Name: generation of natural killer cells from human expanded potential stem cells
Uploaded: 2023-01-13T14:30:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Natural Killer Cells from Human Expanded Potential Stem Cells at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Handi Cao, Sanxing GAO, David Xiang, Yiming Chao, Ritika Jogani, Owen Chan, Stephanie Cheung og Celine Chan for deres tekniske assistance og nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet af Platform Technology Fund. Figur 1 er oprettet med BioRender.com.

Denne undersøgelse omfattede in vitro-forsøg ; Derfor er etisk godkendelse ikke anvendelig. De etablerede cellelinjer, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev opnået fra kommercielle kilder (se materialetabellen).
1. Generering af 3D-organoidstrukturer fra hEPSC'er
<ol><li>Vedligehold hEPSC'er ved at dyrke dem med 1 ml EPSC-medium (12-brøndplade) på SNL-føderceller1. BEMÆRK: Kuppelformede kolonier observeres (figur 2A), hvis deres udvidede styrke forbliver.</li>
	<li>Udfør prædifferentiering af hEPSC'erne.<ol><li>Fjern hEPSC-mediet, og tilsæt 1 ml DFK-medium (DMEM / F12 + 10% serumerstatningsmedium, se materialetabellen). Der inkuberes i 2-3 dage ved 37 °C og 5% CO2. Udfør en medium ændring på den anden dag, hvis du fortsætter inkubationen i 3 dage. BEMÆRK: Under mikroskopet er de kuppelformede kolonier fladtrykte (figur 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Embryoidlegemerne kontrolleres ved hjælp af hængedråbeteknikken 7,8.<ol><li>Fjern DFK-mediet, og vask med 1 ml PBS én gang. Tilsæt 500 μL 0,05% trypsin, og inkuber pladen ved 37 °C og 5% CO2 i 3-7 minutter baseret på morfologien. BEMÆRK: hEPSC'erne skal kunne løsnes fra fødercellerne, når pladen er let forstyrret.</li>
		<li>Fjern trypsinet, og tilsæt 2 ml DFK-medium for at høste cellerne. Drej cellerne ned ved 300 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.</li>
		<li>Supernatanten fjernes med en pipette. Der tilsættes 1 ml DFK-substrat og 1 μL Y27632 (se materialetabellen) for at ophvirvle cellerne igen ved at svirpe.</li>
		<li>Tæl antallet af celler i cellesuspensionen med et hæmocytometer9. Fortynd cellesuspensionen med DFK-medium og Y27632 (1.000x), så der er 4.000 celler/25 μL DFK-medium.</li>
		<li>Fyld hætten på en 10 cm petriskål med ca. 30-40 dråber 25 μL cellesuspension pr. hætte. Hæld noget PBS i den nederste skål for at forhindre fordampning af dråberne. Vend forsigtigt hætten og dæk fadet. Skålen inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 3 dage.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Mesoderm og hæmato-endotelmønster af embryoidlegemet (EB)
<ol><li>Saml EB'er i dråben.<ol><li>Alle EB'erne fra dråben samles i et 15 ml rør ved hjælp af en 1 ml pipette og noget PBS. Pump lidt PBS ind i dråben, og sug derefter mediet, inklusive EB'erne, ud med pipetten. BEMÆRK: Dråber, der er mere gule, indikerer mere vellykket dannelse og vækst end lyserøde dråber.</li>
		<li>Centrifuger de opsamlede EB'er centrifugeres ved 100 x g i 1 min ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes med en pipette. Tilføj 1 ml medium A (fra et kommercielt tilgængeligt celledifferentieringssæt, se materialetabellen) for at overføre de indsamlede EB'er til en ikke-klæbende plade med 24 brønde. Mærk denne dag som Dag 0 (Figur 1). BEMÆRK: Normalt grupperes alle EB'er indsamlet fra en 10 cm skål og overføres til en brønd i en 24-brønds plade.</li>
	</ol></li>
	<li>Udfør mesoderm mønster af EB'erne.<ol><li>Pladen inkuberes i 3 dage ved 37 °C med 5% CO2. På dag 2 fjernes 500 μL medium A (fra sættet, trin 2.1.2), samtidig med at EB'erne undgås. Derefter tilsættes 500 μL frisk medium A.</li>
	</ol></li>
	<li>Udfør hæmatoendotelspecifikation af embryoidlegemet.<ol><li>700 μL medium A fjernes fra brønden, og der tilsættes 700 μL medium B (fra sættet, trin 2.1.2). Kultur i 7 dage. Udfør en halv udskiftning af medium B på dag 5, dag 7 og dag 9.</li>
	</ol></li>
</ol>3. NK-celledifferentiering
<ol><li>Overfør de mønstrede EB'er til en luft-væske-grænseflade.<ol><li>Vip pladen let, så EB'erne samles i bunden. Brug en 1 ml pipette til at fjerne så meget af medium B som muligt, samtidig med at EB'erne undgås.</li>
		<li>Tag EB'erne op med en pipette ved at opsuge det resterende medium. Overfør dem til en transbrønd i en plade med 24 brønde (se materialetabellen). BEMÆRK: Begræns tallene til to til tre EB'er pr. transwell for optimal tæthed.</li>
	</ol></li>
	<li>Udfør lymfoid stamfaderudvidelse.<ol><li>Der tilsættes 500 μL NK-1-medium (kommercielt tilgængeligt lymfoidt ekspansionsmedium + 14 IE/ml IL-3, 4.500 IE/ml IL-15, 8.800 IE/ml IL-7, 26 IE/ml SCF og 12 IE/ml ftl3L, se materialetabellen) til transbrøndens nederste rum. Kultur i 14 dage, og udfør en medium skift hver anden dag.</li>
	</ol></li>
	<li>Høst og overfør cellerne på dag 7-10 til en belagt plade.<ol><li>For at belægge pladen fortyndes belægningsmaterialet (kommercielt tilgængeligt lymfoid differentieringsbelægningsmateriale, 100x, se materialetabellen) i PBS. Der tilsættes 1 ml fortyndet belægningsopløsning til hvert hul i en plade med 12 huller, og pladen inkuberes ved 4 °C natten over. Dæk pladens åbning med indpakningsfilm.</li>
		<li>Tilsæt 200 μL PBS i transbrønden, og pipette langsomt op og ned omkring fem til seks gange for at høste cellerne frigivet fra organoiderne. Undgå pipettering af organoiderne. BEMÆRK: Runde celler frigives kontinuerligt fra organoiderne (figur 2D).</li>
		<li>Overfør den høstede cellesuspension til et 2 ml rør, og drej cellerne ned ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes med en pipette, og der tilsættes 1 ml NK-1-substrat (trin 3.2.1) for at resuspendere cellerne ved pipettering.</li>
		<li>Fjern al belægningsopløsningen fra brønden, og vask hver brønd i en 12-brønds plade med 1 ml PBS to gange.</li>
		<li>Opdel de høstede celler i forholdet 1: 2. Cellesuspensionen overføres til en belagt plade med 12 huller (trin 3.3.1). Tilsæt 1 ml NK-1-medium, så hver brønd har 1,5 ml medium.</li>
		<li>For at udføre en medium ændring, lad cellerne sidde i 1-2 minutter for at lade cellerne synke til bunden. Opsug forsigtigt 750 μL medium ud. Den opsamlede supernatant centrifugeres ned ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.</li>
		<li>Det meste af supernatanten kasseres, og der resuspenderes i 750 μL NK-1-substrat med pipettering fem til seks gange. Tilsæt cellerne resuspenderet i det friske medium i den oprindelige brønd. BEMÆRK: Dette parallelle system kaldes 2D-systemet i figur 1. Følg mediumændringsplanen for brønden i organoiderne, som cellerne stammer fra.</li>
	</ol></li>
	<li>Udfør NK-cellemodning ved at følge nedenstående trin.<ol><li>Fjern det gamle medium i 3D-systemet, og tilsæt 500 μL NK-2 (kommercielt tilgængeligt NK-celledifferentieringsmedium + 4.500 IE / ml IL-15, 8.800 IE / ml IL-7, 26 IE / ml SCF og 12 IE / ml ftl3L, se materialetabellen) i transbrøndens nederste rum. Der inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 14 dage. BEMÆRK: Sørg for, at mediet rører bunden af transbrønden.</li>
		<li>Udfør en fuld medieændring på cellerne i 2D-systemet. Saml alle 1,5 ml celler fra en brønd, og centrifuger den ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Det meste af supernatanten fjernes med en pipette, og pelletpen resuspenderes med 1,5 ml NK-2-substrat (trin 3.4.1).</li>
		<li>Udfør en medieændring hver anden dag. Vip pladen på 3D-systemet let, og fjern alt det gamle medium uden for transwell. Der tilsættes 500 μL NK-2-medium uden for transbrønden.</li>
		<li>For at udføre en halv medium ændring på en brønd i en 12-brønds plade til 2D-systemet, lad cellerne sidde i 1-2 minutter for at lade cellerne synke til bunden. Der suges forsigtigt 750 μL af mediet ud.</li>
		<li>Den opsamlede supernatant centrifugeres ned ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at forhindre celletab. Det meste af supernatanten kasseres, og der resuspenderes i 750 μL NK-2-substrat ved pipettering fem til seks gange. Tilsæt cellerne resuspenderet i frisk medium i den oprindelige brønd.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Høstning af modne celler
<ol><li>Høst cellerne dyrket i 2D-systemet.<ol><li>Høst cellerne ved pipettering op og ned i dag 38-45. Vask med 1 ml PBS to gange. Centrifuger cellesuspensionen ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.</li>
		<li>Supernatanten fjernes med en pipette, og den resuspenderes i den valgte buffer (dvs. PBS + 2% FBS for flowcytometri, se materialetabellen).</li>
	</ol></li>
	<li>Høst cellerne indlejret i organoiden.<ol><li>Mediet opsamles udefra i et 15 ml rør på dag 38-45. Organoid vaskes to gange ved at tilsætte 200 μL PBS inde i transbrønden og pipettere op og ned fem til seks gange. Overfør suspensionen til 15 ml røret.</li>
		<li>Der tilsættes 500 μL PBS i en brønd med en plade med 12 huller. Overfør organoiden fra transbrønden til brønden på 12-brøndpladen med tang.</li>
		<li>Skær organoiden 20 gange ved hjælp af en saks og tang. Skyl de resterende celler på tang og saks i brønden med PBS. Der opsamles så meget PBS som muligt, og det overføres til det 15 ml rør, der blev anvendt i trin 4.2.1, uden at opsuge organoidstrukturen.</li>
		<li>Der tilsættes 500 μL af dissociationsreagenset (se materialetabellen) i transbrønden for enzymatisk fordøjelse af organoiden. Der inkuberes med en kommerciel celleløsrivelsesopløsning (se materialetabellen) i 7-10 minutter ved 37 °C og 5% CO2. Reaktionen slukkes ved at tilsætte 1 ml PBS med 2% FBS, og opløsningen opsamles i et andet 15 ml rør. Vask brønden med 1 ml PBS med 2% FBS to gange. BEMÆRK: Bestem længden af inkubationen baseret på morfologien. Prøv at opnå det punkt, hvor enkeltceller begynder at blive frigivet fra membranen i 3D-strukturen.</li>
		<li>Tilsæt 1 ml PBS med 2% FBS, og pipette op og ned 8-10 gange. Saml alle løsningerne, herunder organoidstrukturerne. De overføres til det 15 ml rør, der blev anvendt i trin 4.2.3, med en cellesi.</li>
		<li>Begge glas centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres med en pipette. Cellepillen resuspenderes med den valgte buffer (trin 4.1.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+porcine+and+human+expanded+potential+stem+cells.">Establishment of porcine and human expanded potential stem cells.</a> Nature Cell Biology. 21 (6), 687-699 (2019).</li><li>Mackinlay, K. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+stem+cell+model+of+human+epiblast+and+yolk+sac+interaction.">An in vitro stem cell model of human epiblast and yolk sac interaction.</a> eLife. 10, 63930 (2021).</li><li>Zhu, H., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+produce+clinical-scale+natural+killer+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">An improved method to produce clinical-scale natural killer cells from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2048, 107-119 (2019).</li><li>Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+natural+killer+cells+engineered+with+chimeric+antigen+receptors+enhance+anti-tumor+activity.">Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity.</a> Cell Stem Cell. 23 (2), 181-192 (2018).</li><li>Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+natural+killer+cells.">Functions of natural killer cells.</a> Nature Immunology. 9 (5), 503-510 (2008).</li><li>Dhar, P., Wu, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+and+its+ligands+in+cancer.">NKG2D and its ligands in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 51, 55-61 (2018).</li><li>Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+embryoid+body+formation+and+hematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+different+culture+systems.">Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems.</a> Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).</li><li>Rungarunlert, S., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoid+body+formation+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells:+Benefits+of+bioreactors.">Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells: Benefits of bioreactors.</a> World Journal of Stem Cells. 1, 11-21 (2009).</li><li>Counting cells using a hemocytometer. abcam Available from: <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2022)</li><li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity.">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> Journal of Immunological Methods. 294, 15-22 (2004).</li><li>Tremblay-McLean, A., Coenraads, S., Kiani, Z., Dupuy, F. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+ligands+for+activating+natural+killer+cell+receptors+on+cell+lines+commonly+used+to+assess+natural+killer+cell+function.">Expression of ligands for activating natural killer cell receptors on cell lines commonly used to assess natural killer cell function.</a> BMC Immunology. 20, 8 (2019).</li><li>Inoue, T., Swain, A., Nakanishi, Y., Sugiyama, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+analysis+of+cell+surface+marker+of+human+leukemia+cell+lines+using+flow+cytometry.">Multicolor analysis of cell surface marker of human leukemia cell lines using flow cytometry.</a> Anticancer Research. 34 (8), 4539 (2014).</li><li>Mhatre, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometry+based+cytotoxicity+assay+for+evaluation+of+NK+cell+function.">Rapid flow cytometry based cytotoxicity assay for evaluation of NK cell function.</a> Indian Journal of Experimental Biology. 52 (10), 983-988 (2014).</li><li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region.">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86 (6), 897-906 (1996).</li><li>Motazedian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+RAG1++progenitors+emerge+directly+from+haemogenic+endothelium+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+haematopoietic+organoids.">Multipotent RAG1+ progenitors emerge directly from haemogenic endothelium in human pluripotent stem cell-derived haematopoietic organoids.</a> Nature Cell Biology. 22 (1), 60-73 (2020).</li><li>Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+cell+line+(NK-92)+with+phenotypical+and+functional+characteristics+of+activated+natural+killer+cells.">Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.</a> Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).</li><li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antileukemia+activity+of+a+natural+killer+cell+line+against+human+leukemias.">Antileukemia activity of a natural killer cell line against human leukemias.</a> Clinical Cancer Research. 4 (11), 2859-2868 (1998).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Der er et par afgørende trin for at sikre en vellykket differentiering af CD45+CD56+ celler fra hEPSC'er. Fordifferentieringen (trin 1.2) er afgørende, da EPSC-mediet indeholder inhibitorer af afstamningsforpligtelse1. Efter prædifferentiering flades de kuppelformede kolonier af hEPSC'er (figur 2B). Tilsætningen af Y27632, en rhokinasehæmmer (ROCKi), under dannelsen af EB'er fra hEPSC'er (trin 1.3) er uundværlig for hEPSC'ernes overlevelse efter dissociation. En anden vigtig overvejelse er antallet af EB'er, der er plantet på hver transwell. Da det er et lille system, er to til tre EB'er pr. transwell den optimale tæthed for at forhindre overforbrug af medierne. Luft-væske-grænsefladen opretholdes under hele forløbet af NK-celledifferentiering for 3D-systemet, hvilket menes at opretholde stromale cellers polaritet og understøtte udvidelsen af de AGM-afledte hæmatopoietiske forfædre14,15.
Som tidligere nævnt er tætheden af EB'er på transwell en afgørende faktor for vellykket differentiering. Nøgletegnet for dette er mediets farve 1 dag efter implantation af EB'er på transwellen. Hvis farven hurtigt bliver gul, indikerer dette enten forurening eller overbelægning. For at løse problemet skal en 1 ml pipette bruges til manuelt at opsamle ekstra EB'er og overføre dem til en anden transwell.
En væsentlig begrænsning af denne protokol er renheden af CD3−/CD45+ CD56+ celler i IVD-produkterne, som menes at være delvist ansvarlig for den ringere cytotoksicitet sammenlignet med rene NK92mi-celler. Et 3D-kultursystem blev anvendt til at inducere hæmatopoietiske forfædre via genereringen af en EB, der ligner de tre embryonale kimlag. Denne strategi efterligner udviklingen af blodlegemer i knoglemarvsmikromiljøet og fjerner dermed behovet for stromale celler til at understøtte differentieringen3. Uden et sorteringstrin til rensning af de hæmatopoietiske forfædre forventes IVD-produkternes renhed at blive reduceret. En strategi for at bevare den komplekse differentieringsniche og samtidig øge renheden af slutpunktsproduktet er at udvikle en ekspansionsmetode til de sorterede CD3-CD56+ IVD-produkter. For eksempel kan de sorterede CD3-CD56+ IVD-produkter dyrkes på kunstige antigenpræsenterende celler (aAPC'er), såsom bestrålede K562-celler konstrueret med membranbundet IL-21. Med forsyningen af IL-2 i kulturen kan denne metode opnå en 1.000 gange stigning i NK-cellenumre3.
En anden begrænsning er den begrænsede adgang til bona fide humane NK-celler som en positiv reference. NK92mi er den positive reference, der anvendes i coculture-assayet, men den er ikke præcis nok. NK92mi-celler er konstrueret fra NK92-celler, en permanent cellelinje, der udtrykker aktiverede NK-cellefænotyper16, til autonomt at producere IL-2 for at opfylde dyrkningskravene. NK92-celler viser overlegen drabsaktivitet mod K562-celler in vitro end humane primære NK-celler17. En mere retfærdig sammenligning af IVD-produkters tumordræbende kapacitet kunne opnås ved parallelt at analysere cytotoksiciteten af perifere NK-celler i blodet, men desværre mangler der adgang til blodbanker.
Denne kulturprotokol med to systemer sigter mod at generere CD3−/CD45+CD56+ celler fra hEPSC'er. Vurderingen af overflademarkørerne og cytotoksiciteten med FACS kan rutinemæssigt udføres på celler fra 2D-systemer uden at forstyrre differentieringsnichen. På trods af forskellene i procentdelene af CD3-CD56+ celler kan 3D- og 2D-systemerne udlede CD3-CD56+ celler med lignende variationer i CD56-ekspression (figur 3), og 2D-systemet afspejler eksistensen af lymfoide forfædre fra 3D-kulturtilstanden.
Betydningen af at bruge 3D-kultursystemet er, at det tillader brugen af profileringsanalyser i høj opløsning, såsom rumlig transkriptomik eller billeddannelse af massespektrometri, til at undersøge de rumlige relationer og celle-celle-interaktioner inden for den komplekse differentieringsniche.

Sammenlignet med konventionelle pluripotente stamceller som humane embryonale stamceller (hESC'er) og humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) er humane ekspanderede potentielle stamceller (hEPSC'er) tættere på totipotenstilstanden, da de kan differentiere sig til både ekstraembryonale og embryonale linjer1. For eksempel kan hEPSC'er differentieres i trofoblaster1 og æggeblomme-sæklignende celler2. For at opnå den unikke styrke af hEPSC'er dyrkes en individuel blastomer i et medium, der indeholder flere små molekyler, der hæmmer afstamningsforpligtelsessignalering1, som kaldes EPSC-medium (EPSCM). Dyrkning af hESC'er og hiPSC'er i EPSCM udvider deres tidligere begrænsede styrke for at differentiere dem til trofoblastceller1.
Pluripotente stamceller er et værdifuldt forskningsværktøj til at eksperimentere med nye genetiske modifikationer. På grund af pluripotente stamcellers selvfornyelses- og differentieringskapacitet kan en transformeret klon af en pluripotent stamcelle producere differentierede cellulære produkter, der besidder den samme genetiske modifikation på samme sted. Zhu og Kaufman etablerede standarden for NK-celledifferentiering fra konventionelle pluripotente stamceller (hESC'er og hiPSC'er)3. For det første inducerede de hæmatopoietiske stamceller (HSC'er) fra en embryoid krop afledt af pluripotente stamceller. Tilsætningen af stamcellefaktor (SCF), FMS-lignende tyrosinkinase 3-ligand (Ftl3L), interleukin (IL)-7, IL-15 og et tidligt supplement af IL-3 forspændte HSC'erne til at udvikle sig til naturlige dræberceller (NK). Derefter udvidede de NK-cellerne med kunstige antigenpræsenterende celler (aAPC'er), som præsenterer membranbundet IL-21, med det kontinuerlige tilskud af IL-2. Forskere har anvendt denne tilgang til immunterapi for at generere iPSC-afledte naturlige dræberceller udstyret med den kimære antigenreceptor (CAR-iNK)4.
Humane NK-celler defineres som CD3-CD56+ leukocytter i det perifere blod. De er effektorer mod virusinficerede celler og tumorceller5. Nogle hæmmende receptorer på NK-celler genkender molekyler, der udtrykkes allestedsnærværende i normale celler. Som et eksempel genkender NKG2A / CD94 heterodimer udtrykt på NK-celler MHC klasseI molekyler 5. I mellemtiden genkender de aktiverende receptorer på NK-celler stressinducerede ligander, som hvordan NKG2D genkender transformationsinduceret MHC klasse I polypeptidrelateret sekvens A (MICA/MICB)6. Nogle transformerede celler nedregulerer deres "selvligander" for at undslippe immunovervågning og opregulere afvigende ligander, hvilket udløser NK-cellerne til at udføre deres lytiske maskineri. NK-cellernes iboende antitumorevner har bragt opmærksomheden på denne immuncelletype.
Evnen til samtidig at give anledning til både embryonale og ekstraembryonale linjer kan gøre hEPSC'er til en mere trofast rekapitulation af den embryonale udviklingsniche end konventionelle pluripotente stamceller. Fra erfaring er det lettere at opretholde styrken af hEPSC'er end hiPSC'er. I denne undersøgelse blev der udviklet en protokol (figur 1) til bias hEPSC'er for at udvikle sig til hæmatopoietiske slægter og senere differentiere stamceller til naturlige dræberceller (NK) in vitro. I protokollen anvendes kommercielle medier for at undgå serumuoverensstemmelser, efterfulgt af trinvis tilsætning af cytokiner til biasdifferentiering i lymfoide slægter. Denne protokol har to systemer til at bevare det komplekse 3D-mikromiljø, mens den udleder CD3-CD56+/CD45+CD56+-celler, der fænotypisk og funktionelt ligner humane NK-celler.
Denne protokol kan være nyttig til at studere interaktionen mellem immunceller med deres differentieringsnicher og kan have potentiale til at rense cellulære produkter til immunterapeutiske anvendelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>017-22231</td>
			<td>For resuspending cytokines.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACCUMAX</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>&#160;07921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD159a-PE</td>
			<td>BD</td>
			<td>375104</td>
			<td>During antibody staining, 0.5 &#181;L of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD3-APC antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>555355</td>
			<td>During antibody staining, 0.5 &#181;L of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD45-APC antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>555485</td>
			<td>During antibody staining, 0.5 &#181;L of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD56-PE antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>555516</td>
			<td>During antibody staining, 0.5 &#181;L of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies</td>
			<td>BD</td>
			<td>335826</td>
			<td>During antibody staining, 0.5 &#181;L of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD94-APC&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>559876</td>
			<td>During antibody staining, 0.5 &#181;L of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11772644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>16-5838-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Inserts</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi Solution, 1 mg/mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>564907</td>
			<td>It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 &#181;M/mL. Add 1 &#181;L of the aliquot in 300 &#181;L of FACS buffer (PBS + 2% FBS)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>CPOS-Bioreagent core</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcX, human</td>
			<td>Biolengend</td>
			<td>422302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America</td>
			<td>CPOS-Bioreagent core</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo v10.8.0</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160; PBS (10x) pH 7.4</td>
			<td>CPOS-Bioreagent core</td>
			<td>70011044</td>
			<td>10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K562 cells&#160;</td>
			<td>ATCC&#160;</td>
			<td>CCL-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyeloCult H5100 medium&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92mi cells&#160;</td>
			<td>ATCC&#160;</td>
			<td>CRL-2408</td>
			<td>Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150628</td>
			<td>flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYDish Dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLenti-GFP Lentiviral Control Vector&#160;</td>
			<td>CELL BIOLABS</td>
			<td>LTV-400</td>
			<td>It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 &#956;L of 50x lentivirus is added with 1 &#956;L 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 &#176;C, 5% CO2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>308-FK-005</td>
			<td>It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-15 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB-005</td>
			<td>It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>9124-IL-010</td>
			<td>It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-2 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL-010</td>
			<td>It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-03</td>
			<td>It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-7 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>207-IL-010</td>
			<td>It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Hematopoietic Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5310</td>
			<td>Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan lymphoid differentiation coating material</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>9950</td>
			<td>It is resuspended in PBS (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan NK cell differentiation medium&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>9960</td>
			<td>It is prepared by adding 500 &#181;L StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x)&#160; into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan lymphoid expansion medium&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>9960</td>
			<td>It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan NK Cell Generation Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>9960</td>
			<td>Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 &#176;C once thawed.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The BD LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>working concentration: 10 &#181;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of natural killer cells from human expanded potential stem cells

Differentieringen af naturlige dræberceller (NK) fra humane pluripotente stamceller giver mulighed for forskning i og fremstilling af cellulære produkter af klinisk kvalitet til immunterapi. Beskrevet her er en tofaset protokol, der bruger et serumfrit kommercielt medium og en cocktail af cytokiner (interleukin [IL]-3, IL-7, IL-15, stamcellefaktor [SCF] og FMS-lignende tyrosinkinase 3-ligand [Ftl3L]) til at differentiere humane ekspanderede potentielle stamceller (hEPSC'er) i celler, der besidder NK-celleegenskaber in vitro med både 3-dimensionel (3D) og 2-dimensionel (2D) kulturteknologi. Efter denne protokol genereres CD3-CD56+ eller CD45+CD56+ NK-celler konsekvent. Når de dyrkes sammen med tumormål i 3 timer, viser de differentierede produkter mild cytotoksicitet sammenlignet med en IL-2-uafhængig permanent cellelinje, NK92mi-celler. Protokollen bevarer kompleksiteten af differentieringsmikromiljøet ved generering af 3D-strukturer, hvilket letter undersøgelsen af de rumlige forhold mellem immunceller og deres nicher. I mellemtiden muliggør 2D-kultursystemet rutinemæssig fænotypisk validering af celledifferentiering uden at skade den sarte differentieringsniche.

Det blev antaget, at de nuværende in vitro differentieringsprodukter (IVD) ville have lignende overflademarkører og antitumorevner som humane NK-celler.
Den definerende markør for humane NK-celler blev tilgået for at teste, om differentieringsprodukterne fra 3D-kultursystemet gav celler, der fænotypisk lignede humane NK-celler. Ca. 15% af cellerne dissocieret fra 3D-kultursystemet fra to batcher induceret på forskellige tidspunkter (n = 2) var CD3-CD56+ (figur 3A). CD3 blev erstattet med CD45 (en pan-leukocytmarkør) i testpanelet på grund af fraværet af CD3 og vanskeligheden ved at inducere T-celler in vitro. Ca. 16% af cellerne dissocieret fra 3D-strukturen var CD45+CD56+ (figur 3B, n = 1), hvilket er på linje med procentdelene af CD3-CD56+ celler set i tidligere forsøg. Procentdelene af CD3-CD56+ celler i cellerne høstet fra 2D-kultursystemet varierede fra 30% til 6%, fra mere vellykkede induktioner (figur 3C, n = 3) til mindre vellykkede induktioner (figur 3D, n = 2). Funktionaliteten og fænotyperne af cellerne høstet fra 2D-kultursystemet blev valideret. I løbet af dag 18-kulturen fra 2D-systemet udtrykte ca. 12% af cellerne både ektopisk CD56 og CD107a efter 2 timer 50 ng / ml IL-18, 455 IE / ml IL-2 og 20 ng / ml anti-CD244 antistofstimulering (figur 4C, n = 1). Ca. 28% af de høstede celler var CD94 + CD159a + (figur 4B, n = 1). Den ektopiske ekspression af CD107a, en proteinforing på granulatmembranen, indikerer degranulering10, mens CD94 / NKG2A (CD159a) heterodimer er en anden definerende markør for NK-celler. Dette giver et eksempel på fænotypisk og funktionel validering af IVD-produkter.
IVD-produkternes funktionalitet blev testet ved deres cytotoksicitet mod humane erythroleukæmiceller-K562-celler. Omfattende ligandprofilering på K562-celler afslører deres nedregulerede større histokemiske kompleks I (MHC-I) og forholdsvis stærke NKG2D-ligandekspression (såsom ULBP-1, ULBP-2/5/6 og ULBP-3)11; således er K562-celler modtagelige for den lytiske aktivitet af NK-celler12. Både IVD-endepunktsprodukter og NK92mi-celler blev primet med 50 ng/ml IL-18, 455 IE/ml IL-2 og 20 ng/ml anti-CD244-antistoffer natten over. GFP + K562-cellerne blev cokultureret med enten høstede celler fra IVD- eller NK92mi-celler ved forskellige effektor-til-mål-forhold (E: T) i nærværelse af 50 ng / ml (IE ikke tilvejebragt) IL-18, 455 IE / ml IL-2 og 20 ng / ml anti-CD244-antistoffer i samme volumen H5100-medium i 3 timer. Udlæsningen af NK-celledrabsaktivitet var udtrykket af den døde cellemarkør på GFP + -undergrupper. K562-cellerne blev transduceret med en kommercielt tilgængelig kontrolvektor (se materialetabellen) for at udtrykke GFP konstitutivt, og effektiviteten af transduktionen var ca. 80% (supplerende figur 1A). Procentdelene af GFP-signal, der blev tilføjet, var proportionale med antallet af GFP + K562-celler, der blev tilføjet, hvilket tyder på specifik GFP-ekspression fra de transducerede K562-celler (supplerende figur 1B).
Procentdelen af døende målceller vist i figur 5 blev beregnet med følgende formel13:
Procentdel af døende celler = (FITC + DAPI + % af samkultur [f.eks . figur 5A]) - (FITC + DAPI + % af transducerede K562-celler)
Af alle tre vurderede E: T-forhold (0,1: 1, 0,33: 1, 1: 1) var procentdelene af døende GFP + -celler positivt korreleret med E: T-forholdene, når de blev dyrket sammen med IVD-produkter (figur 5B, hEPSC-NK) eller NK92mi-celler (figur 5B, NK92mi), hvilket indikerer den specifikke drab af tumormål. IVD-produkternes cytotoksicitet var imidlertid forholdsvis beskeden inden for den testede tidsramme (figur 5C).
Endelig blev den lymfoide stamcellegenerering sammenlignet mellem 3D- og 2D-kulturerne. Det blev konstateret, at 3D-kulturtilstanden genererede flere stamceller (55.000 celler) end 2D-kulturtilstanden (36.000 celler) (supplerende figur 2). Dette tyder på, at sammenhængen mellem vævsarkitektur og cellulære komponenter i 3D-kulturen understøttede dannelsen af lymfoide stamceller.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64608/64608fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk diagram, der viser differentieringsstrategien for at differentiere NK-celler fra hEPSC'er . (A) Her vises tidslinjen for 3D-kultursystemerne, der beskriver kulturbetingelserne og korte nøgleord fra hvert trin. 3D-systemets luft-væske-grænseflade opretholdes under NK-celleinduktionen. (B) Her vises tidslinjen for 2D-kultursystemerne. De frigivne celler, der høstes fra dag 7-10 fra strukturer i 3D-systemet, podes på en belagt plade uden luft-væske-grænsefladen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/64608fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64608/64608fig02.jpg"> Figur 2: Morfologi af cellerne observeret på forskellige differentieringsstadier. (A) Morfologien af hEPSC'er, når de vedligeholdes i EPSCM. HEPSC'erne danner kuppelformede kolonier. B) Morfologien af hEPSC'er efter prædifferentiering. De kuplede kolonier er fladtrykte. hEPSC'erne høstes og danner EB'er med hængende dråbeteknikken. EB'erne indsamles og dyrkes i medium A og derefter medium B. (C) Morfologien af en EB på dag 10. I løbet af denne periode begynder EB at udvide og blæse op og danne membranøse strukturer. (D) Morfologien af en cellefrigivende EB. Efter såning på transbrønden vokser EB og frigiver konstant runde celler til omgivelserne. Nogle af de frigivne celler opsamles og dyrkes på en 12-brønds plade belagt med lymfoide differentieringsbelægningsmaterialer. Cellepopulationerne er morfologisk heterogene og har tendens til at aggregere sammen. E) Morfologien af celler observeret ved endpoint af IVD. Små, cirkulære suspensionsceller (sort pil) observeres. Skalastænger: (A, B, E) = 100 μm; (C,D) = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/64608fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64608/64608fig03.jpg"> Figur 3: Repræsentative FACS-afbildninger af hEPSC-afledte produkter ved endepunktet. Celler inkuberes med fluoroskopkonjugerede antistoffer på is i 30 min. Prøverne farves med DAPI, inden de lægges i FACS-prøveinjektionsporten. Ufarvede celler bruges til at etablere den negative gating. (A) Repræsentativ FACS-plot på CD3- og CD56-ekspression i celler dissocieret fra 3D-kultursystemet fra to batcher (n = 2). (B) Repræsentativt FACS-plot på CD45- og CD56-ekspression i celler dissocieret fra 3D-kulturen (n = 1). C) Repræsentativ FACS-afbildning på CD3- og CD56-ekspression i celler høstet fra den coatede plade fra en vellykket induktion (n = 3). D) Repræsentativ FACS-afbildning på CD3- og CD56-ekspression fra den coatede plade, når induktionen er suboptimal (n = 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/64608fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64608/64608fig04.jpg"> Figur 4: Repræsentativt FACS-plot på hEPSC-afledte produkter under dag 18-kultur (n = 1). (A) FACS-plot på CD56- og CD107a-ekspression efter 2 timers stimulering med IL2-, IL-18- og anti-CD244-antistoffer. (B) FACS-plot på CD159a- og CD94-udtryk. Prøverne farves med DAPI, inden de lægges i FACS-prøveinjektionsporten. Ufarvede celler bruges til at etablere den negative gating. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/64608fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64608/64608fig05.jpg"> Figur 5: Afbildning af procentdelene af døende celler mod forskellige E:T-forhold fra samkulturen af GFP+ K562-celler med enten IVD-endepunktsproduktet eller NK92mi-celler (n = 1). Ekspressionen af FITC+ DAPI+ celler blev vurderet med en celleanalysator, og dataanalysen blev udført med kompatibel software. A) Et repræsentativt FACS-plot, der viser gatingen af FITC + DAPI + delmængder fra samkulturen mellem IVD-produkter og K562-celler med et E:T-forhold på 1. (B) Individuelle plots fra samkultureksperimentet med GFP+ IVD-produkter (venstre) eller NK92mi-celler (højre) i 3 timer. Begge afspejler et positivt proportionalt forhold mellem procentdelen af døende celler og E:T-forholdet. C) Et plot, der viser dræberkurverne for IVD-produkter og NK92mi-celler i samme skala. IVD-produkterne viste mild cytotoksicitet sammenlignet med NK92mi-cellerne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/64608fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende figur 1: Funktionel analyse af NK-celler fra hEPSC'er. A) FACS-histogram af transducerede K562-celler. FITC+ K562-cellerne udtrykte GFP. B) FACS-histogrammer fra samkulturen af GFP+ K562-celler og IVD-slutpunktet ved tre E:T-forhold (n = 1). Procentdelene af FITC+ celler i samkulturen svarede til antallet af tilsatte transducerede K562 celler. Ganingsne blev etableret med utransducerede K562-celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/Supplementay%20Figure%201_revised.png" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 2: Lymfoid stamfaderdifferentiering i 2D versus 3D kultur. Den nuværende organoidbaserede protokol blev brugt til at inducere lymfoide stamceller fra humane ekspanderede potentielle stamceller. To betingelser blev oprettet: (1) lymfoide forfædre blev holdt i kultur inden for organoiderne (3D), og (2) lymfoide forfædre blev isoleret og holdt på kulturskålen (2D). Efter 2 ugers yderligere kultur blev cellenumrene bestemt til at sammenligne 2D versus 3D-kulturen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64608/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Natural Killer Cells from Human Expanded Potential Stem Cells at JoVE.com

Generation of Natural Killer Cells from Human Expanded Potential Stem Cells

Denne protokol viser, hvordan man kan differentiere CD3−/CD45+CD56+ celler med mild cytotoksicitet fra humane ekspanderede potentielle stamceller (hEPSC'er) under både 3D- og 2D-dyrkningsbetingelser. Dette giver mulighed for rutinemæssig fænotypisk validering uden ødelæggelse af det komplekse mikromiljø.

Generering af naturlige dræberceller fra menneskelige stamceller med udvidet potentiale

The differentiation of natural killer (NK) cells from human pluripotent stem cells allows for research on and the manufacture of clinical-grade cellular ...

Når vi taler om betydning, er generering af NK-celler fra en udvidelig kilde kritisk for applikationer som kræftimmunterapi. Fordelen ved denne teknologi er, at ekspanderede potentielle stamceller med bredere differentieringskapacitet kan bruges i stedet for almindelige IP-celler. For prædifferentiering af hEPSC'er fjernes hEPSC-mediet, hvori celler blev opretholdt, og tilsættes en milliliter DFK-medium.Inkuber i to til tre dage ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. For at kontrollere dannelsen af embryoide kroppe, efter fjernelse af det brugte DFK-medium, vask cellerne en gang med en milliliter PBS. Tilsæt 500 mikroliter 0,05% trypsin og inkuber pladen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i tre til syv minutter, baseret på morfologien.Når trypsin er fjernet, og to milliliter DFK medium til at høste cellerne. Drej cellerne ned ved 300 G i tre minutter ved stuetemperatur. Efter fjernelse af supernatanten tilsættes 1 milliliter DFK-substrat og en mikroliter Y-27632, og cellerne opslæmmes igen ved at svirpe.Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer og fortynd cellesuspensionen med DFK-medium og Y-27632 for at opnå 4.000 celler pr. 25 mikroliter medium. Placer 30 til 40 dråber cellesuspension på hætten på en 10 centimeter petriskål og hæld noget PBS i den nederste skål for at forhindre fordampning af dråberne. Vend forsigtigt hætten for at dække skålen og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i tre dage.Til opsamling af embryoidlegemerne fra dråben ved hjælp af en milliliter pipette indeholdende PBS pumpes lidt PBS ind i dråben og aspireres mediet ud, herunder embryoidlegemerne. Overfør derefter disse embryoide kroppe til et 15 ml rør og drej dem ned ved 100 G i et minut ved stuetemperatur. Efter fjernelse af supernatanten tilsættes en milliliter medium A.De opsamlede embryoidlegemer overføres til en ikke-klæbende plade med 24 huller, og den betragtes som dag nul.For at udføre mesoderm mønster af embryoidlegemerne inkuberes pladen i tre dage ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. På dag to udskiftes 500 mikroliter brugt medium A med frisk medium A med samme volumen. For at udføre hæmatoendotelspecifikation af embryoidlegemet skal du fjerne 700 mikroliter medium A fra brønden og tilføje det samme volumen medium B.Kultur i syv dage, skifte halvmediet hver anden dag.For at overføre de mønstrede embryoidlegemer til en luft/væske-grænseflade skal du vippe pladen let, så embryoidlegemerne samles i bunden, og ved hjælp af en milliliter pipette fjernes så meget af medium B som muligt. Tag nu embryolegemerne op med en pipette ved at aspirere det resterende medium og overfør dem til en transbrønd i en 24-brøndplade, For at udføre lymfoid stamfaderudvidelse tilsættes 500 mikroliter NK-1-medium til transbrøndens nedre rum, dyrkes i 14 dage og udføres en mediumændring hver anden dag. For at belægge pladen fortyndes belægningsmaterialet i PBS, tilsættes en milliliter fortyndet belægningsopløsning til hver brønd i en 12-brøndplade og dækker pladens åbning med indpakningsfilm.Inkuber pladen ved fire grader Celsius natten over. Tilsæt 200 mikroliter PBS i transbrønden og pipette langsomt op og ned omkring fem til seks gange for at høste cellerne frigivet fra organoiderne. Overfør den høstede cellesuspension til et to-milliliter rør og drej cellerne ned ved 500 G i fem minutter ved stuetemperatur.Efter fjernelse af supernatanten resuspenderes cellerne i en milliliter NK-1-medium. Fjern al belægningsopløsningen fra brønden, og vask hver brønd i en 12-brøndplade med en milliliter PBS to gange. Opdel derefter de høstede celler i et forhold på 1: 2 og overfør cellesuspensionen til en belagt 12-brøndplade.Tilsæt en milliliter NK-1 medium, så hver brønd har 1,5 ml medium. For at ændre mediet skal du lade cellerne synke til bunden i et til to minutter. Derefter skal du forsigtigt aspirere 750 mikroliter medium ud og dreje det ned som tidligere vist.Efter kassering af supernatanten resuspenderes den opnåede pellet i 750 mikroliter NK-1-medium ved pipettering fem til seks gange og overføres til det oprindelige hul. I denne undersøgelse blev de hEPSC-afledte produkter ved endepunktet analyseret. Ca. 15% af cellerne dissocieret fra 3D-kultursystemet fra to batcher induceret på forskellige tidspunkter var CD3-negative, CD56-positive, og 16% af cellerne var CD45-positive, CD-56-positive, hvilket er på linje med procentdelene af CD3-negative, CD56-positive celler set i tidligere forsøg.Procentdelene af CD3-negative, CD56-positive celler i cellerne høstet fra 2D-kultursystemet varierede fra 30 til 6%De hEPSC-afledte produkter i dag 18-kulturen fra 2D-systemet viste ekspression af både ektopisk CD56 og CD107a i 12% af cellerne efter to timers antistofstimulering, og ca. 28% af de høstede celler var CD94-positive, CD159a-positiv. In vitro differentieringsprodukterne blev testet for cytotoksicitet mod humane erythroleukæmiceller K562. Når de dyrkes sammen med tumormål i tre timer, viser de differentierede produkter mild cytotoksicitet sammenlignet med en interleukin 2-uafhængig permanent cellelinje NK92mi-celler.Efter denne metode kan celler såsom T-celler, B-celler og erytrocytter genereres.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Generering af induceret pluripotente stamceller fra humane perifere T-celler Brug af Sendai Virus i Feeder-fri Betingelser

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generation af induceret pluripotente stamceller fra human melanoma Tumor-infiltrerende lymfocytter

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Generation af Integration-fri induceret pluripotente stamceller fra humane perifere mononucleære blodceller Brug episomale vektorer

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Defineret og skalerbar Generation af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal Hel Mount: En Novel Processing and Imaging Protocol for Tykke, Tredimensionale Tissue Tværsnit af Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation af standardiserede og reproducerbare forhjernen-type Cerebral Organoids fra menneskelige induceret pluripotente stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Vurdering af oxidative skader i den primære mus okulære overfladeceller / stamceller som reaktion på Ultraviolet-C (UV-C) Skader

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...