Name: testing cancer immunotherapeutics in a humanized mouse model bearing human tumors
Uploaded: 2022-12-16T13:50:00
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우리 생쥐를 돌봐준 동물 연구 시설(OLAR)과 우리 연구소의 암 센터 지원 보조금(P30CA046934)이 지원하는 유세포 분석 공유 자원에 감사드립니다. 우리는 또한 HIS-BRGS 모델에서 인간 PDX에 대한 면역 요법을 연구하는 첫 번째 협력에 대해 Gail Eckhardt와 Anna Capasso에게 감사를 표합니다. 이 연구는 PHISM(전임상 인간 면역 체계 마우스 모델) 공유 리소스, RRID: SCR_021990 및 유세포 분석 공유 리소스, RRID: SCR_022035를 사용하여 국립 보건원 P30CA06934 암 센터 지원 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 이 연구는 계약 번호 75N93020C00058에 따라 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 NIAID에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

모든 동물 작업은 콜로라도 대학교 덴버 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC 프로토콜 #00593 및 #00021)에서 승인한 동물 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 작업은 콜로라도 대학교 덴버 안슈츠 메디컬 캠퍼스에 있는 미국 실험동물 관리 협회(American Association for Laboratory Animal Care)의 공인 시설인 OLAR(Office of Laboratory Animal Resources)에 따라 수행되었습니다. 모든 인간 제대혈 샘플은 신원이 확?...

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	<li>Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+tumor+models+for+advanced+cancer+immunotherapy.">Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).</li><li>Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+cancer+immunotherapy+research.">Mouse models for cancer immunotherapy research.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).</li><li>Marin-Jimenez, J. 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지난 6 년 동안 면역학 및 인간화 마우스에 대한 전문 지식을 사용하여 우리 연구팀은 다양한 인간 종양 3,7,30,31에 대한 면역 요법을 테스트하기 위해 필요한 전임상 모델을 개발했습니다. 이 프로토콜은 면역 요법 중심의 인간 T 세포 집단에 특별한 주의를 기울여 모델의 가변성에 대한 고려를 강조합...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64606">Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors</a>. The Authors section was updated from:
Jordi M. Lanis1 
Matthew S. Lewis1 
Hannah Strassburger1 
Stacey M. Bagby2 
Adrian T. A. Dominguez2 
Juan A. Mar&#237;n-Jim&#233;nez3 
Roberta Pelanda1 
Todd M. Pitts2 
Julie Lang1 
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L&#8217;Hospitalet)
to:
Jordi M. Lanis1 
Matthew S. Lewis1 
Hannah Strassburger1 
Kristina Larsen1 
Stacey M. Bagby2 
Adrian T. A. Dominguez2 
Juan A. Mar&#237;n-Jim&#233;nez3 
Roberta Pelanda1 
Todd M. Pitts2 
Julie Lang1 
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L&#8217;Hospitalet)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64606">Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

마우스 암 모델은 종양 성장 및 면역 탈출의 기본 메커니즘을 확립하는 데 중요합니다. 그러나 마우스 모델에 대한 암 치료 연구는 제한된 syngeneic 모델과 종 특이적 차이로 인해 임상에 유한한 번역을 산출했습니다 1,2. 종양을 제어하기 위한 지배적인 접근 방식으로 면역 요법의 출현은 기능적인 인간 면역 체계를 갖춘 생체 내 모델의 필요성을 반복했습니다. 지난 10년 동안 인간 면역계 마우스(HIS 마우스)의 발전으로 생체 내에서 매우 다양한 암 유형 및 면역치료제 3,4,5,6에서 면역종양학을 연구하는 것이 가능해졌다. 세포주 유래 및 환자 유래 이종이식 (각각 CDX 및 PDX)을 포함한 인간 종양 모델은 HIS 마우스에서 잘 성장하며, 대부분의 경우 인간 조혈 생착이 결여된 면역결핍 숙주에서의 성장과 거의 동일하다7,8. 이 주요 발견을 바탕으로 연구자들은 HIS 마우스 모델을 사용하여 면역 억제를 감소시키고 면역 유도 종양 사멸을 향상시키기 위해 종양 미세 환경(TME)을 변경하도록 설계된 병용 요법을 포함하여 인간 면역 요법을 연구해 왔습니다. 이러한 전임상 모델은 인간 암의 이질성 문제를 해결하는 데 도움이 되며, 치료 성공을 예측할 수 있을 뿐만 아니라 면역 관련 약물 독성을 모니터링할 수도 있습니다 9,10.
인간 조혈모세포의 도입을 통해 인간 면역계를 갖는 마우스 모델을 제작하기 위해서는 이종이식편을 거부하지 않는 수용자 면역결핍 마우스가 필요하다. 현재 HIS 마우스 모델은 30년 전에 보고된 면역결핍 마우스 균주에서 파생됩니다. 기술된 최초의 면역결핍 마우스 균주는 T 및 B 세포가 결여된 SCID 마우스였다11, 인간 CD47 분자12,13에 대한 NOD SIRPα 대립유전자에 대한 결합 증가로 인해 인간 세포에 대한 마우스 대식세포 내성을 담당하는 SIRPα 다형성을 갖는 하이브리드 NOD-SCID가 뒤따랐다. 2000년대 초반, BALB/c 및 NOD 면역결핍 균주 모두에서 IL-2 수용체(IL-2Rγc)의 공통 감마 사슬의 결실은 숙주 NK 세포 발달을 금지하는 유전자 결실로 인해 인간 생착 강화를 위한 게임 체인저였습니다14,15,16,17. BRG 및 NRG 마우스와 같은 대체 모델은 T 및 B 세포 수용체 유전자 재배열 및 림프구의 성숙 및 생존에 필요한 Rag1 또는 Rag2 유전자의 결실을 통해 T 및 B 세포 결핍을 달성한다18,19. 본원에 사용된 BRGS(BALB/c -Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD) 마우스는 IL-2Rγ 사슬 결핍과 Rag2-/- 배경에NOD SIRPα 대립유전자를 결합하여 T, B 또는 NK 세포가 없지만 30주 이상의 장기 생착을 허용하기에 충분한 활력과 건강을 가진 고면역 결핍 마우스를 생성한다13.
HIS 마우스는 다양한 방식으로 생성될 수 있으며, 인간 PBMC 주사가 가장 직접적인 방법이다15,18,20. 그러나 이 마우스는 활성화된 인간 T 세포의 뚜렷한 확장을 가지고 있어 생후 12주까지 이식편대숙주병(GVHD)을 유발하여 장기 연구를 방해합니다. 대안적으로, 제대혈 (CB), 골수 및 태아 간으로부터의 인간 조혈 줄기 세포는 또한 인간 면역계의 생착 및 새로운 생산을 위해 사용될 수 있다. 이 시스템에서 조혈 줄기 세포는 대부분 T 세포를 발달시키는 PBMC 마우스에 비해 마우스 숙주에 중요하게 내성이 있는 T, B 및 선천성 면역 세포의 생성과 함께 다중 계통 인간 면역 체계를 생성합니다. 따라서 GVHD는 없거나 크게 지연되며 연구는 생후 10개월까지 마우스로 확장될 수 있습니다. CB는 유전적으로 동일한 면역계를 가진 다수의 HIS 마우스의 생착을 용이하게 하는 CD34+ 인간 조혈 줄기 세포의 용이하고, 접근하기 쉽고, 비침습적인 공급원을 제공한다 17,18,20,21. 지난 몇 년 동안, HIS 마우스 모델은 면역요법 및 TME 3,4,5,6을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 이들 마우스에서 인간 유래 면역계의 발달에도 불구하고, 인간 이종이식 종양은 대조군 면역결핍 마우스와 유사한 속도로 성장하고, 암세포와 면역 세포 사이의 복잡한 상호작용을 허용하며, 이는 생착된 PDX 3,7,8의 미세환경을 유지하는 데 중요하다 . 이 프로토콜은 PDX 및 CDX가 있는 HIS-BRGS 마우스에서 치료를 테스트하는 50개 이상의 연구를 수행하는 데 사용되었습니다. 중요한 결론은 HIS 마우스의 인간 종양이 초기 환자 샘플 및 면역 침윤 특성에 대한 종양의 분자 평가에 의해 정의된 바와 같이 그의 독특한 TME를 유지한다는것이다 3,22,23. 우리 그룹은 다중 매개변수 유세포 분석을 사용하여 면역 기관과 종양 모두에서 HIS에 대한 심층 평가에 중점을 둡니다. 본원에서, 우리는 BRGS 마우스의 인간화, 키메라즘의 평가, 인간 종양의 이식, 종양 성장 측정, 암 치료 투여, 및 유세포 분석에 의한 HIS 세포의 분석을 위한 프로토콜을 기술한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe w/needles</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1031815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB563792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stim Cocktail</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>509305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 Rack</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-plugged glass pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement membrane extract</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>363200502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora</td>
			<td>Cytek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-98-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic Stemcell FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10439001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106 500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Hypaque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>45001752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - fine</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;</td>
			<td>RS5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps normal</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>RS4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F75P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Glass Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1255310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pipettes</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>63A53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/ Ca &#38; Mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>55037C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DL</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5466202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgG-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>JDC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgG-unabeled</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>H2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgM-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>UHB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgM-unlabeled</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>SA-DA4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiRad 350</td>
			<td>Precision X-Ray</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec Hu FLT3L</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>308-FK-005/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec Hu IL6</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>206-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec Hu SCF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>255SC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>862945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 25 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>567-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile molecular water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeti Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12004279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Green</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>423112</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

testing cancer immunotherapeutics in a humanized mouse model bearing human tumors

종양 미세 환경의 면역 억제 특성을 역전시키는 것은 면역 요법 약물로 암을 성공적으로 치료하는 데 중요합니다. 쥐암 모델은 다양성이 극히 제한적이며 클리닉으로의 번역이 좋지 않습니다. 면역요법 연구를 위한 보다 생리학적인 전임상 모델 역할을 하기 위해, 이 프로토콜은 인간 면역계로 재구성된 마우스에서 인간 종양의 치료를 평가하기 위해 개발되었습니다. 이 독특한 프로토콜은 인간 면역계(HIS, "인간화") 마우스의 발달에 이어 세포주 유래 이종이식(CDX) 또는 환자 유래 이종이식(PDX)과 같은 인간 종양을 이식하는 것을 보여줍니다. HIS 마우스는 제대혈에서 분리된 CD34+ 인간 조혈 줄기 세포를 이종 종양도 수용할 수 있는 고면역 결핍 신생아 BRGS(BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα)에 주입하여 생성됩니다. 인간 면역체계의 동역학 및 특성의 발달 및 종양 이식의 중요성이 강조된다. 마지막으로, 유세포 분석을 이용한 종양 미세 환경에 대한 심층 평가가 설명됩니다. 이 프로토콜을 사용하는 수많은 연구에서 개별 종양의 종양 미세 환경이 HIS-PDX 마우스에서 요약된다는 것이 밝혀졌습니다. "뜨거운" 종양은 큰 면역 침윤을 나타내지만 "차가운" 종양은 그렇지 않습니다. 이 모델은 광범위한 인간 종양에 대한 병용 면역 요법의 시험장 역할을 하며 개인화된 의학을 찾는 데 중요한 도구입니다.

측면 종양 프로토콜 및 실험 타임라인(그림 1)에 따라 표적 티로신 키나제 억제제(TKI) 요법과 니볼루맙 병용 치료에 대한 종양 성장 및 면역 반응이 두 가지 별개의 인간 결장직장암(CRC) PDX에서 연구되었습니다. TKI 약물은 종양 성장을 평가하기 위해 면역 결핍 숙주에서 연구되었습니다29. 이 모델은 TKI 단독, 그리고 더 중요하게는 항-PD-1과 조합하여 면역 반?...

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Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

이 프로토콜은 면역 종양학 연구를 위한 인간 면역 체계(HIS) 마우스의 생성을 간략하게 설명합니다. 이 모델에 이식된 인간 종양에 대한 인간 면역치료제를 시험하기 위한 이 모델의 사용에 있어서의 지침 및 고려사항은 종양에 대한 인간 면역계의 반응을 특성화하는 것에 중점을 두고 제시된다.

인간 종양을 지닌 인간화 마우스 모델에서 암 면역 치료제 테스트

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine ...

이 프로토콜은 전임상 면역 종양학 연구를 위한 인간 면역 체계 또는 HIS 마우스의 생성을 간략하게 설명합니다. 마우스 암 모델은 다양성이 제한되어 있으며 클리닉으로 잘 번역되지 않습니다. 이 기술은 인간 면역 체계를 가진 마우스에서 인간 종양의 치료를 평가함으로써 면역 요법 연구를 위한 전임상 모델 역할을 합니다.인간화 마우스 모델은 많은 감염 또는 인간 면역계의 암에 대한 반응을 포함하여 인간 면역학의 여러 측면을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 신뢰할 수 있고 강력한 제대혈 공급원을 확보하고 면역결핍 마우스 군집의 건강을 유지하는 것은 어려울 수 있습니다. 유세포 분석 및 면역학적 분석에 대한 전문 지식이 필수적입니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 서비스 전문가 인 Kristina Larsen이 될 것입니다. 시작하여, 제대혈로부터 분리된 CD34 양성 세포 펠렛을 300 마이크로리터의 자기 세포 분리막 완충액에 1회 10 내지 8번째 세포에 재현탁시킨다. 여덟 번째 세포에 1 회 10 회 당 100 마이크로 리터의 FCR 차단 시약을 첨가 한 다음, 제 8 세포에 1 회 10 회 당 100 마이크로 리터의 CD34 양성 자기 비드를 첨가하고, 섭씨 4도에서 30 분 동안 배양한다.다음으로, 여덟 번째 셀에 1 회 10 당 5 밀리리터의 자기 세포 분리기 버퍼를 추가하고, 섭씨 4도에서 10 분 동안 360g에서 회전시킨다. 세척 단계를 반복하고 미분획으로 표지된 15밀리리터 원뿔형 튜브에 자기 세포 분리기 버퍼 1억 셀당 500마이크로리터의 펠릿을 재현탁합니다. 15밀리리터 튜브 2개 더 CD34 음성 및 CD34 양성 레이블 지정 3개의 튜브를 냉각 랙에 놓습니다.생물 안전 캐비닛의 자동 자기 세포 분리기에서 2 컬럼 양성 선택 프로그램을 사용하여 세포를 분리합니다. 다음에, CD34 양성 인간 줄기세포를 확장 및 동결시키기 위해, 원고에 기재된 바와 같이 제대혈 또는 CB 배지를 준비하고, 0.22 미크론 필터를 통과시킨다. CD34 양성 세포를 CB 배지 밀리리터 당 100, 000에서 재현탁하고 섭씨 37도에서 배양합니다.3일째에, 사이토카인이 없는 동일한 부피의 CB 배지를 플라스크에 첨가한다. 5일째에 확장된 CD34 양성 세포를 채취합니다. 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하고 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 수집합니다.플라스크 바닥을 덮을 수 있도록 충분한 CB 매체를 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플라스크의 바닥 전체를 긁어냅니다. 모든 매체를 동일한 50밀리리터 튜브에 수집하고 원심분리합니다.세포를 2 밀리리터의 CB 배지에 재현탁하고, 원심 분리한다. 배지를 펠릿까지 흡인하고 펠릿을 동결 매체에 재현탁합니다. 다음으로, 강아지 방사선 조사 후 3 시간 후에 CD34 양성 세포 준비를 시작하십시오.50 밀리리터 튜브에 10 밀리리터의 CB 매체를 따뜻하게합니다. 주사할 새끼 4-6마리마다 시험관 내 확장 및 냉동 CD34 양성 세포 바이알 1개를 회수합니다. 소량의 얼음이 보일 때까지 섭씨 50도에서 55도까지 빠르게 해동하고 세포를 데운 CB 배지에 첨가하십시오.1 밀리리터의 배지를 사용하여 각 바이알을 헹구고 섭씨 4도에서 12 분 동안 360g에서 세포를 회전시킵니다. 매체를 조심스럽게 흡인하십시오. 펠릿을 2 밀리리터의 CB 배지에 재현 탁하고 세포를 계수합니다.다시, 세포를 원심분리하고, 배지를 흡인하고, 펠릿을 n개당 100 마이크로리터의 멸균 PBS에 주입하기 위해 1마리의 새끼를 더한 상태로 재현탁하여, 마우스당 250, 000 내지 450, 000개의 CD34-양성 세포를 생성한다. 마우스 혈액에서 PBMC 분리를 위해 혈액 헤파린을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합하고 계면을 방해하지 않도록 주의하면서 밀리리터당 1.077g의 밀도 구배 500마이크로리터 위에 천천히 오버레이합니다. 튜브를 1, 220g에서 실온에서 20분 동안 쉬지 않고 원심분리합니다.200 마이크로 리터 피펫으로 버피 코트에서 가능한 한 많은 세포를 제거하고 750 마이크로 리터의 수확 배지가 들어있는 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 추가합니다. 360g에서 11분 동안 원심분리합니다. 배지를 50 마이크로리터로 흡인하고, 750 마이크로리터의 수확 배지에 펠릿을 재현탁시킨다.유세포 분석기에서 각 샘플의 100마이크로리터에 대한 데이터를 수집합니다. 그런 다음 fcs 파일을 유동 데이터 편집 소프트웨어로 가져오고 FSC-A 대 SSC-A 플롯에 폴리곤 게이트를 적용합니다. 축을 FSC-A 대 FSC-H로 변경하고 선에서 돌출된 이중선을 제외하고 선형 대각선의 셀을 게이트합니다.이 셀을 선택하고 축을 hCD45 대 mCD45로 변경합니다. hCD45 양성 집단에 다각형 게이트를 적용하고 human이라는 이름을 적용합니다. mCD45 양성 모집단에 다각형 게이트를 적용하고 mouse라는 이름을 적용합니다.인간 및 마우스 개체군에 대한 계수 통계를 만듭니다. 다음으로, 인간 모집단을 선택하고 축을 CD19 대 CD3로 변경합니다. CD19 양성 세포에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 B 세포로 지정합니다.CD3 양성 집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 T-세포로 지정합니다. 그런 다음 이중 음수 모집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 non-TB로 지정합니다. T 세포 집단을 선택하고 축을 CD4 대 CD3로 변경합니다.CD4 양성 모집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 CD4 양성으로 지정합니다. CD4 음성 모집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 CD8로 지정합니다. TB가 아닌 모집단을 선택하고 축을 CD56 대 골수로 변경합니다.전체 CD56 양성 집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 NK 세포로 지정합니다. 그런 다음 CD56 음성 및 골수 양성 집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 myeloid로 지정합니다. 모든 모집단의 백분율 및 개수 통계에 대한 표를 만들고 스프레드시트로 내보냅니다.표시된 공식을 사용하여 hCD45 키메라 비율을 계산하십시오. 마우스에서 종양 세포를 성장시키고 약물 치료를 한 후 조직을 수확합니다. 마우스를 핀이 있는 폼 해부 보드에 올려 제자리에 고정하고 팔과 다리를 45도로 뻗습니다.골반 근처에서 시작하여 턱까지 뻗어 있는 몸통 중앙을 절개합니다. 피부를 가장자리로 당기고 핀으로 제자리에 고정하십시오. 미세 집게를 사용하여 겨드랑이, 자궁경부, 장간막, 사타구니, 열공 순으로 림프절을 추출합니다.젖빛 유리 슬라이드의 한쪽면에 림프절을 8 밀리리터의 수확 배지에 페트리 접시에 놓습니다. 서리로 덥은 가장자리가 안쪽으로 향하도록 슬라이드를 수직 각도로 잡고 세포 내용물이 방출 될 때까지 조직을 부드럽게 누릅니다. 슬라이드를 떼어내고 함께 당겨 여러 번 헹구어 최대 수의 셀을 분리합니다.5인치 유리 피펫으로 세포를 수집하고 9인치 면 플러그 피펫을 통해 라벨이 붙은 15밀리리터 원뿔형 튜브로 여과합니다. 다음으로, 집게로 종양을 잡고 해부 가위로 종양 가장자리를 천천히 잘라내어 열린 옆구리에서 종양을 추출합니다. 종양의 무게를 측정하고 RNA 및 면역조직화학 처리를 위해 종양의 1/4을 제거합니다.종양의 나머지 3/4을 6 센티미터 접시에 넣고 메스 블레이드를 사용하여 1 밀리미터 조각으로 다진다. 종양 조각을 해리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 불완전한 TIL 매체로 접시를 헹구고 튜브에 넣으십시오.콜라게나제 제제를 첨가하고, 섭씨 37도에서 30분 내지 1시간 동안 기계적 해리를 이용하여 조직을 해리시킨다. 100미크론 필터 위의 현탁액을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 통과시키고 10밀리리터의 TIL 완전 매체로 필터를 헹굽니다. DNase를 사용하여 충분한 수확 배지에서 펠릿을 원심분리하고 재현탁하여 세포 현탁액이 P1000 피펫 팁을 쉽게 통과하고 다운스트림 분석을 위해 부피를 기록할 수 있도록 합니다.PDX CRC 307P에서, 병용 처리는 시간 경과에 따른 종양 성장 부피, 종양 중량 및 특이적 성장 속도에 의해 결정된 바와 같이, 종양의 성장을 늦췄다. 상이한 마우스 코호트에서 시험된 PDX CRC 307M은 HIS BRGS 마우스에서 동일한 조합 처리에 의해 덜 영향을 받았다. 종양 이식 전 혈액에서 전체 인간 hCD45 양성 및 인간 T 세포 hCD3 양성 키메라에 기초하여, 두 매개변수 모두 처리된 CRC 307P-함유 마우스와 조합하여 말초 면역계 및 TIL에서 증가했지만, CRC 307M 모델은 증가하지 않았다.인간 T 세포에 대한 조사는 CRC 307P 종양에서 더 많은 활성화된 T 세포를 밝혀냈지만 병용 처리된 마우스의 림프는 나타내지 않았습니다. 또한, 조합 처리된 CRC 307P 종양에서 더 많은 이펙터 기억 CD8 양성 T 세포와 더 적은 TIM-3 양성 T 세포가 있었다. 대조적으로, 이 차이는 CRC 307M 모델에서는 언급되지 않았다.또한, 병용 처리된 마우스에서는 세포독성 T 세포 집단의 빈도 변화가 관찰되지 않았지만, 처리되지 않은 마우스에서는 더 높은 세포독성 T 세포가 관찰되었습니다. 병용 치료는 CRC 307P 림프 기관 또는 종양에서 Treg의 빈도에 영향을 미치지 않았지만, CRC 307M 데이터는 Treg가 감소하는 경향을 보였다. 종양 세포의 면역 관련 변화는 유세포 분석을 사용하여 상승되었습니다.MHC 클래스 I 및 클래스 II의 증가된 발현이 조합 처리된 HIS BRGS 마우스로부터 절제된 CRC 307P 종양 세포 상에서 관찰되었다. CRC 307M 모델에서, 동일한 약물 처리가 종양 세포 상에서 HLA 클래스 II 발현을 유도하였다. 유사하게, 병용 처리는 EpCAM-양성 CRC 307P 종양 세포 상에서 증가된 PD-L1 발현을 초래하였다.마지막으로, 면역 반응과 종양 성장의 상관 관계를 조사했습니다. 증가된 CD4-양성 T-세포는 더 작은 종양 성장, 보다 구체적으로는 조합 처리된 HIS 마우스에서 HLA-DR-양성 활성화된 T-세포와 유의한 상관관계를 나타내었다. CD34 양성 세포를 단리하면서 멸균 기술, 마우스는 극도로 면역 결핍되어 있습니다.결과적인 키메라즘은 제대혈 기증자 내에서 그리고 제대혈 기증자 사이에서 가변적이며 T 세포는 가장 큰 변이를 가지고 있습니다. 무제한 면역 요법 조합뿐만 아니라 기계 론적 및 약물 투여 동역학 연구, 예를 들어 CD8 T 세포의 결실을 수행하여 그 역할을 확인할 수 있습니다. 중요한 것은 약물 관련 독성도 연구 할 수 있다는 것입니다.그것은 임상으로의 번역을 위해 인간 면역 요법을 테스트하기 위해 보다 관련성이 높고 접근 가능한 전임상 모델을 제공했습니다. 이러한 데이터를 기반으로 현재 여러 임상 시험이 진행 중입니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

췌장암의 형광 동소 이식 마우스 모델

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

연구

암 연구학

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

종양의 전이에 저산소증의 테스트 효과에 대한 생체 내 모델에서

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

콜론-26 암 종양 베어링 암 악액질의 연구를위한 모델로 마우스를

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

인간의 맨 틀 세포 림프 종의이 종이 식 마우스 모델에서 종양 Engraftment

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 번역 면역 종양학에 대한 인간화 제종이식 모델 (I-O) 연구

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

허혈 재관류 손상의 설정에서 전이성 간 종양의 뮤린 모델

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

부인과 및 유방암 종양에서 암 줄기 세포 구체 획득

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

환자 유래 신경종 줄기 세포를 사용하여 GBM에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하는 신속한 선별 워크플로우

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

High-Resolution Ultrasonography for the Analysis of Orthotopic ATC Tumors in a Genetically Engineered Mouse Model

유전자 조작 마우스 모델에서 동소 ATC 종양 분석을 위한 고해상도 초음파 검사

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes ...