Name: culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens
Uploaded: 2022-12-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Kersi Pestonjamasp de l’installation centrale d’imagerie du Moores Cancer Center pour son aide avec les microscopes UCSD Specialized Cancer Support Center P30 subvention 2P30CA023100. Ce travail a également été soutenu par une subvention de publication JoVE (JRW), ainsi que de généreux dons de la succession d’Elisabeth et d’Ad Creemers, de la Fondation de la famille Euske, du Fonds de recherche sur le cancer gastro-intestinal et du Fonds de recherche sur les métastases péritonéales (LAM).

La désidentification et l’acquisition de tous les tissus ont été effectuées selon un protocole approuvé par l’IRB à l’Université de Californie à San Diego.
1. Préparation de tissus PMP humains pour le traitement et la culture de tissus
<ol><li>Transport des tissus tumoraux et microdissection<ol><li>Préparer les milieux de transport et de culture : compléter 10 % (v/v) de milieux Eagle modifiés de Dulbecco (DMEM), 10 % FBS, 2 mM L-glutamine, 1 % Pénicilline...

<ol>
	<li>Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei.">Pseudomyxoma peritonei.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendiceal+cancer+patient-specific+tumor+organoid+model+for+predicting+chemotherapy+efficacy+prior+to+initiation+of+treatment:+A+feasibility+study.">Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Misra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+organotypic+culture+system+of+precision-cut+slices+of+human+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).</li><li>Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+glioma+cell+invasion+using+organotypic+brain+slice+culture.">A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture.</a> Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).</li><li>Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mucinous+tumors+of+the+ovary+and+appendix.+A+clinicopathologic+study+of+25+cases.">Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases.</a> The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).</li><li>Mizuta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+accompanied+by+intraductal+papillary+mucinous+neoplasm+of+the+pancreas.">Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas.</a> Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).</li><li>Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+originating+from+transverse+colon+mucinous+adenocarcinoma:+A+case+report+and+literature+review.">Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).</li><li>Fleten, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+treatment+of+mucinous+peritoneal+metastases+using+patient-derived+xenograft+models.">Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models.</a> Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).</li><li>Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+mouse+models+of+pseudomyxoma+peritonei+recapitulate+the+human+inflammatory+tumor+microenvironment.">Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment.">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoid+(PDO)+platforms+to+facilitate+clinical+decision+making.">Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).</li><li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies.">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).</li><li>Carr, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+in+the+pathology+of+peritoneal+surface+malignancy.">New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+repeat+cytoreductive+surgery+with+hyperthermic+intraperitoneal+chemotherapy+for+the+treatment+of+peritoneal+surface+malignancy.">Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).</li><li>Weitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-vivo+organotypic+culture+platform+for+functional+interrogation+of+human+appendiceal+cancer+reveals+a+prominent+and+heterogenous+immunological+landscape.">An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape.</a> Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies.">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).</li></ol>

Ce manuscrit décrit une technique qui peut être utilisée pour cultiver, interroger et analyser des échantillons tumoraux humains de pseudomyxome péritoné (PMP). Nous avons utilisé de nombreux tests fonctionnels en aval pour interroger le microenvironnement immunitaire tumoral et une plate-forme pour les tests du laboratoire au chevet du patient.
Bien que la méthode soit très efficace entre nos mains, il faudra un peu de pratique pour couper des échantillons tumoraux à l’aide d’u...

Le pseudomyxome péritonique (PMP) est un syndrome rare avec un taux d’incidence de 1 par million de personnes par an1. La plupart des cas de PMP sont causés par des métastases de néoplasmes appendiceux. Étant donné que les souris n’ont pas d’appendice semblable à celui de l’homme, la modélisation de ce type de cancer reste extrêmement difficile. Bien que la maladie primaire soit souvent curable par résection chirurgicale, les options de traitement de la maladie métastatique sont limitées. Par conséquent, la raison d’être du développement de ce nouveau modèle de tranches organotypiques est d’étudier la pathobiologie de PMP. À ce jour, il n’existe aucun modèle organoïde appendice pouvant être cultivé perpétuellement; Cependant, un modèle récent s’est révélé utile pour les tests pharmacologiques d’agents thérapeutiques et d’immunothérapie2. En tant que tel, nous avons adapté un système de culture de tranches organotypiques, qui a été utilisé dans d’autres types de cancers humains, tels que le cerveau, le sein, le pancréas, le poumon, l’ovaire et d’autres 3,4,5,6.
En plus des néoplasmes annexes, la PMP résulte occasionnellement d’autres types de tumeurs, notamment les cancers de l’ovaire7 et, dans de rares circonstances, les tumeurs mucineuses papillaires intracanalaires8 et le cancer du côlon9. De plus, ces tumeurs ont tendance à croître lentement, avec de faibles taux de greffe dans les modèles de xénogreffe dérivée du patient (PDX)10,11. Compte tenu de ces défis, il existe un besoin non satisfait de développer des modèles pour étudier cette maladie afin de commencer à comprendre la pathobiologie de la PMP et comment ces cellules cancéreuses sont recrutées sur les surfaces péritonéales, prolifèrent et échappent à la surveillance immunitaire.
Bien que coupées de la circulation vasculaire systémique, les tranches tumorales contiennent des composants cellulaires et acellulaires, y compris la matrice extracellulaire, les cellules stromales, les cellules immunitaires, les cellules cancéreuses, les cellules endothéliales et les nerfs. Ce microenvironnement semi-intact permet l’investigation fonctionnelle de ces types cellulaires, ce qui est particulièrement avantageux par rapport aux cultures organoïdes 3D, qui ne sont constituées que de cellules cancéreuses12. Bien que les cultures de tranches organotypiques soient avantageuses à certains égards, elles constituent également une approche intrinsèquement basée sur le faible débit, par rapport aux organoïdes 3D, qui peuvent être étendus et conviennent au criblage multiplexé de médicaments thérapeutiques expérimentaux13,14,15. Dans le cas du PMP, il n’y a eu aucun rapport documentant l’établissement fiable et le passage perpétuel d’organoïdes dérivés du PMP16. Cela est probablement dû à la nature à croissance lente des cellules tumorales dérivées de la PMP, ainsi qu’au faible nombre de cellules épithéliales malignes trouvées dans ces tumeurs mucineuses. Compte tenu de la nécessité de développer des modèles pour étudier la PMP, les tranches organotypiques sont particulièrement adaptées à l’étude de cette maladie. Nous présentons un protocole de préparation, d’imagerie et d’analyse des PMP à partir de spécimens humains.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 40 glass coverslips</td>
			<td>Daiggerbrand</td>
			<td>G15972H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S&#160;</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>4080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>321140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>555333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>357410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/Hyaluronidase&#160;</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>7912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD-Blue&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD imaging dyes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Isamtec</td>
			<td>ISM832C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens

Le pseudomyxome peritonei (PMP) est une maladie rare qui résulte de la dissémination d’une tumeur primaire mucineuse et de l’accumulation résultante de cellules tumorales sécrétant de la mucine dans la cavité péritonéale. La PMP peut provenir de divers types de cancers, y compris l’appendice, l’ovaire et le colorectal, bien que les néoplasmes de l’appendice soient de loin l’étiologie la plus courante. La PMP est difficile à étudier en raison de (1) sa rareté, (2) ses modèles murins limités et (3) son histologie acellulaire mucineuse. La méthode présentée ici permet de visualiser et d’interroger en temps réel ces types de tumeurs à l’aide de tranches organotypiques ex vivo dérivées du patient dans une préparation où le microenvironnement tumoral (TME) reste intact. Dans ce protocole, nous décrivons d’abord la préparation de tranches tumorales à l’aide d’un vibratome et la culture ultérieure à long terme. Deuxièmement, nous décrivons l’imagerie confocale des tranches tumorales et comment surveiller les lectures fonctionnelles de la viabilité, de l’imagerie calcique et de la prolifération locale. En bref, les tranches sont chargées de colorants d’imagerie et sont placées dans une chambre d’imagerie qui peut être montée sur un microscope confocal. Des vidéos accélérées et des images confocales sont utilisées pour évaluer la viabilité initiale et la fonctionnalité cellulaire. Cette procédure explore également le mouvement cellulaire translationnel et les interactions de signalisation paracrine dans le TME. Enfin, nous décrivons un protocole de dissociation pour les tranches tumorales à utiliser pour l’analyse de cytométrie en flux. L’analyse quantitative par cytométrie en flux peut être utilisée pour les tests thérapeutiques du laboratoire au chevet du patient afin de déterminer les changements qui se produisent dans le paysage immunitaire et le contenu des cellules épithéliales.

En bref, les échantillons de tumeurs humaines provenant du PMP sont obtenus dans le cadre d’un protocole approuvé par l’IRB. Le tissu est préparé, microdisséqué et solidifié dans un moule en agarose pour être coupé à l’aide d’un vibratome (figure 1A; Vidéo 1). Une fois coupées, les tranches de tissu sont placées et cultivées sur des membranes d’insertion perméables (Figure 1B), qui peuvent être utilisées pour des essai...

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Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Nous décrivons un protocole pour la production, la culture et la visualisation des cancers humains, qui ont métastasé aux surfaces péritonéales. Les échantillons tumoraux réséqués sont coupés à l’aide d’un vibratome et cultivés sur des inserts perméables pour une oxygénation et une viabilité accrues, suivis d’une imagerie et d’analyses en aval utilisant la microscopie confocale et la cytométrie en flux.

Culture et imagerie de tranches tumorales organotypiques ex vivo de pseudomyxomes péritonei à partir de spécimens tumoraux humains réséqués

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Cette recherche démontre une nouvelle approche de l’étude des thérapies et de la pathobiologie du cancer appendice dans un contexte préclinique. Ces méthodes peuvent être plus largement applicables à l’étude d’autres tumeurs malignes. Le cancer de l’appendice est difficile à étudier étant donné sa faible incidence en l’absence d’appendice chez la souris pour la modélisation de la maladie.Cette technique permet l’étude des interactions cellulaires au sein du microenvironnement tumoral. Cette méthode peut être appliquée pour étudier la biologie de plusieurs types de cancers qui ont tendance à métastaser dans l’épiploon, tels que les cancers colorectal et ovarien. Commencez par préparer les milieux de transport et de culture.À l’arrivée des tissus, transférer les tissus tumoraux du pseudomyxome peritonei dans 35 DMEM complets contenant des plats de six centimètres de diamètre. En plus d’enlever toute mucine liquéfiée ou les régions tissulaires très mucineuses, enlevez tout tissu difficile à couper avec un scalpel. Coupez les nodules du tissu tumoral grossièrement en morceaux cubes d’un centimètre plus petits.pour la préparation de l’agarose et l’encastrement tissulaire, préparer une solution à 5 % d’agarose à bas point de fusion dans du PBS sans sérum bovin fœtal ni FBS le même jour si les tissus arrivent. Ajouter la solution liquide à 5% d’agarose aux boîtes de six centimètres contenant deux à trois échantillons tumoraux plus petits jusqu’à ce qu’elle recouvre l’échantillon. Placez les mouchoirs en papier incrustés dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Démontez les échantillons de tissu sur le vibratome, retirez la tarière solidifiée du réfrigérateur et coupez les cubes d’agarose légèrement plus grands que la largeur du tissu à l’aide d’un scalpel. Appliquez la super colle sur l’étage de vibratome et placez doucement le cube d’agarose sur la super colle pendant une à deux minutes pour la fixation. Fixez la lame au vibratome et réglez l’épaisseur de la section de tissu à environ 150 à 250 microns pour une imagerie optimale en aval.Pour mettre en culture les tranches de tissu, préparez une plaque d’insertion perméable en ajoutant deux millilitres de média DMEM complet au-dessus de la membrane perméable et trois millilitres sous la membrane perméable. Ensuite, soulevez doucement les tranches de tissu hors de la chambre de coupe du vibratome à l’aide d’un pinceau mince et placez deux à quatre tranches dans des boîtes de culture perméables contenant du DMEM complet. Cultivez les tranches jusqu’à sept jours à 37 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone à 5%.Pendant le remplacement des milieux, toutes les 24 heures, ajouter du bortézomib comme témoin de la destruction cellulaire et des chimiothérapies testables 5-fluorouracile, ou 5-FU, dans les milieux de culture pour effectuer une intervention pharmacologique. Placez les tranches tumorales pour l’analyse d’imagerie confocale dans un seul puits d’une boîte de 12 puits contenant du PBS avec 1% FBS. Pour les expériences d’imagerie calcique, au lieu de PBS, incuber les tranches dans une solution de calcium extracellulaire.Colorer les échantillons avec des colorants d’imagerie pour déterminer la viabilité des tranches de tissu. Incuber pendant 10 minutes à une heure après l’ajout du colorant de viabilité. Après l’incubation, transférer les tranches dans une boîte de Petri à fond de verre optiquement transparent contenant du PBS avec 1% FBS à utiliser pour l’imagerie sur un appareil d’imagerie confocale.Couper un petit morceau à l’extrémité d’une pointe de pipette d’un millilitre pour élargir l’ouverture, permettant une dissociation mécanique vigoureuse par pipetage. Incuber des tranches à 37 degrés Celsius avec rotation de cinq à 15 minutes dans un millilitre de tampon de digestion, avec une perturbation tissulaire vigoureuse deux à trois fois pendant l’incubation par dissociation mécanique. Une fois le tissu digéré, transférez le tissu perturbé avec un milieu de digestion sur un filtre de 70 micromètres placé sur un tube conique de 50 millilitres.Choisissez des morceaux plus gros à l’aide d’une pince stérile ou d’une pipette. À l’aide du backend émoussé d’une seringue en plastique de cinq millilitres, écrasez toutes les tranches non dissociées plus grosses et lavez-les avec quatre millilitres de PBS contenant 2% FBS. Prenez le surnageant cellulaire dissocié et centrifugez à 300G pendant cinq à 10 minutes.Retirez le surnageant et lavez la pastille avec un millilitre de PBS contenant 2% FBS. Pour préparer l’échantillon à la cytométrie en flux, ajoutez le tampon de blocage contenant 50 microlitres de bloc FC humain et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Effectuer une coloration cellulaire supplémentaire en utilisant les anticorps respectifs dans 50 microlitres de PBS contenant 2% FBS.Aliquote cinq millilitres de milieu complet pour les conditions de contrôle et de traitement. Sur les deux à quatre tranches plaquées sur les boîtes perméables, ajouter les milieux provenant des aliquotes du traitement témoin et les combinaisons thérapeutiques supplémentaires à utiliser pour l’analyse de la viabilité en aval et des morts vivants. Laisser les tranches de tissu dans une culture contenant du DMEM complet pendant deux à cinq jours, en changeant de milieu ainsi que le bortézomib et le 5-FU tous les deux jours.Pour l’analyse de viabilité luminescente, ajoutez 500 microlitres de PBS dans un plat de 12 puits et transférez les tranches de tissu appariées séquentiellement à la solution de PBS à l’aide d’un pinceau ou d’une pipette d’un millilitre. Retirez le PBS des tranches. Ajouter 500 microlitres de la solution de viabilité luminescente par condition et incuber avec une rotation lente sur l’agitateur à température ambiante pendant 30 minutes avant de lire la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaque de luminescence.La coloration de la mucine dans les tranches de tissu a été visualisée à l’aide d’une coloration périodique par décalage acide et d’anticorps spécifiques à la mucine. L’incubation de calcéine AM et d’iodure de propidium a déterminé la santé et la viabilité. Les noyaux chevauchaient les cellules proliférées pendant la culture.Ces résultats ont été quantifiés pour déterminer le nombre de cellules proliférantes dans la tranche tumorale. Les tranches incubées dans l’anticorps conjugué PE CD11b et Fluo-4 AM, ont marqué les cellules immunitaires locales dans la CTU. Des images à l’échelle pseudo-couleur montrant les niveaux de calcium intracellulaire ont permis de visualiser les niveaux différentiels de calcium intracellulaire.L’activité spontanée suivie et le temps écoulé avant, pendant et après la réponse intercellulaire au calcium dans la cellule immunitaire positive CD11b mise en évidence sont présentés ici. Les traces brutes de réponses calciques dans la cellule immunitaire CD11b, ainsi que dans d’autres cellules sensibles et non sensibles ont été quantifiées. Les résultats représentatifs de l’immunotypage d’un échantillon de tumeur de patient avec pseudomyxome peritonei sont présentés ici.La quantification du profil immunologique tumoral a montré que l’échantillon de donneur 337 a des niveaux élevés de macrophages M2, ce qui indique que l’utilisation de tranches de tissu dérivées de pseudomyxoma peritonei a permis d’interroger le paysage cellulaire unique du donneur des échantillons tumoraux du patient. La pharmacotypage et l’analyse en aval de tranches de tissus humains de pseudomyxoma peritonei ont montré la destruction des cellules dans les tranches tumorales, comme le confirment l’analyse de cytotoxicité et l’imagerie confocale tunnel. En réponse au médicament cytotoxique, le bortézomib et le 5-fluorouracile.L’analyse de viabilité luminescente a été effectuée à l’aide de tranches appariées séquentiellement. La production réussie de tranches à partir de tumeurs mucineuses nécessite une dissection méticuleuse et l’élimination des composants tissulaires cellulaires et acellulaires comme la graisse et les tissus denses de la paroi abdominale. Cette technique peut permettre de modéliser les interactions entre les cellules cancéreuses et plusieurs types de cellules dans le microenvironnement tumoral, telles que les interactions entre les cellules adipeuses, vasculaires et immunitaires.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

Modèle in vivo pour tester l&#39; effet de l&#39; hypoxie sur la tumeur métastase

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

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Ex Vivo Imagerie des Lymphocytes T CD8 résident dans des tumeurs du poumon humain tranches à l’aide de la microscopie confocale

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo Évaluation des EPR du pH, pO2, statut Redox et les Concentrations de Phosphate et de glutathion dans le microenvironnement tumoral

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Gène rapporteur de radionucléide-fluorescence Imaging pour suivre la Progression tumorale dans les modèles de rongeurs tumeur

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for la Variation génétique chez un Patient sporadiques de la polypose adénomateuse familiale en utilisant le Format de puce-in-a-tube

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirus pour tumeur ciblées Immunomodulation : conception et évaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

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Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Culture, Manipulation et Transplantation orthotopique d'organoïdes tumoraux de la vessie de souris

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Génération de tumeurs pancréatiques orthopiques et caractérisation ex vivo de la cytotoxicité des cellules T infiltrantes

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Un nouveau modèle 3D de Sphéroïde de tumeur de Stromal-Modulé pour étudier l’interaction de tumeur-Stroma et la découverte de drogue

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...