Name: testing cancer immunotherapeutics in a humanized mouse model bearing human tumors
Uploaded: 2022-12-16T13:50:00
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Wir bedanken uns sowohl bei der Animal Research Facility (OLAR) für die Betreuung unserer Mäuse als auch bei der Flow Cytometry Shared Resource, die durch den Cancer Center Support Grant (P30CA046934) an unserem Institut unterstützt wird, für ihre immense Hilfe bei all unserer Arbeit. Wir danken auch Gail Eckhardt und Anna Capasso für unsere erste Zusammenarbeit bei der Untersuchung von Immuntherapien gegen humane PDXs in unserem HIS-BRGS-Modell. Diese Studie wurde teilweise durch den National Institutes of Health P30CA06934 Cancer Center Support Grant unter Verwendung der PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models) Shared Resource, RRID: SCR_021990 and Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035, unterstützt. Diese Forschung wurde zum Teil vom NIAID der National Institutes of Health unter der Vertragsnummer 75N93020C00058 unterstützt.

Alle Tierarbeiten wurden gemäß Tierprotokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Colorado Denver genehmigt wurden (IACUC-Protokolle #00593 und #00021). Alle Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit dem Office of Laboratory Animal Resources (OLAR) durchgeführt, einer von der American Association for Laboratory Animal Care akkreditierten Einrichtung auf dem Denver Anschutz Medical Campus der University of Colorado. Alle menschlichen Nabelschnurblutproben wurden als S...

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	<li>Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+tumor+models+for+advanced+cancer+immunotherapy.">Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).</li><li>Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+cancer+immunotherapy+research.">Mouse models for cancer immunotherapy research.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).</li><li>Marin-Jimenez, J. 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In den letzten 6 Jahren hat unser Forschungsteam mit unserer Expertise sowohl in der Immunologie als auch an humanisierten Mäusen ein dringend benötigtes präklinisches Modell entwickelt, um Immuntherapien an einer Vielzahl von menschlichen Tumoren zu testen 3,7,30,31. Dieses Protokoll betont die Berücksichtigung der Variabilität des Modells, mit besonderem Augenmerk auf die immuntherapieze...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64606">Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors</a>. The Authors section was updated from:
Jordi M. Lanis1 
Matthew S. Lewis1 
Hannah Strassburger1 
Stacey M. Bagby2 
Adrian T. A. Dominguez2 
Juan A. Mar&#237;n-Jim&#233;nez3 
Roberta Pelanda1 
Todd M. Pitts2 
Julie Lang1 
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L&#8217;Hospitalet)
to:
Jordi M. Lanis1 
Matthew S. Lewis1 
Hannah Strassburger1 
Kristina Larsen1 
Stacey M. Bagby2 
Adrian T. A. Dominguez2 
Juan A. Mar&#237;n-Jim&#233;nez3 
Roberta Pelanda1 
Todd M. Pitts2 
Julie Lang1 
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L&#8217;Hospitalet)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64606">Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

Krebsmodelle von Mäusen sind wichtig für die Aufklärung grundlegender Mechanismen des Tumorwachstums und der Immunflucht. Krebsbehandlungsstudien in Mausmodellen haben jedoch aufgrund begrenzter syngener Modelle und speziesspezifischer Unterschiede zu einer begrenzten Translation in die Klinik geführt 1,2. Das Aufkommen von Immuntherapien als dominanter Ansatz zur Kontrolle von Tumoren hat die Notwendigkeit eines In-vivo-Modells mit einem funktionierenden menschlichen Immunsystem erneut verdeutlicht. Fortschritte bei Mäusen mit menschlichem Immunsystem (HIS-Mäuse) in den letzten zehn Jahren haben es ermöglicht, die Immunonkologie in vivo bei einer Vielzahl von Krebsarten und Immuntherapeutika zu untersuchen 3,4,5,6. Humane Tumormodelle, einschließlich von Zelllinien und Patienten stammender Xenotransplantate (CDX bzw. PDX), wachsen in HIS-Mäusen gut und sind in den meisten Fällen nahezu identisch mit ihrem Wachstum im immundefizienten Wirt, dem die humane hämatopoetische Transplantation fehlt 7,8. Basierend auf dieser zentralen Erkenntnis haben die Forscher das HIS-Mausmodell verwendet, um menschliche Immuntherapien zu untersuchen, einschließlich Kombinationstherapien, die darauf ausgelegt sind, die Tumormikroumgebung (TME) zu verändern, um die Immunsuppression zu verringern und so die immungerichtete Tumorabtötung zu verbessern. Diese präklinischen Modelle tragen dazu bei, die Probleme der Heterogenität menschlicher Krebserkrankungen zu lösen, und können auch den Behandlungserfolg vorhersagen sowie immunbedingte Arzneimitteltoxizitäten überwachen 9,10.
Die Herstellung eines Mausmodells mit menschlichem Immunsystem durch die Einführung menschlicher hämatopoetischer Stammzellen erfordert eine immundefiziente Maus, die das Xenotransplantat nicht abstößt. Aktuelle HIS-Mausmodelle basieren auf immundefizienten Mausstämmen, über die vor über 30 Jahren berichtet wurde. Der erste beschriebene immundefiziente Mausstamm waren SCID-Mäuse, denen T- und B-Zellen fehlten11, gefolgt von einem hybriden NOD-SCID mit einem SIRPα-Polymorphismus, der für die Toleranz von Mausmakrophagen gegenüber menschlichen Zellen verantwortlich ist, aufgrund einer erhöhten Bindung des NOD SIRPα-Allels an das menschliche CD47-Molekül12,13. In den frühen 2000er Jahren war die Deletion der gemeinsamen Gammakette des IL-2-Rezeptors (IL-2Rγc) sowohl auf immundefizienten BALB/c- als auch auf NOD-Stämmen ein Wendepunkt für eine verbesserte menschliche Transplantation, da genetische Deletionen die Entwicklung von Wirts-NK-Zellen verhinderten14,15,16,17. Alternative Modelle, wie BRG- und NRG-Mäuse, erreichen T- und B-Zell-Defizienz durch Deletion des Rag1- oder Rag2-Gens, das für T- und B-Zell-Rezeptor-Genumlagerungen und damit für die Reifung und das Überleben von Lymphozyten erforderlich ist18,19. Die hier verwendete BRGS-Maus (BALB/c-Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD) kombiniert die IL-2Rγ-Kettendefizienz und das NOD-SIRPα-Allel auf dem Rag2-/- Hintergrund, was zu einer hochgradig immundefizienten Maus ohne T-, B- oder NK-Zellen führt, jedoch mit ausreichender Vitalität und Gesundheit, um ein langfristiges Transplantat von mehr als 30 Wochen zu ermöglichen13.
HIS-Mäuse können auf verschiedene Arten erzeugt werden, wobei die menschliche PBMC-Injektion die direkteste Methode ist15,18,20. Diese Mäuse weisen jedoch eine ausgeprägte Ausdehnung aktivierter menschlicher T-Zellen auf, die im Alter von 12 Wochen zu einer Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD) führt, was Langzeitstudien verhindert. Alternativ können auch humane hämatopoetische Stammzellen aus Nabelschnurblut (CB), Knochenmark und fetaler Leber für die Transplantation und Produktion des menschlichen Immunsystems de novo verwendet werden. In diesem System produzieren die hämatopoetischen Stammzellen ein menschliches Immunsystem mit mehreren Linien mit der Bildung von T-, B- und angeborenen Immunzellen, die im Vergleich zu den PBMC-Mäusen, die hauptsächlich T-Zellen entwickeln, gegenüber dem Mauswirt sehr tolerant sind. Daher fehlt die GVHD oder ist stark verzögert, und die Studien können auf Mäuse bis zu einem Alter von 10 Monaten ausgeweitet werden. CB bietet eine einfache, zugängliche und nicht-invasive Quelle von CD34+ humanen hämatopoetischen Stammzellen, die die Transplantation mehrerer KIS-Mäuse mit genetisch identischem Immunsystem erleichtert 17,18,20,21. In den letzten Jahren wurden HIS-Mausmodelle ausgiebig zur Untersuchung der Immuntherapie und des TME 3,4,5,6 eingesetzt. Trotz der Entwicklung eines vom Menschen abgeleiteten Immunsystems in diesen Mäusen wachsen menschliche Xenotransplantat-Tumore im Vergleich zu den immundefizienten Kontrollmäusen mit ähnlichen Geschwindigkeiten und ermöglichen das komplexe Zusammenspiel zwischen den Krebszellen und den Immunzellen, das für die Aufrechterhaltung der Mikroumgebung des transplantierten PDX wichtig ist 3,7,8 . Dieses Protokoll wurde verwendet, um über 50 Studien durchzuführen, in denen Behandlungen an HIS-BRGS-Mäusen mit PDXs und CDXs getestet wurden. Eine wichtige Schlussfolgerung ist, dass die humanen Tumore in den HIS-Mäusen ihre einzigartige TME beibehalten, wie sie durch die molekulare Bewertung des Tumors in Bezug auf die ursprüngliche Patientenprobe und die Eigenschaften des Immuninfiltrats definiert wird 3,22,23. Unsere Gruppe konzentriert sich auf die eingehende Evaluierung des KIS sowohl in Immunorganen als auch im Tumor mittels Multiparameter-Durchflusszytometrie. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Humanisierung von BRGS-Mäusen, die Bewertung von Chimärismus, die Implantation von humanen Tumoren, Tumorwachstumsmessungen, die Verabreichung von Krebsbehandlungen und die Analyse der HIS-Zellen mittels Durchflusszytometrie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe w/needles</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1031815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB563792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stim Cocktail</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>509305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 Rack</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-plugged glass pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement membrane extract</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>363200502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora</td>
			<td>Cytek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-98-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic Stemcell FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10439001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106 500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Hypaque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>45001752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - fine</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;</td>
			<td>RS5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps normal</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>RS4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F75P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Glass Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1255310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pipettes</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>63A53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/ Ca &#38; Mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>55037C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DL</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5466202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgG-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>JDC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgG-unabeled</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>H2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgM-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>UHB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgM-unlabeled</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>SA-DA4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiRad 350</td>
			<td>Precision X-Ray</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec Hu FLT3L</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>308-FK-005/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec Hu IL6</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>206-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec Hu SCF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>255SC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>862945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 25 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>567-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile molecular water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeti Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12004279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Green</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>423112</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

testing cancer immunotherapeutics in a humanized mouse model bearing human tumors

Die Umkehrung der immunsuppressiven Natur der Tumormikroumgebung ist entscheidend für die erfolgreiche Behandlung von Krebserkrankungen mit Immuntherapeutika. Mauskrebsmodelle sind in ihrer Vielfalt extrem begrenzt und leiden unter einer schlechten Translation in die Klinik. Um als physiologisches präklinisches Modell für Immuntherapiestudien zu dienen, wurde dieses Protokoll entwickelt, um die Behandlung menschlicher Tumore in einer Maus zu bewerten, die mit einem menschlichen Immunsystem rekonstituiert wurde. Dieses einzigartige Protokoll demonstriert die Entwicklung von Mäusen des menschlichen Immunsystems (HIS, "humanisiert") und anschließend die Implantation eines menschlichen Tumors, entweder eines von der Zelllinie abgeleiteten Xenotransplantats (CDX) oder eines vom Patienten abgeleiteten Xenotransplantats (PDX). HIS-Mäuse werden durch Injektion von CD34+ humanen hämatopoetischen Stammzellen, die aus Nabelschnurblut isoliert wurden, in neonatale BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) stark immundefiziente Mäuse erzeugt, die auch in der Lage sind, einen xenogenen Tumor zu akzeptieren. Die Bedeutung der Kinetik und Eigenschaften der Entwicklung des menschlichen Immunsystems und der Tumorimplantation wird betont. Abschließend wird eine eingehende Beurteilung der Tumormikroumgebung mittels Durchflusszytometrie beschrieben. In zahlreichen Studien, in denen dieses Protokoll verwendet wurde, wurde festgestellt, dass die Tumormikroumgebung einzelner Tumore in HIS-PDX-Mäusen rekapituliert wird; "heiße" Tumore weisen eine große Immuninfiltration auf, während "kalte" Tumore dies nicht tun. Dieses Modell dient als Testfeld für Kombinationsimmuntherapien für ein breites Spektrum menschlicher Tumore und stellt ein wichtiges Werkzeug auf dem Weg zur personalisierten Medizin dar.

In Anlehnung an das Flankentumorprotokoll und den experimentellen Zeitplan (Abbildung 1) wurden das Tumorwachstum und die Immunantwort auf eine zielgerichtete Tyrosinkinase-Inhibitor-Therapie (TKI) und eine Nivolumab-Kombinationstherapie in zwei verschiedenen PDXs von humanem Darmkrebs (CRC) untersucht. Die TKI-Medikamente wurden in immundefizienten Wirten untersucht, um das Tumorwachstum zu beurteilennur 29. Dieses Modell ermöglichte die Untersuchung von Veränderun...

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Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Mäusen mit menschlichem Immunsystem (KIS) für immunonkologische Studien. Anweisungen und Überlegungen zur Verwendung dieses Modells zum Testen von humanen Immuntherapeutika an menschlichen Tumoren, die in dieses Modell implantiert wurden, werden vorgestellt, wobei der Schwerpunkt auf der Charakterisierung der Reaktion des menschlichen Immunsystems auf den Tumor liegt.

Erprobung von Krebsimmuntherapeutika in einem humanisierten Mausmodell mit menschlichen Tumoren

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine ...

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Mäusen des menschlichen Immunsystems (Human Immune System) für präklinische immunonkologische Studien. Mauskrebsmodelle sind in ihrer Vielfalt begrenzt und lassen sich nur unzureichend auf die Klinik übertragen. Diese Technik dient als präklinisches Modell für Immuntherapiestudien, indem die Behandlung menschlicher Tumore in einer Maus mit menschlichem Immunsystem untersucht wird.Das humanisierte Mausmodell kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte der menschlichen Immunologie zu untersuchen, einschließlich der Reaktionen auf viele Infektionen oder Krebserkrankungen des menschlichen Immunsystems. Es kann eine Herausforderung sein, eine zuverlässige und robuste Quelle für Nabelschnurblut zu beschaffen und die Gesundheit der immungeschwächten Mauskolonie zu erhalten. Expertise in Durchflusszytometrie und immunologischer Analytik ist unerlässlich.Kristina Larsen, eine Expertin für Forschungsdienstleistungen aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Zu Beginn wird das aus Nabelschnurblut isolierte CD34-positive Zellpellet in 300 Mikrolitern Magnetzellseparatorpuffer pro 10 mal 10 bis zu den achten Zellen resuspendiert. Fügen Sie 100 Mikroliter FCR-blockierendes Reagenz pro einmal 10 zu den achten Zellen hinzu, gefolgt von 100 Mikrolitern CD34-positiven magnetischen Beads pro einer mal 10 zu den achten Zellen und inkubieren Sie sie bei vier Grad Celsius für 30 Minuten.Als nächstes fügen Sie den achten Zellen fünf Milliliter Magnetzellenseparatorpuffer pro 10 hinzu und schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 360 g bei vier Grad Celsius. Wiederholen Sie den Waschschritt und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern pro 100 Millionen Zellen Magnetzellenseparatorpuffer in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen, das als unfraktioniert gekennzeichnet ist. Beschriften Sie zwei weitere 15-Milliliter-Röhrchen CD34-negativ und CD34-positiv Legen Sie die drei Röhrchen auf ein Kühlgitter.Trennen Sie die Zellen mit dem Zwei-Säulen-Positivauswahlprogramm auf einem automatischen Magnetzellenseparator in einer Biosicherheitswerkbank. Als nächstes bereiten Sie zum Expandieren und Einfrieren von CD34-positiven menschlichen Stammzellen Nabelschnurblut oder CB-Medium vor, wie im Manuskript beschrieben, und passieren Sie einen 0,22-Mikrometer-Filter. Resuspendieren Sie die CD34-positiven Zellen bei 100.000 pro Milliliter CB-Medium und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius.Am dritten Tag wird ein gleiches Volumen CB-Medium ohne Zytokine in den Kolben gegeben. Am fünften Tag ernten Sie die expandierten CD34-positiven Zellen. Pipettieren Sie die Zellsuspension auf und ab und sammeln Sie sie in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen.Fügen Sie so viel CB-Medium hinzu, dass der Boden des Kolbens bedeckt ist. Kratzen Sie mit einem Zellschaber den gesamten Boden des Kolbens ab. Sammeln Sie alle Medien in demselben 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie.Resuspendieren Sie die Zellen in zwei Milliliter CB-Medium und zentrifugieren Sie sie. Saugen Sie das Medium bis zum Pellet ab und resuspendieren Sie das Pellet in einem Gefriermedium. Als nächstes beginnen Sie mit der CD34-positiven Zellpräparation drei Stunden nach der Bestrahlung des Welpen.Erwärmen Sie 10 Milliliter CB-Medien in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Entnehmen Sie eine Durchstechflasche mit in vitro expandierten und gefrorenen CD34-positiven Zellen für jeweils vier bis sechs Welpen zur Injektion. Tauen Sie bei 50 bis 55 Grad Celsius schnell auf, bis nur noch eine kleine Menge Eis sichtbar ist, und geben Sie die Zellen in das erwärmte CB-Medium.Verwenden Sie einen Milliliter Medium, um jede Durchstechflasche zu spülen, und drehen Sie die Zellen 12 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 360 g. Saugen Sie das Medium vorsichtig ab. Resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter CB-Medium und zählen Sie die Zellen.Zentrifugieren Sie erneut die Zellen, saugen Sie das Medium an und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern sterilem PBS pro n plus einem Welpen zur Injektion, was zu 250.000 bis 450.000 CD34-positiven Zellen pro Maus führt. Für die PBMC-Isolierung aus Mäuseblut mischen Sie das Blutheparin, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren, und legen Sie es langsam auf 500 Mikroliter mit einem Dichtegradienten von 1,077 Gramm pro Milliliter, wobei Sie darauf achten müssen, die Grenzfläche nicht zu stören. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1.220 g für 20 Minuten bei Raumtemperatur ohne Pausen.Entfernen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette so viele Zellen wie möglich aus dem Buffy-Coat und geben Sie sie in das neue 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 750 Mikrolitern Erntemedium. Bei 360 g 11 Minuten zentrifugieren. Saugen Sie das Medium auf 50 Mikroliter ab und resuspendieren Sie das Pellet in 750 Mikrolitern Erntemedium.Erfassen Sie die Daten für 100 Mikroliter jeder Probe auf einem Durchflusszytometer. Importieren Sie dann die fcs-Datei in die Fließdatenbearbeitungssoftware, und wenden Sie ein Polygon-Gate auf ein FSC-A- und SSC-A-Diagramm an. Ändern Sie die Achsen in FSC-A statt FSC-H, und schließen Sie die Zellen auf der linearen Diagonalen an, wobei die Dubletten, die aus der Linie herausragen, ausgeschlossen werden.Wählen Sie diese Zellen aus, und ändern Sie die Achsen in hCD45 im Vergleich zu mCD45. Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die hCD45-positive Grundgesamtheit an, und wenden Sie den Namen Mensch an. Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die mCD45-positive Grundgesamtheit an, und wenden Sie den Namen Maus an.Erstellen Sie eine Zählstatistik für menschliche und Mauspopulationen. Wählen Sie als Nächstes die menschliche Grundgesamtheit aus, und ändern Sie die Achsen in CD19 statt CD3. Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die CD19-positiven Zellen an und nennen Sie sie B-Zellen.Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die CD3-positive Population an und nennen Sie sie T-Zellen. Wenden Sie dann ein Polygon-Gate auf die doppelt negative Grundgesamtheit an, und nennen Sie sie Nicht-TB. Wählen Sie die T-Zell-Population aus, und ändern Sie die Achsen in CD4 im Vergleich zu CD3.Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die CD4-positive Grundgesamtheit an, und nennen Sie es CD4-positiv. Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die CD4-negative Grundgesamtheit an, und nennen Sie es CD8. Wählen Sie die Nicht-TB-Population aus, und ändern Sie die Achsen in CD56 im Vergleich zu Myeloid.Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die gesamte CD56-positive Population an und nennen Sie es NK-Zellen. Wenden Sie dann ein Polygon-Gate auf die CD56-negative und myeloid-positive Population an und nennen Sie es myeloid. Erstellen Sie eine Tabelle für die Prozent- und Anzahlstatistiken aller Populationen, und exportieren Sie sie in eine Tabelle.Berechnen Sie den prozentualen hCD45-Chimärismus mit der angegebenen Formel. Nachdem Sie Tumorzellen in der Maus gezüchtet und medikamentöse Behandlungen verabreicht haben, ernten Sie das Gewebe. Legen Sie die Maus auf ein Schaumstoff-Sezierbrett mit Stiften, um sie an Ort und Stelle zu halten, und strecken Sie die Arme und Beine in einem Winkel von 45 Grad.Machen Sie einen Schnitt in der Mitte des Rumpfes, beginnend in der Nähe des Beckens und bis zum Kinn. Ziehen Sie die Haut bis zum Rand und halten Sie sie mit Stecknadeln fest. Extrahieren Sie die Lymphknoten mit einer feinen Pinzette in der Reihenfolge axillar, zervikal, mesenterial, inguinal und hiatal.Legen Sie die Lymphknoten auf einer Seite des Milchglasträgers in eine Petrischale in acht Milliliter Erntemedium. Halten Sie die Objektträger in einem senkrechten Winkel mit den mattierten Kanten nach innen und drücken Sie vorsichtig auf das Gewebe, bis der Zellinhalt freigesetzt wird. Spülen Sie den Objektträger mehrmals aus, indem Sie sie auseinander und zusammen ziehen, um die maximale Anzahl von Zellen freizusetzen.Sammeln Sie die Zellen mit einer Fünf-Zoll-Glaspipette und filtern Sie sie durch eine neun Zoll große Pipette mit Wattestopfen in ein beschriftetes konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes ziehen Sie den Tumor aus der offenen Flanke heraus, indem Sie den Tumor mit einer Pinzette festhalten, während Sie mit einer Sezierschere langsam an den Tumorrändern abschneiden. Wiegen Sie den Tumor und entfernen Sie 1/4 des Tumors für die RNA- und immunhistochemische Verarbeitung.Legen Sie die restlichen 3/4 des Tumors in eine sechs Zentimeter große Schale und zerkleinern Sie sie mit einer Skalpellklinge in einen Millimeter große Stücke. Übertragen Sie die Tumorstücke in ein Dissoziationsröhrchen. Spülen Sie dann die Schale mit unvollständigem TIL-Medium aus und geben Sie es in das Röhrchen.Fügen Sie Kollagenase-Präparat hinzu und dissoziieren Sie das Gewebe durch mechanische Dissoziation bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten bis eine Stunde. Die Suspension wird über einen 100-Mikron-Filter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen geleitet und der Filter mit 10 Millilitern TIL-Komplettmedien gespült. Zentrifugieren und resuspendieren Sie das Pellet in gerade so viel Erntemedium mit DNase, dass die Zellsuspension problemlos durch eine P1000-Pipettenspitze geleitet und das Volumen für die nachgeschaltete Analyse aufgezeichnet werden kann.Im PDX SFB 307P verlangsamte die Kombinationstherapie das Wachstum des Tumors, was durch das Tumorwachstumsvolumen über die Zeit, das Tumorgewicht und die spezifische Wachstumsrate bestimmt wurde. PDX CRC 307M, das in einer anderen Kohorte von Mäusen getestet wurde, war von der gleichen Kombinationsbehandlung bei HIS-BRGS-Mäusen weniger betroffen. Basierend auf dem gesamten humanen hCD45-positiven und humanen T-Zell-hCD3-positiven Chimärismus im Blut vor der Tumorimplantation stiegen beide Parameter im peripheren Immunsystem und in der TIL in Kombination mit behandelten CRC 307P-tragenden Mäusen an, jedoch nicht im SFB-307M-Modell.Die Untersuchung der humanen T-Zellen ergab mehr aktivierte T-Zellen in den Tumoren des SFB 307P, nicht aber die Lymphe von Kombinations-behandelten Mäusen. Außerdem gab es mehr Effektorgedächtnis-CD8-positive T-Zellen und weniger TIM-3-positive T-Zellen in den kombinationsbehandelten CRC 307P-Tumoren. Im Gegensatz dazu war dieser Unterschied beim Modell CRC 307M nicht zu bemerken.Weiterhin wurden keine Veränderungen in der Häufigkeit zytotoxischer T-Zell-Populationen bei den mit Kombination behandelten Mäusen beobachtet, obwohl bei unbehandelten Mäusen höhere zytotoxische T-Zellen beobachtet wurden. Die Kombinationstherapie hatte keinen Einfluss auf die Häufigkeit von Tregs in den Lymphorganen des SFB 307P oder in Tumoren, obwohl die Daten des SFB 307M einen Trend zu reduzierten Tregs zeigten. Immunbedingte Veränderungen in Tumorzellen waren mittels Durchflusszytometrie erhöht.Eine erhöhte Expression der MHC-Klassen I und II wurde auf den CRC 307P-Tumorzellen beobachtet, die aus kombinationsbehandelten HIS-BRGS-Mäusen extrahiert wurden. Im Modell des SFB 307M induzierte die gleiche medikamentöse Behandlung die HLA-Klasse-II-Expression auf den Tumorzellen. In ähnlicher Weise führte die Kombinationstherapie zu einer erhöhten PD-L1-Expression auf den EpCAM-positiven CRC 307P-Tumorzellen.Abschließend wurden Korrelationen zwischen Immunantworten und Tumorwachstum untersucht. Vermehrte CD4-positive T-Zellen zeigten eine signifikante Korrelation mit geringerem Tumorwachstum, genauer gesagt die HLA-DR-positiv aktivierten T-Zellen in den kombinationsbehandelten HIS-Mäusen. Sterile Technik bei der Isolierung der CD34-positiven Zellen, da die Mäuse extrem immundefizient sind.Der daraus resultierende Chimärismus ist innerhalb und zwischen Nabelschnurblutspendern variabel, wobei T-Zellen die größte Variation aufweisen. Es können unbegrenzte Kombinationen von Immuntherapien durchgeführt werden, ebenso wie mechanistische und kinetische Studien zur Medikamentendosierung, z. B. die Deletion von CD8-T-Zellen, um ihre Rolle zu bestätigen. Wichtig ist, dass auch drogenbedingte Toxizitäten untersucht werden können.Es stellte ein relevanteres und zugänglicheres präklinisches Modell zur Verfügung, um humane Immuntherapien für die Translation in die Klinik zu testen. Auf der Grundlage dieser Daten laufen derzeit mehrere klinische Studien.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluoreszierende orthotopen Mausmodell des Bauchspeicheldrüsenkrebs

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Forschung

Krebsforschung

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In - vivo - Modell für die Prüfung von Wirkung von Hypoxie auf die Tumormetastasierung

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Die Colon-26-Karzinom Tumor-tragenden Maus als Modell für die Untersuchung von Krebs Kachexie

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Tumor Engraftment in einem Xenograft-Maus-Modell der menschlichen Mantel-Zell-Lymphom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Entwicklung eines menschlichen präklinischen Modell der Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten Co mit Brustkrebszelllinien kultiviert

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Murine Modell der metastasierenden Lebertumoren in der Einstellung der Ischämie Reperfusionsverletzung

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Beschaffung von Krebsstammzellkugeln aus gynäkologischen und Brustkrebstumoren

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ein schneller Screening-Workflow zur Identifizierung einer potenziellen Kombinationstherapie für GBM unter Verwendung von vom Patienten abgeleiteten Gliomstammzellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

High-Resolution Ultrasonography for the Analysis of Orthotopic ATC Tumors in a Genetically Engineered Mouse Model

Hochauflösende Sonographie zur Analyse orthotoper ATC-Tumoren in einem gentechnisch veränderten Mausmodell

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes ...