Name: testing cancer immunotherapeutics in a humanized mouse model bearing human tumors
Uploaded: 2022-12-16T13:50:00
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マウスの世話をしてくれた動物研究施設(OLAR)と、がんセンター支援助成金(P30CA046934)が支援するフローサイトメトリー共有リソースの両方に、私たちのすべての仕事に多大な支援をしてくださったことに感謝します。また、ゲイル・エックハルトとアンナ・カパソの両氏が、HIS-BRGSモデルでヒトPDXに対する免疫療法を研究する最初の共同研究を行ったことに感謝しています。この研究は、米国国立衛生研究所のP30CA06934がんセンター支援助成金によって、PHISM(前臨床ヒト免疫系マウスモデル)共有リソースRRID:SCR_021990およびフローサイトメトリー共有リソース(RRID:SCR_022035)を使用して部分的にサポートされました。この研究の一部は、契約番号75N93020C00058の下で国立衛生研究所のNIAIDによってサポートされました。

すべての動物作業は、コロラド大学デンバー校の施設動物管理および使用委員会(IACUCプロトコル#00593および#00021)によって承認された動物プロトコルの下で実施されました。すべての動物作業は、コロラド大学デンバーアンシュッツメディカルキャンパスにある米国実験動物管理協会の認定施設である実験動物資源局(OLAR)に従って実施されました。すべてのヒト臍帯血サンプルは、匿名化され...

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+human+CD34++stem+cell-engrafted+nonobese+diabetic/SCID/IL-2R&#947;null+mice+show+impaired+CD8++T+cell+maintenance+and+a+functional+arrest+of+immature+NK+cells.">Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2R&#947;null mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells.</a> The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).</li><li>Wunderlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+multilineage+human+hematopoietic+reconstitution+and+function+in+NSGS+mice.">Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice.</a> PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).</li><li>Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. 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過去6年間、免疫学とヒト化マウスの両方の専門知識を使用して、私たちの研究チームは、さまざまなヒト腫瘍の免疫療法をテストするために非常に必要な前臨床モデルを開発しました3、7、30、31。このプロトコルは、免疫療法中心のヒトT細胞集団に特に注意を払いながら、モデルの変動性を考?...

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Jordi M. Lanis1 
Matthew S. Lewis1 
Hannah Strassburger1 
Stacey M. Bagby2 
Adrian T. A. Dominguez2 
Juan A. Mar&#237;n-Jim&#233;nez3 
Roberta Pelanda1 
Todd M. Pitts2 
Julie Lang1 
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L&#8217;Hospitalet)
to:
Jordi M. Lanis1 
Matthew S. Lewis1 
Hannah Strassburger1 
Kristina Larsen1 
Stacey M. Bagby2 
Adrian T. A. Dominguez2 
Juan A. Mar&#237;n-Jim&#233;nez3 
Roberta Pelanda1 
Todd M. Pitts2 
Julie Lang1 
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L&#8217;Hospitalet)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64606">Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

マウスがんモデルは、腫瘍の成長と免疫逃避の基本的なメカニズムを確立するために重要です。しかし、マウスモデルでのがん治療研究では、同系モデルが限られており、種固有の違いがあるため、臨床への翻訳は有限です1,2。腫瘍を制御するための支配的なアプローチとしての免疫療法の出現は、機能的なヒト免疫システムを備えたin vivoモデルの必要性を繰り返し示しています。過去10年間のヒト免疫系マウス(HISマウス)の進歩により、さまざまな種類の癌および免疫療法剤におけるin vivoでの免疫腫瘍学の研究が可能になりました3、4、5、6。細胞株由来および患者由来異種移植片(それぞれCDXおよびPDX)を含むヒト腫瘍モデルは、HISマウスでよく増殖し、ほとんどの場合、ヒト造血生着を欠く免疫不全宿主における増殖とほぼ同じである7,8。この重要な発見に基づいて、研究者はHISマウスモデルを使用して、腫瘍微小環境(TME)を変化させて免疫抑制を低下させ、免疫指向性腫瘍殺傷を強化するように設計された併用療法を含むヒト免疫療法を研究しています。これらの前臨床モデルは、ヒト癌の不均一性の問題に対処するのに役立ち、治療の成功を予測し、免疫関連の薬物毒性を監視することもできます9,10。
ヒト造血幹細胞の導入によるヒト免疫系を有するマウスモデルの作製には、異種移植片を拒絶しないレシピエント免疫不全マウスが必要である。現在のHISマウスモデルは、30年以上前に報告された免疫不全マウス系統に由来します。記載された最初の免疫不全マウス系統は、T細胞およびB細胞を欠失したSCIDマウスであり11、続いて、ヒトCD47分子12,13へのNOD SIRPα対立遺伝子の結合の増加により、ヒト細胞に対するマウスマクロファージ耐性に関与するSIRPα多型を有するハイブリッドNOD-SCIDが続いた。2000年代初頭、BALB/cとNODの両方の免疫不全株におけるIL-2受容体(IL-2Rγc)の共通ガンマ鎖の欠失は、宿主NK細胞の発生を禁止する遺伝子欠失により、ヒト生着増強のゲームチェンジャーでした14,15,16,17。BRGおよびNRGマウスなどの代替モデルは、TおよびB細胞受容体遺伝子の再配列、したがってリンパ球の成熟および生存に必要なRag1またはRag2遺伝子の欠失を通じてTおよびB細胞欠損を達成する18,19。本明細書で用いられるBRGS(BALB/c -Rag2ヌルIl2RγCヌルSirpα NOD)マウスは、IL-2Rγ鎖欠損症とRag2-/-バックグラウンド上のNOD SIRPα対立遺伝子を結合し、T、B、またはNK細胞を持たないが、30週以上の長期生着を可能にするのに十分な活力と健康を備えた高度に免疫不全マウスをもたらす13。
HISマウスは複数の方法で生成することができ、ヒトPBMC注射が最も直接的な方法である15、18、20。しかし、これらのマウスは、活性化ヒトT細胞の顕著な増殖を有し、12週齢までに移植片対宿主病(GVHD)をもたらし、長期研究を妨げる。あるいは、臍帯血(CB)、骨髄、および胎児肝臓からのヒト造血幹細胞も、ヒト免疫系の生着および産生に使用することができる。このシステムでは、造血幹細胞は、主にT細胞を発達させるPBMCマウスと比較して、マウス宿主に有意に耐性のあるT、B、および自然免疫細胞の生成を伴う多系統のヒト免疫系を産生する。したがって、GVHDは存在しないか、大幅に遅延し、研究は10ヶ月齢までのマウスに拡張することができる。CBは、遺伝的に同一の免疫系を持つ複数のHISマウスの生着を促進する、CD34+ヒト造血幹細胞の簡単でアクセスしやすい非侵襲的な供給源を提供します17、18、20、21。過去数年間、HISマウスモデルは免疫療法およびTME 3,4,5,6の研究に広く使用されてきました。これらのマウスではヒト由来の免疫系が発達しているにもかかわらず、ヒト異種移植片腫瘍は対照免疫不全マウスと比較して同様の速度で成長し、生着したPDXの微小環境を維持するために重要な癌細胞と免疫細胞の間の複雑な相互作用を可能にします3,7,8.このプロトコルは、PDXおよびCDXを使用したHIS-BRGSマウスで治療をテストする50を超える研究を実施するために使用されています。重要な結論は、HISマウスのヒト腫瘍は、最初の患者サンプルおよび免疫浸潤特性に対する腫瘍の分子評価によって定義される独自のTMEを維持することである3、22、23。私たちのグループは、マルチパラメータフローサイトメトリーを使用して、免疫器官と腫瘍の両方におけるHISの詳細な評価に焦点を当てています。本明細書では、BRGSマウスのヒト化、キメラの評価、ヒト腫瘍の移植、腫瘍増殖測定、癌治療投与、およびフローサイトメトリーによるHIS細胞の解析のためのプロトコールを記載する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe w/needles</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1031815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB563792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stim Cocktail</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>509305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 Rack</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-plugged glass pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement membrane extract</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>363200502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora</td>
			<td>Cytek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-98-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic Stemcell FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10439001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106 500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Hypaque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>45001752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - fine</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;</td>
			<td>RS5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps normal</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>RS4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F75P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Glass Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1255310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pipettes</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>63A53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/ Ca &#38; Mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>55037C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DL</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5466202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgG-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>JDC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgG-unabeled</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>H2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgM-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>UHB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgM-unlabeled</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>SA-DA4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiRad 350</td>
			<td>Precision X-Ray</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec Hu FLT3L</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>308-FK-005/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec Hu IL6</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>206-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec Hu SCF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>255SC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>862945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 25 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>567-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile molecular water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeti Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12004279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Green</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>423112</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

testing cancer immunotherapeutics in a humanized mouse model bearing human tumors

腫瘍微小環境の免疫抑制性を逆転させることは、免疫療法薬による癌の治療を成功させるために重要です。マウスがんモデルは、その多様性が非常に限られており、臨床への翻訳が不十分です。免疫療法研究のためのより生理学的な前臨床モデルとして役立つために、このプロトコルは、ヒト免疫系で再構成されたマウスにおけるヒト腫瘍の治療を評価するために開発されました。このユニークなプロトコルは、ヒト免疫系(HIS、「ヒト化」)マウスの開発と、それに続く細胞株由来異種移植片(CDX)または患者由来異種移植片(PDX)のいずれかのヒト腫瘍の移植を示しています。HISマウスは、臍帯血から分離したCD34+ヒト造血幹細胞を、異種腫瘍も受け入れることができる新生児BRGS(BALB/c Rag2-/-IL2RγC-/- NODSIRPα)の高免疫不全マウスに注入することによって生成されます。ヒト免疫系の発達と腫瘍移植の動態と特性の重要性が強調されています。最後に、フローサイトメトリーを用いた腫瘍微小環境の詳細な評価について説明します。このプロトコルを使用した多数の研究では、個々の腫瘍の腫瘍微小環境がHIS-PDXマウスで再現されることがわかりました。「熱い」腫瘍は大きな免疫浸潤を示しますが、「冷たい」腫瘍はそうではありません。このモデルは、幅広いヒト腫瘍に対する併用免疫療法の試験場として機能し、個別化医療の探求における重要なツールを表しています。

脇腹腫瘍プロトコルと実験タイムライン(図1)に従って、標的チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)療法とニボルマブ併用療法に対する腫瘍増殖と免疫応答を、2つの異なるヒト結腸直腸癌(CRC)PDXで研究しました。TKI薬は、腫瘍増殖を評価するために免疫不全宿主で研究されているのは29だけです。このモデルは、TKI単独、そしてさらに重要なことに、抗PD-1との併?...

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Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

このプロトコルは、免疫腫瘍学研究のためのヒト免疫系(HIS)マウスの生成について概説しています。このモデルに移植されたヒト腫瘍に対するヒト免疫療法を試験するためのこのモデルの使用における指示および考慮事項は、腫瘍に対するヒト免疫系の応答を特徴付けることに重点を置いたものとして提示されている。

ヒト腫瘍を有するヒト化マウスモデルにおける癌免疫療法の試験

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine ...

このプロトコルは、前臨床免疫腫瘍学研究のためのヒト免疫系またはHISマウスの生成について概説しています。マウスがんモデルは多様性が限られており、臨床への変換が不十分です。この技術は、ヒト免疫系を有するマウスにおけるヒト腫瘍の治療を評価することにより、免疫療法研究の前臨床モデルとして役立つ。ヒト化マウスモデルは、多くの感染症やヒト免疫系の癌に対する反応など、ヒト免疫学の複数の側面を研究するために使用できます。信頼性が高く堅牢な臍帯血源を獲得し、免疫不全マウスコロニーの健康を維持することは困難な場合があります。フローサイトメトリーと免疫学的分析の専門知識が不可欠です。手順を実演するのは、私の研究室の研究サービスの専門家であるクリスティーナラーセンです。はじめに、臍帯血から単離したCD34陽性細胞ペレットを10〜8番目の細胞につき1回あたり300マイクロリットルの磁気細胞分離緩衝液に再懸濁する。8番目の細胞に10回あたり100マイクロリットルのFCRブロッキング試薬を加え、続いて10〜8番目の細胞に1回あたり100マイクロリットルのCD34陽性磁気ビーズを加え、摂氏4度で30分間インキュベートします。次に、8番目のセルに10回あたり5ミリリットルの磁気セルセパレータバッファーを加え、摂氏4度で360gで10分間回転させる。洗浄工程を繰り返し、未分画とラベル付けされた15ミリリットルの円錐管に1億セル当たり500マイクロリットルの磁気セル分離バッファーにペレットを再懸濁する。さらに2本の15ミリリットルチューブにラベルを付けます CD34陰性およびCD34陽性 3本のチューブを冷却ラックに置きます。バイオセーフティキャビネット内の自動磁気セルセパレーター上の2列のポジティブ選択プログラムを使用して細胞を分離します。次に、CD34陽性ヒト幹細胞を増殖・凍結するために、原稿に記載されているように臍帯血またはCB培地を調製し、0.22ミクロンのフィルターを通過させる。CD34陽性細胞をCB培地1ミリリットルあたり100, 000で再懸濁し、摂氏37度でインキュベートします。3日目に、サイトカインを含まない等量のCB培地をフラスコに加えます。5日目に、増殖したCD34陽性細胞を回収します。細胞懸濁液を上下にピペットで入れ、50ミリリットルの円錐管に集めます。フラスコの底を覆うのに十分なCB培地を追加します。セルスクレーパーを使用して、フラスコの底全体をこすります。すべての培地を同じ50ミリリットルのチューブに集め、遠心分離します。細胞を2ミリリットルのCB培地に再懸濁し、遠心分離する。培地をペレットまで吸引し、ペレットを凍結培地に再懸濁する。次に、仔の照射から3時間後にCD34陽性細胞の調製を開始する。50ミリリットルのチューブで10ミリリットルのCB培地を温めます。注入する4〜6匹の子犬ごとに、in vitroで増殖および凍結されたCD34陽性細胞のバイアルを1つ回収します。少量の氷が見えるまで摂氏50〜55度で急速に解凍し、温めたCB培地に細胞を加えます。1ミリリットルの培地を使用して各バイアルをすすぎ、細胞を360 gで摂氏4度で12分間回転させます。培地を慎重に吸引します。ペレットを2ミリリットルのCB培地に再懸濁し、細胞をカウントします。再度、細胞を遠心分離し、培地を吸引し、ペレットを100マイクロリットルの滅菌PBSに再懸濁し、1匹の子犬を加えた1匹を注入すると、マウスあたり250, 000〜450, 000個のCD34陽性細胞が得られます。マウスの血液からPBMCを単離するには、血液ヘパリンを穏やかに上下にピペッティングして混合し、界面を乱さないように注意しながら、1ミリリットルあたり1.077グラムの密度勾配を500マイクロリットルの上にゆっくりと重ねます。チューブを1, 220 gで室温で20分間遠心分離し、中断することなく遠心分離します。200マイクロリットルのピペットでバフィーコートからできるだけ多くの細胞を取り除き、750マイクロリットルの収穫培地を含む新しい1.5ミリリットルのチューブに追加します。360gで11分間遠心分離する。培地を50マイクロリットルに吸引し、ペレットを750マイクロリットルの収穫培地に再懸濁します。フローサイトメーターで各サンプル100マイクロリットルのデータを取得します。次に、fcsファイルをフローデータ編集ソフトウェアにインポートし、FSC-A対SSC-Aプロットにポリゴンゲートを適用します。軸をFSC-A対FSC-Hに変更し、線から突き出ているダブレットを除いて、直線対角線上のセルをゲートします。これらの細胞を選択し、軸をhCD45対mCD45に変更します。hCD45陽性集団にポリゴンゲートを適用し、ヒトという名前を適用します。mCD45陽性集団にポリゴンゲートを適用し、マウスという名前を適用します。ヒトとマウスの集団のカウント統計を作成します。次に、人口を選択し、軸をCD19対CD3に変更します。CD19陽性細胞にポリゴンゲートを適用し、B細胞という名前を付けます。CD3陽性集団にポリゴンゲートを適用し、T細胞という名前を付けます。次に、二重負の母集団にポリゴン ゲートを適用し、非 TB という名前を付けます。T細胞集団を選択し、軸をCD4対CD3に変更します。CD4陽性集団にポリゴンゲートを適用し、CD4陽性という名前を付けます。CD4陰性母集団にポリゴンゲートを適用し、CD8という名前を付けます。非結核集団を選択し、軸をCD56対骨髄に変更します。CD56陽性集団全体にポリゴンゲートを適用し、NK細胞と名付けます。次に、CD56陰性および骨髄陽性集団にポリゴンゲートを適用し、骨髄性という名前を付けます。すべての母集団のパーセンテージとカウント統計量のテーブルを作成し、スプレッドシートにエクスポートします。示された式を使用してhCD45キメラの割合を計算します。マウスで腫瘍細胞を増殖させ、薬物治療を行った後、組織を採取します。ピン付きのフォーム解剖板にマウスを置き、それらを所定の位置に保持し、腕と脚を45度に伸ばします。骨盤の近くからあごまで伸びる胴体の中央を切開します。皮膚を端まで引っ張り、ピンで所定の位置に保持します。細鉗子を用いて、腋窩、頸部、腸間膜、鼠径部、裂孔の順にリンパ節を摘出します。すりガラススライドの片側にリンパ節を8ミリリットルの収穫培地中のペトリ皿に入れます。つや消しの端を内側にしてスライドを垂直な角度で保持し、細胞内容物が放出されるまで組織を静かに押します。スライドを引き離して一緒に数回すすぎ、最大数のセルを解放します。5インチのガラスピペットで細胞を収集し、9インチの綿プラグピペットを通してラベルの付いた15ミリリットルの円錐形のチューブにろ過します。次に、解剖ハサミで腫瘍縁をゆっくりと切り取りながら、鉗子で腫瘍を保持して、開いた脇腹から腫瘍を抽出します。腫瘍の重量を量り、RNAおよび免疫組織化学処理のために腫瘍の1/4を除去します。腫瘍の残りの3/4を6センチメートルの皿に入れ、メスの刃を使って1ミリメートルの小片に細かく刻みます。腫瘍片を解離チューブに移します。次に、皿を不完全なTIL培地ですすぎ、チューブに追加します。コラゲナーゼ調製物を添加し、摂氏37度で30分から1時間機械的解離を使用して組織を解離させる。懸濁液を100ミクロンのフィルターにかけ、50ミリリットルの円錐管に入れ、10ミリリットルのTIL完全培地ですすいでください。DNaseを含むちょうど十分な収穫培地にペレットを遠心分離して再懸濁すると、細胞懸濁液がP1000ピペットチップを簡単に通過し、下流分析のために容量を記録できます。PDX CRC 307Pでは、併用治療は、経時的な腫瘍増殖量、腫瘍重量、および比増殖速度によって決定されるように、腫瘍の成長を遅らせた。マウスの異なるコホートで試験したPDX CRC 307Mは、HIS BRGSマウスにおける同じ併用治療による影響が少なかった。腫瘍移植前の血液中の全体的なヒトhCD45陽性およびヒトT細胞hCD3陽性キメラに基づくと、治療されたCRC 307P保有マウスと組み合わせた末梢免疫系およびTILの両方のパラメータが増加しましたが、CRC 307Mモデルは増加しませんでした。ヒトT細胞の調査では、CRC 307P腫瘍でより多くの活性化T細胞が明らかになりましたが、併用治療マウスのリンパ液は見つかりませんでした。また、併用処理されたCRC 307P腫瘍では、より多くのエフェクターメモリーCD8陽性T細胞およびより少ないTIM-3陽性T細胞があった。対照的に、この違いはCRC 307Mモデルでは認められませんでした。さらに、併用処理マウスの間では細胞傷害性T細胞集団の頻度に変化は観察されなかったが、未処置ではより高い細胞傷害性T細胞が観察された。併用治療は、CRC 307Pリンパ器官または腫瘍のいずれにおいてもTregの頻度に影響しなかったが、CRC 307MデータはTregsの減少傾向を示した。腫瘍細胞における免疫関連の変化は、フローサイトメトリーを用いて上昇した。MHCクラスIおよびクラスIIの発現の増加は、併用処理されたHIS BRGSマウスから摘出したCRC 307P腫瘍細胞上で観察された。CRC 307Mモデルでは、同じ薬物治療が腫瘍細胞上でHLAクラスII発現を誘導した。同様に、併用治療は、EpCAM陽性CRC 307P腫瘍細胞上でのPD−L1発現の増加をもたらした。最後に、免疫応答と腫瘍増殖との相関関係を調べた。CD4陽性T細胞の増加は、より小さな腫瘍増殖、より具体的には組み合わせ処理されたHISマウスにおけるHLA-DR陽性活性化T細胞と有意な相関を示した。CD34陽性細胞を単離しながらの滅菌技術は、マウスとしては極めて免疫不全である。結果として生じるキメラは、臍帯血ドナー内および臍帯血ドナー間で変動し、T細胞が最も大きな変動を有する。無制限の免疫療法の組み合わせ、ならびに機構的および薬物投与動態学的研究、例えばそれらの役割を確認するためのCD8 T細胞の欠失を実施することができる。重要なことに、薬物関連の毒性も研究することができます。これは、臨床への翻訳のためにヒト免疫療法をテストするための、より関連性が高くアクセスしやすい前臨床モデルを提供しました。これらのデータに基づいて、現在いくつかの臨床試験が進行中です。

Research

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In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

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大腸-26癌腫瘍を有するがん悪液質の研究のためのモデルとしてマウスを

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Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

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