Name: culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens
Uploaded: 2022-12-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Kersi Pestonjamasp fra Moores Cancer Center imaging kernefacilitet for hjælp med mikroskoperne UCSD Specialized Cancer Support Center P30 tilskud 2P30CA023100. Dette arbejde blev desuden støttet af et JoVE-publikationstilskud (JRW) samt generøse gaver fra boet efter Elisabeth og Ad Creemers, Euske Family Foundation, Gastrointestinal Cancer Research Fund og Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).

Deidentifikation og erhvervelse af alt væv blev udført under en IRB-godkendt protokol ved University of California, San Diego.
1. Fremstilling af humant PMP-væv til vævsbehandling og -dyrkning
<ol><li>Transport af tumorvæv og mikrodissektion<ol><li>Forbered transport- og kulturmediet: Udfyld 10% (v / v) Dulbeccos modificerede ørnemedier (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin (Pen Strep).</li>
		<li>Ved vævets ankomst og i henhold til en institu...

<ol>
	<li>Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei.">Pseudomyxoma peritonei.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendiceal+cancer+patient-specific+tumor+organoid+model+for+predicting+chemotherapy+efficacy+prior+to+initiation+of+treatment:+A+feasibility+study.">Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Misra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+organotypic+culture+system+of+precision-cut+slices+of+human+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).</li><li>Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+glioma+cell+invasion+using+organotypic+brain+slice+culture.">A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture.</a> Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).</li><li>Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mucinous+tumors+of+the+ovary+and+appendix.+A+clinicopathologic+study+of+25+cases.">Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases.</a> The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).</li><li>Mizuta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+accompanied+by+intraductal+papillary+mucinous+neoplasm+of+the+pancreas.">Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas.</a> Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).</li><li>Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+originating+from+transverse+colon+mucinous+adenocarcinoma:+A+case+report+and+literature+review.">Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).</li><li>Fleten, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+treatment+of+mucinous+peritoneal+metastases+using+patient-derived+xenograft+models.">Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models.</a> Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).</li><li>Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+mouse+models+of+pseudomyxoma+peritonei+recapitulate+the+human+inflammatory+tumor+microenvironment.">Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment.">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoid+(PDO)+platforms+to+facilitate+clinical+decision+making.">Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).</li><li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies.">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).</li><li>Carr, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+in+the+pathology+of+peritoneal+surface+malignancy.">New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+repeat+cytoreductive+surgery+with+hyperthermic+intraperitoneal+chemotherapy+for+the+treatment+of+peritoneal+surface+malignancy.">Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).</li><li>Weitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-vivo+organotypic+culture+platform+for+functional+interrogation+of+human+appendiceal+cancer+reveals+a+prominent+and+heterogenous+immunological+landscape.">An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape.</a> Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies.">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).</li></ol>

Dette manuskript beskriver en teknik, der kan bruges til at dyrke, forhøre og analysere humane pseudomyxoma peritonei (PMP) tumorprøver. Vi har brugt adskillige downstream funktionelle assays til at forhøre tumorimmunmikromiljøet og en platform til bench-to-bedside test.
Mens metoden er yderst effektiv i vores hænder, vil det kræve en vis øvelse at skære tumorprøver ved hjælp af et vibraatom. Vi stødte nemlig på problemer, der skyldtes meget mucinøse prøver, samt prøver, der fej...

Pseudomyxoma peritonei (PMP) er sjældent syndrom med en forekomst på 1 pr. Million mennesker om året1. De fleste PMP-tilfælde er forårsaget af metastaser fra appendiceale neoplasmer. I betragtning af at mus ikke har et menneskelignende appendiks, er modellering af denne type kræft fortsat ekstremt udfordrende. Mens den primære sygdom ofte kan helbredes ved kirurgisk resektion, er behandlingsmulighederne for metastatisk sygdom begrænsede. Derfor er begrundelsen for at udvikle denne nye organotypiske skivemodel at studere patobiologien af PMP. Til dato er der ingen appendiceal organoidmodeller, der kan dyrkes evigt; Imidlertid viste en nylig model sig at være nyttig til farmakologisk test af terapeutiske midler og immunterapi2. Som sådan har vi tilpasset et organotypisk skivekultursystem, som er blevet brugt i andre typer humane kræftformer, såsom hjerne, bryst, bugspytkirtel, lunge, æggestokke og andre 3,4,5,6.
Ud over appendiceal neoplasmer skyldes PMP lejlighedsvis andre tumortyper, herunder kræft i æggestokkene7, og i sjældne tilfælde intraduktale papillære mucinøse neoplasmer8 og tyktarmskræft9. Derudover har disse tumorer tendens til at vokse langsomt med dårlige engrafthastigheder i patientafledte xenograft (PDX) modeller10,11. I betragtning af disse udfordringer er der et uopfyldt behov for at udvikle modeller til at studere denne sygdom for at begynde at forstå patobiologien af PMP, og hvordan disse kræftceller: rekrutteres til peritoneale overflader, spredes og undslipper immunovervågning.
Mens skåret fra den systemiske vaskulære cirkulation, tumorskiver indeholder cellulære og acellulære komponenter, herunder den ekstracellulære matrix, stromale celler, immunceller, kræftceller, endotelceller og nerver. Dette semi-intakte mikromiljø giver mulighed for funktionel undersøgelse af disse celletyper, hvilket er unikt fordelagtigt sammenlignet med 3D-organoidkulturer, som kun består af kræftceller12. Mens organotypiske skivekulturer er fordelagtige i nogle henseender, er de også i sagens natur en tilgang med lav gennemstrømning sammenlignet med 3D-organoider, som kan udvides og er egnede til multiplekset terapeutisk forsøgslægemiddelscreening13,14,15. I tilfældet PMP har der ikke været rapporter, der dokumenterer pålidelig etablering og evig overførsel af PMP-afledte organoider16. Dette skyldes sandsynligvis den langsomt voksende karakter af PMP-afledte tumorceller samt det lave antal maligne epitelceller, der findes inden for disse mucinøse tumorer. I betragtning af behovet for at udvikle modeller til undersøgelse af PMP er organotypiske skiver unikt egnet til at studere denne sygdom. Vi præsenterer en protokol til forberedelse, billeddannelse og analyse af PMP fra humane prøver.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 40 glass coverslips</td>
			<td>Daiggerbrand</td>
			<td>G15972H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S&#160;</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>4080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>321140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>555333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>357410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/Hyaluronidase&#160;</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>7912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD-Blue&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD imaging dyes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Isamtec</td>
			<td>ISM832C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens

Pseudomyxoma peritonei (PMP) er en sjælden tilstand, der skyldes spredning af en mucinøs primær tumor og den resulterende ophobning af mucinudskillende tumorceller i bughulen. PMP kan opstå fra forskellige typer kræftformer, herunder appendiceal, ovarie og kolorektal, selvom appendiceal neoplasmer er langt den mest almindelige ætiologi. PMP er udfordrende at studere på grund af dets (1) sjældenhed, (2) begrænsede murinmodeller og (3) mucinøs, acellulær histologi. Metoden, der præsenteres her, tillader visualisering og forhør i realtid af disse tumortyper ved hjælp af patientafledte ex vivo organotypiske skiver i et præparat, hvor tumormikromiljøet (TME) forbliver intakt. I denne protokol beskriver vi først forberedelsen af tumorskiver ved hjælp af et vibratomt og efterfølgende langsigtet kultur. For det andet beskriver vi konfokal billeddannelse af tumorskiver og hvordan man overvåger funktionelle aflæsninger af levedygtighed, calciumbilleddannelse og lokal spredning. Kort sagt er skiver fyldt med billedfarvestoffer og placeres i et billeddannelseskammer, der kan monteres på et konfokalmikroskop. Time-lapse-videoer og konfokale billeder bruges til at vurdere den oprindelige levedygtighed og cellulære funktionalitet. Denne procedure undersøger også translationel cellulær bevægelse og parakrin signalinteraktion i TME. Endelig beskriver vi en dissociationsprotokol for tumorskiver, der skal bruges til flowcytometrianalyse. Kvantitativ flowcytometrianalyse kan anvendes til terapeutisk test fra bænk til seng for at bestemme ændringer, der forekommer i immunlandskabet og epitelcelleindholdet.

Kort sagt opnås humane tumorprøver fra PMP under en IRB-godkendt protokol. Vævet fremstilles, mikrodissekeres og størkner i en agaroseform, der skal skæres ved hjælp af et vibratomt (figur 1A; Video 1). Når de er skåret, placeres vævsskiver og dyrkes på permeable indsatsmembraner (figur 1B), som kan bruges til billeddannelsesassays in situ såvel som til cellulære og funktionelle forhør ved hjælp af flowcytometri, konfokal ...

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Vi beskriver en protokol for produktion, kultur og visualisering af humane kræftformer, som har metastaseret til peritoneale overflader. Resected tumorprøver skæres ved hjælp af et vibratomt og dyrkes på permeable indsatser for øget iltning og levedygtighed, efterfulgt af billeddannelse og nedstrømsanalyser ved hjælp af konfokal mikroskopi og flowcytometri.

Kultur og billeddannelse af ex vivo organotypiske pseudomyxoma peritonei tumorskiver fra resekterede humane tumorprøver

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Denne forskning demonstrerer en ny tilgang til studiet af blindtarmskræftterapi og patobiologi i en præklinisk indstilling. Disse metoder kan være mere bredt anvendelige til undersøgelse af andre maligniteter. Appendiceal cancer er vanskelig at studere på grund af dens lave forekomst i mangel af et appendiks hos mus til sygdomsmodellering.Denne teknik tillader undersøgelse af celleinteraktioner inden for tumormikromiljøet. Denne metode kan anvendes til at studere biologien af flere typer kræftformer, der har tilbøjelighed til at metastasere til omentum, såsom kolorektal og ovariecancer. Begynd med at forberede transport- og kulturmedierne.Ved vævets ankomst overføres pseudomyxoma peritonei-tumorvævene til 35 komplette DMEM, der indeholder skåle med en diameter på seks centimeter. Ud over at fjerne flydende mucin eller stærkt mucinøse vævsområder skal du fjerne væv, der er vanskeligt at skære med en skalpel. Skær tumorvævsknuder groft i en terning centimeter mindre stykker.til agarosepræparat og vævsindlejring fremstilles en 5% opløsning af lavsmeltet agarose i PBS uden føtalt bovint serum eller FBS samme dag, hvis vævene ankommer. Tilsæt den flydende 5%agaroseopløsning til de seks centimeter skåle, der indeholder to til tre mindre tumorprøver, indtil den dækker prøven. Placer det indlejrede væv i et køleskab med fire grader Celsius i 30 minutter.Afmonter vævsprøverne på vibratumet, fjern den størknede snegl fra køleskabet, og skær agaroseterningerne lidt større end vævets bredde ved hjælp af en skalpel. Påfør superlim på vibratomstadiet, og læg forsigtigt agaroseterningen på superlimen i et til to minutter til fastgørelse. Fastgør bladet til vibratumet, og indstil tykkelsen af vævssektionen til ca. 150 til 250 mikron for optimal nedstrøms billeddannelse.For at dyrke vævsskiverne skal du forberede en permeabel indsatsplade ved at tilsætte to milliliter komplet DMEM-medie over den permeable membran og tre milliliter under den permeable membran. Løft derefter forsigtigt vævsskiverne ud af vibratomets skærekammer ved hjælp af en tynd pensel, og læg to til fire skiver i permeable kulturskåle, der indeholder komplet DMEM. Dyrk skiverne i op til syv dage ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid.Under medieudskiftning tilsættes bortezomib hver 24. time som kontrol til celledrab og testbare kemoterapier 5-Fluorouracil eller 5-FU til dyrkningsmediet for at udføre farmakologisk intervention. Placer tumorskiver til konfokal billeddannelsesanalyse i en enkelt brønd i en 12-brøndskål indeholdende PBS med 1% FBS. Til calciumbilleddannelseseksperimenter, i stedet for PBS, inkuberes skiverne i en ekstra cellulær calciumopløsning.Pletprøver med billeddannende farvestoffer for at bestemme levedygtigheden af vævsskiver. Inkuber i 10 minutter til en time efter tilsætning af levedygtighedsfarvestoffet. Efter inkubation overføres skiverne til en optisk klar petriskål med glasbund, der indeholder PBS med 1% FBS, der skal bruges til billeddannelse på en konfokal billeddannelsesenhed.Skær et lille stykke fra enden af en milliliter pipettespids for at udvide åbningen, hvilket muliggør kraftig mekanisk dissociation ved pipettering. Inkuber skiver ved 37 grader Celsius med rotation i fem til 15 minutter i en milliliter fordøjelsesbuffer med kraftig vævsforstyrrelse to til tre gange under inkubation ved anvendelse af mekanisk dissociation. Når vævet er fordøjet, overføres det forstyrrede væv med fordøjelsesmedier på et 70 mikrometer filter placeret oven på et 50 ml konisk rør.Vælg større stykker ved hjælp af steril tang eller en pipette. Brug den stumpe bagende af en plastik fem milliliter sprøjte, mos eventuelle større ikke-dissocierede skiver og vask dem med fire milliliter PBS indeholdende 2% FBS. Den dissocierede cellesupernatant tages og centrifugeres ved 300 G i fem til 10 minutter.Supernatanten fjernes og pellets vaskes med en milliliter PBS indeholdende 2% FBS. For at forberede prøven til flowcytometri tilsættes blokeringsbufferen indeholdende 50 mikroliter human FC-blok og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter. Udfør ekstra cellulær farvning ved hjælp af de respektive antistoffer i 50 mikroliter PBS indeholdende 2% FBS.Alikvote fem ml komplette medier til kontrol- og behandlingsbetingelser. På de to til fire skiver, der er belagt på de permeable retter, tilsættes mediet fra kontrolbehandlingsalikvoterne og de yderligere kombinationsterapier, der skal bruges til nedstrøms levedygtighed, levende død analyse. Lad vævsskiver være i en kultur, der indeholder komplet DMEM i to til fem dage, skift medie samt bortezomib og 5-FU hver anden dag.Til selvlysende levedygtighedsanalyse tilsættes 500 mikroliter PBS i en skål med 12 brønde, og de sekventielt matchede vævsskiver overføres til PBS-opløsningen ved hjælp af en pensel eller en milliliter pipette. Fjern PBS fra skiverne. Der tilsættes 500 mikroliter af den selvlysende levedygtighedsopløsning pr. tilstand, og der inkuberes med langsom rotation på rysteren ved stuetemperatur i 30 minutter, før luminescensen aflæses ved hjælp af en luminescenspladelæser.Mucinfarvningen i vævsskiver blev visualiseret ved hjælp af periodisk syreskiftfarvning og mucinspecifikke antistoffer. Inkubation i calcein AM og propidiumiodid bestemte sundhed og levedygtighed. Kernerne overlappede cellerne spredt under kultur.Disse resultater blev kvantificeret for at bestemme antallet af prolifererende celler i tumorskiven. Skiverne inkuberet i CD11b PE konjugeret antistof og Fluo-4 AM, mærket de lokale immunceller i CTU. Pseudofarvede skalerede billeder, der viser intracellulære calciumniveauer, tillod visualisering af differentielle niveauer af intracellulært calcium.Spontan aktivitet sporet og tid forløbet før, under og efter intercellulært calciumrespons inden for den fremhævede CD11b-positive immuncelle er vist her. De rå spor af calciumresponser i CD11b-immuncellen sammen med andre responsive og ikke-responsive celler blev kvantificeret. Repræsentative resultater af immunotypning af en patienttumorprøve med pseudomyxoma peritonei er vist her.Kvantificering af tumorimmunprofilen viste, at donorprøven 337 har høje niveauer af M2-makrofager, hvilket indikerer, at anvendelse af pseudomyxoma peritonei-afledte vævsskiver tillod forhør af det unikke donorcellulære landskab af patienttumorprøverne. Farmakotypning og downstream-analyse af vævsskiver fra pseudomyxoma peritonei humant væv viste drab af celler i tumorskiver som bekræftet af cytotoksicitetsanalyse og tunnelkonfokal billeddannelse. Som reaktion på det cytotoksiske lægemiddel, bortezomib og 5-fluorouracil.Selvlysende levedygtighedsanalyse blev udført ved hjælp af sekventielt matchede skiver. Vellykket produktion af skiver fra mucinøse tumorer kræver omhyggelig dissektion og fjernelse af cellulære og acellulære vævskomponenter som fedt og tæt abdominalvægsvæv. Denne teknik kan muliggøre modellering interaktioner mellem kræftceller og flere celletyper i tumormikromiljøet, såsom fedt-, vaskulære og immuncelleinteraktioner.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In vivo-model for prøvetagning Virkning af Hypoxi på tumormetastase

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Billeddannelse af hjemmehørende CD8 T-lymfocytter i menneskelige lunge Tumor skiver bruger konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR vurdering af pH, pO2, Redox Status, og koncentrationen af fosfat og glutathion i Tumor mikromiljø

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionukleid-fluorescens Reporter gen Imaging for at spore Tumor Progression i gnavere Tumor modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for den genetiske Variation i en sporadisk familiær adenomatøs polypose Patient med formatet Chip i rør

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirus for Tumor-målrettet Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In vivo billeddannelse og Kvantitation af værten Angiogen respons i Zebrafish tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Kultur, Manipulation, og ortotoptransplantation af mus blære Tumor organoider

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation af Ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen og ex vivo karakterisering af tumor Infiltrerende T-celle cytotoksicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En roman Stromal Fibroblast-Moduleret 3D Tumor Spheroid Model for at studere Tumor-Stroma Interaktion og Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...