Name: testing cancer immunotherapeutics in a humanized mouse model bearing human tumors
Uploaded: 2022-12-16T13:50:00
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Gostaríamos de agradecer tanto ao Animal Research Facility (OLAR) por seu cuidado com nossos camundongos, quanto ao Flow Cytometry Shared Resource apoiado pelo Cancer Center Support Grant (P30CA046934) em nosso instituto por sua imensa ajuda em todo o nosso trabalho. Também agradecemos a Gail Eckhardt e Anna Capasso por nossas colaborações inaugurais estudando imunoterapias para PDXs humanos em nosso modelo HIS-BRGS. Este estudo foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health P30CA06934 Cancer Center Support Grant com o uso do PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models) Shared Resource, RRID: SCR_021990 and Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035. Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo NIAID dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de contrato 75N93020C00058.

Todo o trabalho com animais foi realizado sob protocolos animais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado Denver (Protocolos IACUC #00593 e #00021). Todo o trabalho com animais foi realizado de acordo com o Office of Laboratory Animal Resources (OLAR), uma instalação credenciada pela American Association for Laboratory Animal Care, na University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus. Todas as amostras de sangue do cordão umbilical humano foram obtidas como doa?...

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	<li>Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+tumor+models+for+advanced+cancer+immunotherapy.">Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).</li><li>Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+cancer+immunotherapy+research.">Mouse models for cancer immunotherapy research.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).</li><li>Marin-Jimenez, J. 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Nos últimos 6 anos, usando nossa experiência em imunologia e camundongos humanizados, nossa equipe de pesquisa desenvolveu um modelo pré-clínico muito necessário para testar imunoterapias em uma variedade de tumores humanos 3,7,30,31. Este protocolo enfatiza a consideração da variabilidade do modelo, com especial atenção às populações de células T humanas centradas na imunoterapia....

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64606">Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors</a>. The Authors section was updated from:
Jordi M. Lanis1 
Matthew S. Lewis1 
Hannah Strassburger1 
Stacey M. Bagby2 
Adrian T. A. Dominguez2 
Juan A. Mar&#237;n-Jim&#233;nez3 
Roberta Pelanda1 
Todd M. Pitts2 
Julie Lang1 
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L&#8217;Hospitalet)
to:
Jordi M. Lanis1 
Matthew S. Lewis1 
Hannah Strassburger1 
Kristina Larsen1 
Stacey M. Bagby2 
Adrian T. A. Dominguez2 
Juan A. Mar&#237;n-Jim&#233;nez3 
Roberta Pelanda1 
Todd M. Pitts2 
Julie Lang1 
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus 
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L&#8217;Hospitalet)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64606">Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

Modelos de câncer em camundongos são importantes para estabelecer mecanismos básicos de crescimento tumoral e escape imunológico. No entanto, estudos de tratamento de câncer em modelos murinos têm produzido tradução finita para a clínica devido a modelos singênicos limitados e diferenças espécie-específicas 1,2. O surgimento das imunoterapias como abordagem dominante para o controle de tumores tem reiterado a necessidade de um modelo in vivo com sistema imune humano funcional. Os avanços em camundongos do sistema imunológico humano (camundongos HIS) na última década tornaram possível o estudo da imuno-oncologia in vivo em uma ampla variedade de tipos de câncer e agentes imunoterápicos3,4,5,6. Modelos tumorais humanos, incluindo xenoenxertos derivados de linhagem celular e derivados de pacientes (CDX e PDX, respectivamente), crescem bem em camundongos HIS e, na maioria dos casos, são quase idênticos ao seu crescimento no hospedeiro imunodeficiente sem enxerto hematopoiético humano 7,8. Com base nesta descoberta chave, os pesquisadores têm usado o modelo do rato HIS para estudar imunoterapias humanas, incluindo terapias combinadas projetadas para alterar o microambiente tumoral (TME) para diminuir a imunossupressão e, assim, aumentar a morte do tumor imune-dirigido. Esses modelos pré-clínicos ajudam a abordar as questões de heterogeneidade dos cânceres humanos e também podem prever o sucesso do tratamento, bem como monitorar as toxicidades de drogas relacionadas à imunidade 9,10.
A produção de um modelo de camundongo com sistema imune humano através da introdução de células-tronco hematopoéticas humanas requer um camundongo receptor imunodeficiente que não rejeite o xenoenxerto. Os modelos atuais de camundongos HIS são derivados de cepas de camundongos imunodeficientes que foram relatadas há mais de 30 anos. A primeira linhagem imunodeficiente de camundongo descrita foi a de camundongos SCID que não possuíam células T e B11, seguida por um híbrido NOD-SCID com polimorfismo SIRPα responsável pela tolerância de macrófagos de camundongos a células humanas, devido à maior ligação do alelo NOD SIRPα à molécula CD47 humana12,13. No início dos anos 2000, a deleção da cadeia gama comum do receptor de IL-2 (IL-2Rγc) em cepas imunodeficientes de BALB/c e NOD foi um divisor de águas para o aumento do enxerto humano, devido às deleções genéticas que proibiam o desenvolvimento de células NK hospedeiras14,15,16,17. Modelos alternativos, como camundongos BRG e NRG, alcançam a deficiência de células T e B por meio da deleção do gene Rag1 ou Rag2, necessários para rearranjos gênicos de receptores de células T e B e, consequentemente, maturação e sobrevivência dos linfócitos18,19. O camundongo BRGS (BALB/c -Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD) aqui utilizado combina a deficiência da cadeia IL-2Rγ e o aleloNOD SIRPα no fundo Rag2-/-, resultando em um camundongo altamente imunodeficiente sem células T, B ou NK, mas com vigor e saúde suficientes para permitir enxertia de longo prazo de mais de 30 semanas13.
Camundongos HIS podem ser gerados de múltiplas maneiras, sendo a injeção humana de CMSP o método mais direto15,18,20. No entanto, esses camundongos têm uma expansão pronunciada de células T humanas ativadas que resulta em doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) até 12 semanas de idade, impedindo estudos de longo prazo. Alternativamente, células-tronco hematopoéticas humanas do sangue do cordão umbilical (CB), medula óssea e fígado fetal também podem ser usadas para enxerto e produção do sistema imunológico humano de novo. Nesse sistema, as células-tronco hematopoéticas produzem um sistema imunológico humano de várias linhagens com a geração de células T, B e imunes inatas que são significativamente tolerantes ao hospedeiro de camundongos, em comparação com os camundongos PBMC que desenvolvem principalmente células T. Portanto, a DECH está ausente ou muito atrasada, e os estudos podem ser estendidos a camundongos até 10 meses de idade. A CB fornece uma fonte fácil, acessível e não invasiva de células-tronco hematopoéticas humanas CD34+ que facilita o enxerto de múltiplos camundongos HIS com sistemas imunológicos geneticamente idênticos 17,18,20,21. Nos últimos anos, modelos de camundongos HIS têm sido amplamente utilizados para estudar a imunoterapia e a ETM3,4,5,6. Apesar do desenvolvimento de sistemas imunes derivados de humanos nesses camundongos, os tumores de xenoenxertos humanos crescem em taxas semelhantes aos camundongos imunodeficientes controle e permitem a complexa interação entre as células cancerosas e as células imunes, o que é importante para a manutenção do microambiente da PDX enxertada3,7,8 . Este protocolo foi utilizado para realizar mais de 50 estudos testando tratamentos em camundongos HIS-BRGS com PDXs e CDXs. Uma conclusão importante é que os tumores humanos em camundongos HIS mantêm sua ETM única, definida pela avaliação molecular do tumor em relação à amostra inicial do paciente e características do infiltrado imune3,22,23. Nosso grupo se concentra na avaliação aprofundada do SIH em ambos os órgãos imunes e no tumor usando citometria de fluxo multiparâmetro. Neste trabalho, descrevemos um protocolo para humanização de camundongos BRGS, avaliação de quimerismo, implantação de tumores humanos, medidas de crescimento tumoral, administração de tratamento de câncer e análise de células HIS por citometria de fluxo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe w/needles</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1031815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB563792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stim Cocktail</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>509305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 Rack</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-plugged glass pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement membrane extract</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>363200502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora</td>
			<td>Cytek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-98-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic Stemcell FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10439001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>100-106 500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Hypaque</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>45001752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - fine</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;</td>
			<td>RS5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps normal</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>RS4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>F75P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Glass Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1255310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass pipettes</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>63A53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/ Ca &#38; Mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>55037C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25060CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>401108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DL</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5466202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgG-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>JDC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgG-unabeled</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>H2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgM-AP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>UHB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human IgM-unlabeled</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>SA-DA4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiRad 350</td>
			<td>Precision X-Ray</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-nitrophenyl substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec Hu FLT3L</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>308-FK-005/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec Hu IL6</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>206-IL-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rec Hu SCF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>255SC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8047-15-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>862945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes 25 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>567-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile molecular water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeti Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12004279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Green</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>423112</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

testing cancer immunotherapeutics in a humanized mouse model bearing human tumors

A reversão da natureza imunossupressora do microambiente tumoral é crítica para o sucesso do tratamento de cânceres com drogas imunoterápicas. Os modelos de câncer murino são extremamente limitados em sua diversidade e sofrem de má tradução para a clínica. Para servir como um modelo pré-clínico mais fisiológico para estudos de imunoterapia, este protocolo foi desenvolvido para avaliar o tratamento de tumores humanos em um camundongo reconstituído com um sistema imunológico humano. Este protocolo único demonstra o desenvolvimento de camundongos do sistema imunológico humano (HIS, "humanizados"), seguido pela implantação de um tumor humano, seja um xenoenxerto derivado de linhagem celular (CDX) ou um xenoenxerto derivado de paciente (PDX). Os camundongos HIS são gerados pela injeção de células-tronco hematopoéticas humanas CD34+ isoladas do sangue do cordão umbilical em camundongos neonatais BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) altamente imunodeficientes que também são capazes de aceitar um tumor xenogênico. Enfatiza-se a importância da cinética e das características do desenvolvimento do sistema imune humano e da implantação tumoral. Finalmente, uma avaliação aprofundada do microambiente tumoral usando citometria de fluxo é descrita. Em numerosos estudos utilizando este protocolo, verificou-se que o microambiente tumoral de tumores individuais é recapitulado em camundongos HIS-PDX; Tumores "quentes" exibem grande infiltração imunológica, enquanto tumores "frios" não. Este modelo serve como um campo de testes para imunoterapias combinadas para uma ampla gama de tumores humanos e representa uma ferramenta importante na busca por medicina personalizada.

Seguindo o protocolo tumoral do flanco e a linha do tempo experimental (Figura 1), o crescimento tumoral e a resposta imune a uma terapia direcionada com inibidor de tirosina quinase (TKI) e tratamento combinado com nivolumab foram estudados em duas PDXs distintas de câncer colorretal humano (CCR). As drogas TKI têm sido estudadas em hospedeiros imunodeficientes para avaliar o crescimento tumoral apenas29. Esse modelo possibilitou o estudo de alterações na respost...

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Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

Este protocolo descreve a geração de camundongos do sistema imunológico humano (HIS) para estudos de imuno-oncologia. Instruções e considerações sobre o uso deste modelo para testes de imunoterápicos humanos em tumores humanos implantados neste modelo são apresentadas com ênfase na caracterização da resposta do sistema imune humano ao tumor.

Testando imunoterápicos contra o câncer em um modelo humanizado de camundongo com tumores humanos

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine ...

Este protocolo descreve a geração de camundongos do Sistema Imunológico Humano, ou HIS, para estudos pré-clínicos de imuno-oncologia. Os modelos de câncer de camundongo são limitados em sua diversidade e se traduzem mal para a clínica. Esta técnica serve como um modelo pré-clínico para estudos de imunoterapia, avaliando o tratamento de tumores humanos em um camundongo com sistema imunológico humano.O modelo de camundongo humanizado pode ser usado para estudar vários aspectos da imunologia humana, incluindo respostas a muitas infecções ou cânceres do sistema imunológico humano. Adquirir uma fonte confiável e robusta de sangue do cordão umbilical e manter a saúde da colônia de camundongos imunodeficientes pode ser um desafio. Conhecimentos especializados em citometria de fluxo e análise imunológica são essenciais.Quem demonstrará o procedimento será Kristina Larsen, uma profissional de serviços de pesquisa do meu laboratório. Para começar, ressuspenda a pastilha de células CD34-positivas isoladas do sangue do cordão umbilical em 300 microlitros de tampão separador de célula magnética por uma vez 10 até a oitava célula. Adicionar 100 microlitros de reagente bloqueador de FCR por uma vez 10 às oitava células, seguido por 100 microlitros de esferas magnéticas CD34-positivas por uma vez 10 às oitavas células, e incubar a quatro graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, adicione cinco mililitros de tampão separador de célula magnética por uma vez 10 às oitavas células e gire a 360 g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Repita a etapa de lavagem e ressuspenda o pellet em 500 microlitros por 100 milhões de células de tampão separador de células magnéticas em um tubo cônico de 15 mililitros marcado como não fracionado. Rotule mais dois tubos de 15 mililitros CD34-negativo e CD34-positivo Coloque os três tubos em um rack de resfriamento.Separe as células usando o programa de seleção positiva de duas colunas em um separador automático de células magnéticas em um gabinete de biossegurança. Em seguida, para expandir e congelar células-tronco humanas CD34-positivas, prepare o sangue do cordão umbilical, ou meio CB, conforme descrito no manuscrito, e passe por um filtro de 0,22 mícron. Ressuspender as células CD34-positivas a 100.000 por mililitro de meio CB e incubar a 37 graus Celsius.No terceiro dia, adicionar ao balão um volume igual de meio CB sem citocinas. No quinto dia, colher as células CD34-positivas expandidas. Pipetar a suspensão da célula para cima e para baixo e coletar em um tubo cônico de 50 mililitros.Adicionar um meio CB suficiente para cobrir o fundo do balão. Usando um raspador de células, raspe todo o fundo do frasco. Colete todos os meios no mesmo tubo de 50 mililitros e centrífugo.Ressuspender as células em dois mililitros de meio CB e centrifugar. Aspirar o meio até o pellet e ressuspendê-lo em meio de congelamento. Em seguida, inicie a preparação de células CD34-positivas três horas após a irradiação do filhote.Aqueça 10 mililitros de mídia CB em um tubo de 50 mililitros. Recupere um frasco de células CD34-positivas expandidas e congeladas in vitro para cada quatro a seis filhotes a injetar. Descongele rapidamente a 50 a 55 graus Celsius até que apenas uma pequena quantidade de gelo seja visível, e adicione as células ao meio CB aquecido.Use um mililitro de meio para enxaguar cada frasco e gire as células a 360 g por 12 minutos a quatro graus Celsius. Aspirar o meio cuidadosamente. Ressuspender o pellet em dois mililitros de meio CB e contar as células.Novamente, centrifugar as células, aspirar o meio e ressuspender o pellet em 100 microlitros de PBS estéril por n mais um filhote para injetar, resultando em 250.000 a 450.000 células CD34-positivas por camundongo. Para o isolamento PBMC do sangue de camundongos, misture a heparina sanguínea pipetando suavemente para cima e para baixo e sobreponha lentamente em cima de 500 microlitros de gradiente de densidade de 1,077 grama por mililitro, tomando cuidado para não perturbar a interface. Centrifugar o tubo a 1, 220 g durante 20 minutos à temperatura ambiente sem pausas.Remova o maior número possível de células do buffy coat com uma pipeta de 200 microlitros e adicione ao novo tubo de 1,5 mililitro contendo 750 microlitros de meio de colheita. Centrifugar a 360 g por 11 minutos. Aspirar o meio para 50 microlitros, e ressuspender o pellet em 750 microlitros de meio de colheita.Adquira os dados de 100 microlitros de cada amostra em um citômetro de fluxo. Em seguida, importe o arquivo fcs para o software de edição de dados de fluxo e aplique uma porta de polígono a um gráfico FSC-A versus SSC-A. Mude os eixos para FSC-A versus FSC-H e abra as células na diagonal linear, excluindo os duplos que se projetam da linha.Selecione essas células e altere os eixos para hCD45 versus mCD45. Aplique uma porta de polígono à população hCD45-positiva e aplique o nome humano. Aplique uma porta de polígono à população mCD45-positiva e aplique o nome mouse.Crie uma estatística de contagem para populações humanas e de camundongos. Em seguida, selecione a população humana e altere os eixos para CD19 versus CD3. Aplique uma porta de polígono às células CD19-positivas e nomeie-as células B.Aplique uma porta de polígono à população CD3-positiva e nomeie-a de células T. Em seguida, aplique uma porta de polígono à população duplamente negativa e nomeie-a como não-TB. Selecione a população de células T e altere os eixos para CD4 versus CD3.Aplique uma porta de polígono à população CD4-positiva e nomeie-a CD4-positiva. Aplique uma porta de polígono à população CD4-negativa e nomeie-a CD8. Selecione a população sem TB e altere os eixos para CD56 versus mielóide.Aplique uma porta de polígono à população total CD56-positiva e nomeie-a como células NK. Em seguida, aplique uma porta poligonal à população CD56-negativa e mielóide-positiva, e nomeie-a mieloide. Crie uma tabela para as estatísticas de porcentagem e contagem de todas as populações e exporte-a para uma planilha.Calcule a porcentagem de quimerismo hCD45 usando a fórmula indicada. Depois de cultivar células tumorais no camundongo e administrar tratamentos medicamentosos, colete os tecidos. Coloque o mouse em uma placa de dissecção de espuma com pinos para mantê-los no lugar e os braços e pernas estendidos a 45 graus.Faça uma incisão até o meio do tronco, começando perto da pelve e estendendo-se até o queixo. Puxe a pele até a borda e segure-a no lugar com alfinetes. Extrair os gânglios linfáticos usando pinças finas na ordem axilar, cervical, mesentérica, inguinal e hiatal.Coloque os gânglios linfáticos de um lado da lâmina de vidro fosco em uma placa de Petri em oito mililitros de meio de colheita. Segurando as lâminas em ângulos perpendiculares com as bordas foscas para dentro, pressione suavemente os tecidos até que o conteúdo celular seja liberado. Enxágue a lâmina várias vezes, separando-as e juntas para liberar o número máximo de células.Colete as células com uma pipeta de vidro de cinco polegadas e filtre-as através de uma pipeta de algodão de nove polegadas em um tubo cônico de 15 mililitros rotulado. Em seguida, extrair o tumor do flanco aberto segurando o tumor com pinça enquanto corta lentamente as margens do tumor com tesoura de dissecção. Pesar o tumor e remover 1/4 do tumor para processamento de RNA e imunohistoquímica.Coloque os 3/4 restantes do tumor em um prato de seis centímetros e pique em pedaços de um milímetro usando uma lâmina de bisturi. Transfira os pedaços do tumor para um tubo de dissociação. Em seguida, enxágue o prato com meio TIL incompleto e adicione-o ao tubo.Adicionar a preparação de colagenase e dissociar o tecido usando dissociação mecânica a 37 graus Celsius por 30 minutos a uma hora. Passe a suspensão sobre um filtro de 100 mícrons para um tubo cônico de 50 mililitros e lave o filtro com 10 mililitros de mídia completa TIL. Centrifugar e ressuspender o pellet em meio de colheita suficiente com DNase, para que a suspensão de células possa passar facilmente por uma ponta de pipeta P1000 e registrar o volume para análise a jusante.No PDX CRC 307P, o tratamento combinado retardou o crescimento do tumor, conforme determinado pelo volume de crescimento tumoral ao longo do tempo, pesos tumorais e taxa de crescimento específica. PDX CRC 307M testado em uma coorte diferente de camundongos foi menos afetado pelo mesmo tratamento combinado em camundongos HIS BRGS. Com base no quimerismo geral hCD45-positivo e hCD3-positivo de células T humanas no sangue antes da implantação do tumor, ambos os parâmetros aumentaram no sistema imunológico periférico e no TIL em combinação com camundongos portadores de CCR 307P tratados, mas não no modelo CRC 307M.A investigação das células T humanas revelou mais células T ativadas nos tumores CRC 307P, mas não na linfa de camundongos tratados combinadamente. Além disso, houve mais células T CD8-positivas de memória efetoras e menos células T positivas para TIM-3 nos tumores CRC 307P tratados combinadamente. Em contrapartida, essa diferença não foi observada no modelo CRC 307M.Além disso, não foram observadas mudanças nas frequências das populações de células T citotóxicas entre os camundongos tratados com combinação, embora células T citotóxicas mais altas tenham sido observadas em camundongos não tratados. O tratamento combinado não afetou as frequências de Tregs em órgãos linfáticos ou tumores do CCR 307P, embora os dados do CCR 307M tenham mostrado uma tendência de redução de Tregs. Alterações relacionadas à imunidade nas células tumorais foram elevadas por citometria de fluxo.Aumento da expressão de MHC classe I e classe II foi observado nas células tumorais CRC 307P excisadas de camundongos HIS BRGS tratados com combinação. No modelo CRC 307M, o mesmo tratamento medicamentoso induziu a expressão de HLA classe II nas células tumorais. Da mesma forma, o tratamento combinado resultou em aumento da expressão de PD-L1 nas células tumorais CRC 307P positivas para EpCAM.Finalmente, foram investigadas correlações das respostas imunes com o crescimento tumoral. O aumento de células T CD4-positivas mostrou uma correlação significativa com menor crescimento tumoral e, mais especificamente, com células T ativadas positivas para HLA-DR nos camundongos HIS tratados com combinação. Técnica estéril ao isolar as células CD34-positivas, pois os camundongos são extremamente imunodeficientes.O quimerismo resultante é variável dentro e entre doadores de sangue de cordão umbilical, e as células T têm a maior variação. Combinações ilimitadas de imunoterapia podem ser realizadas, bem como estudos mecanísticos e cinéticos de dosagem de drogas, por exemplo, deleção de células T CD8 para confirmar seu papel. É importante ressaltar que as toxicidades relacionadas a drogas também podem ser estudadas.Ele forneceu um modelo pré-clínico mais relevante e acessível para testar imunoterapias humanas para tradução para a clínica. Vários ensaios clínicos estão em andamento agora com base nesses dados.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescente modelo de camundongo ortotópico de câncer de pâncreas

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Pesquisa do câncer

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

No modelo in vivo para o ensaio do efeito de hipoxia em metástase tumoral

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

O Colon-26 Carcinoma Tumor-rolamento Mouse como um modelo para o estudo do câncer caquexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Enxertia de tumor em um modelo do rato de enxerto heterólogo de linfoma de células do manto humano

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Desenvolvimento de um modelo humano pré-clínicos de Osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico co cultivados com linhas de células de câncer de mama

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

Uma célula mononuclear do sangue periférico humano (PBMC) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-Oncology (I-O)

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Modelo murino de tumores hepáticos metastáticos no cenário de lesão de reperfusão de isquemia

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtenção de esferas de células-tronco cancerígenas de tumores ginecológicos e de câncer de mama

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar terapia de combinação potencial para GBM usando células-tronco glioma derivadas do paciente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

High-Resolution Ultrasonography for the Analysis of Orthotopic ATC Tumors in a Genetically Engineered Mouse Model

Ultrassonografia de Alta Resolução na Análise de Tumores Ortotópicos ATC em Modelo de Camundongo Geneticamente Modificado

Anaplastic thyroid carcinoma (ATC) is associated with a poor prognosis and short median survival time, but no effective treatment improves the outcomes ...