve optik çekirdek tertibatının yerinde olduğundan emin olun. Otomatik örnekleyiciyi bağlayın ve açın. Otomatik örnekleyiciyi ve LPS yazılımını açmak için otomatik örnekleyici cihaz yazılımını açın.LPS yazılım penceresinde dosyaya gidin ve yeni deneme'ye tıklayın, ardından dosyayı tekrar seçin ve yeni örnek denetimi'ne tıklayın. Henüz yapılmadıysa, lazerlerin 488 ve 561 nanometre lazerleri açmasını sağlayın. Şimdi, LPS yazılım penceresinde uçuş süresi, sönme ve floresan kanallarını kullanarak edinim nokta grafikleri için şablonlar oluşturun.Ölçeklendirmeyi değiştirmek için grafiğin gövdesine sağ tıklayın. Ardından, kontrol örneklerini yükleyin. Otomatik örnekleyici penceresinde Prime'ı seçin, dosyaya gidin, doğru yerleşik komut dosyasını seçmek için komut dosyasını aç'a tıklayın ve Tamam'a tıklayın.Analiz için istenen kuyucukları seçmek için numune alıcı yazılım menüsündeki plaka şablonuna gidin. Plakayı otomatik örnekleyici aşamasına yükledikten ve sabitledikten sonra, otomatik örnekleyici penceresindeki plakayı çalıştır'a basın ve istendiğinde dosyayı kaydedin, ardından LPS yazılım penceresinde üst şeritte bulunan mevcut verileri sakla düğmesine tıklayın ve verileri tekrar kaydedin. LPS yazılımını açın.Dosyaya gidin ve yeni denemeyi seçin, ardından dosyaya geri dönün ve yeni örnek'i tıklayın. X ekseninde uçuş süresi ve Y ekseninde sönme ile bir nokta grafiği oluşturun. X ekseninde uçuş süresi ve Y ekseninde kırmızı olan başka bir nokta grafiği oluşturun.488 ve 561 nanometre lazerleri etkinleştirmek için lazerleri etkinleştirdiğinizden emin olun. Kontrol s'yi yerleştirinampample bağlantı noktası, ardından al ve dağıt iletişim kutusunda al'a tıklayın. İstendiğinde, dosyayı kaydettiğinizden emin olun.Popülasyonları ayırt etmek için yeterli sayıda solucan ölçüldükten sonra, uçuş ve yok olma zamanını gösteren nokta grafiğinde iptali seçin. Alanın etrafına yetişkin nüfusu temsil eden bir kapı çizin. Ardından görünüme gidin, geçit hiyerarşisine tıklayın ve floresan kapıların yetişkin nüfus kapısı altında doğru şekilde listelenip listelenmediğini kontrol edin.Uçuş zamanına karşı kırmızı nokta grafiğinde, yetişkin solucanlarda mikrobiyom kolonizasyonunu gösteren ilgi alanlarını vurgulamak için yüksek ve düşük kırmızı değerli alanların etrafında kapılar oluşturun. Ayarlar optimize edildikten sonra dosyaya ilerleyin ve denemeyi kaydet'e tıklayın, ardından dosyaya tıklayın ve örneği kaydet'i seçin. Toplama aparatını yüklemek için, toplama aşamasının bir toplama tüpü veya 96 kuyulu bir plaka yüklemek için hazırlanmış bir konuma hareket etmesine izin vermek için yük plakası A'yı seçin.96 kuyulu bir plakaya dağıtmak için kurulum bölümüne gidin ve plakaları seçin, ardından kalibre edilmiş plakalara tıklayın ve 96 kuyulu plakayı seçin. Ardından, solucanların sıralanacağı kuyucukları seçin ve her bir kuyucuğa sıralanacak nesnelerin sayısını girin. İlgilendiğiniz geçitli bölgeleri de belirttiğinizden emin olun.Aynı plakaya sıralanan birden fazla kapılı bölge varsa, her biri kapı işaretli kutuyu işaretlediğinizden emin olun. Değişiklikleri kaydetmek için Tamam'ı tıklayın. Numaraları sıraladıktan ve konumları atadıktan sonra, numuneyi numune portuna yükleyin ve 96 oyuklu bir plakaya dağıtımı başlatmak için alma ve dağıtma iletişim kutusundan doldurma plakası düğmelerine tıklayın.Erişkinlerde larvalara göre daha yüksek uzama ve uçuş süresi değerleri gözlenir. İki günlük yetişkinlerden alınan döller L1 ve L2 aşamaları tarafından domine edilirken, üç günlük yetişkinlerden gelen döllerin çoğu L3 ve L4 aşamalarına ulaştı. E.coli'de büyütüldüğünde, uçuş süresi ve uzatma değerleri üçüncü günde ikinci güne göre arttı.Ochrobactrum, BH üç ve karışık kültürlerde yetiştirildiğinde, cenor abdidas alegorları uçuş süresi ve uzama değerlerinde farklılıklar gösterdi. Karışık durumda sadece ochrobactrum BH3'e göre artmış ochrobactrum BH3 kolonizasyonu gözlendi. Buna karşılık, yeşil, floresan değerler, karışık durumda tek başına OP50'ye göre daha düşük OP50 kolonizasyonunu gösterdi.Solucanlar, Y eksenine doğru yoğun bir şekilde çarpıktır, bu da OP50 kolonizasyonunun çoğu solucanda düşük olduğunu, ochrobactrum, BH3 kolonizasyonu seviyelerinin popülasyonda eşit olarak dağıldığını düşündürür. Okrobaktrum, BH3 kolonizasyon düzeyleri ile vücut yoğunluğu gibi konak gelişimi ve üreme paternlerindeki farklılıklar arasındaki ilişki de gözlendi. İki üyeli karışımda yetiştirilen üç günlük yetişkinler, mikrobiyom, grup içindeki ochrobactrum kolonizasyonundaki bireysel varyasyonları gösteren geniş bir RFP yoğunluğu yelpazesi sergiledi.Yüksek ve düşük RFP kapılarından 15 adet sıralanmış ve ayrı ayrı solucan içeren kuyucukların RFP görüntüleri gösterilmektedir. En önemli şey, protokolün ve makinenin düzgün çalıştığından emin olmak için tüm adımlar için uygun kontrolleri kullanmayı hatırlamaktır. Gerçek zamanlı olarak, belirli özelliklere sahip hayvanlar, mikrop sonrası etkileşimleri düzenleyen genleri tanımlamak için konakçı veya mikrobiyal mutant havuzlardan suşları izole etmek için kullanılabilir.İzole edilmiş hayvanlar, RNA-seq veya benzerleri gibi tek hayvan veya zenginleştirilmiş fenotipik havuz tabanlı aşağı akış analizleri için de kullanılabilir. Gerçekten, fırsatlar gerçekten sonsuzdur.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Ölçme Caenorhabditis elegans 96 Şey microtiter Tabaklar Ömrü

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

yetiştirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Laboratuvarı Üç boyutlu

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Lipid bolluk ve değerlendirme Lipid dağılımı Nil kırmızı ve O kırmızı petrol boyama tarafından Caenorhabditis elegans miktar

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Model Nematod Caenorhabditis elegans'ın Doğal Mikrobiyotasının İzolasyonu ve Karakterizasyonu

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Caenorhabditis elegans Germline İçindeki Sinaptonemal Kompleksin Süper Rezolüsyonlu Mikroskopisi

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...