Name: culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens
Uploaded: 2022-12-09T13:55:00
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Die Autoren bedanken sich bei Kersi Pestonjamasp von der Moores Cancer Center Imaging Core Facility für die Hilfe mit dem UCSD Specialized Cancer Support Center P30 Grant 2P30CA023100. Diese Arbeit wurde zusätzlich durch ein JoVE-Publikationsstipendium (JRW) sowie großzügige Schenkungen aus dem Nachlass von Elisabeth und Ad Creemers, der Euske Family Foundation, dem Gastrointestinal Cancer Research Fund und dem Peritoneal Metastasis Research Fund (AML) unterstützt.

Die Deidentifizierung und Gewinnung aller Gewebe wurde im Rahmen eines vom IRB genehmigten Protokolls an der University of California, San Diego, durchgeführt.
1. Aufbereitung von humanem PMP-Gewebe für die Gewebeverarbeitung und -kultur
<ol><li>Transport von Tumorgewebe und Mikrodissektion<ol><li>Bereiten Sie die Transport- und Nährmedien vor: Füllen Sie 10 % (v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen-Strept...

<ol>
	<li>Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei.">Pseudomyxoma peritonei.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendiceal+cancer+patient-specific+tumor+organoid+model+for+predicting+chemotherapy+efficacy+prior+to+initiation+of+treatment:+A+feasibility+study.">Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).</li><li>Holliday, D. 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D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mucinous+tumors+of+the+ovary+and+appendix.+A+clinicopathologic+study+of+25+cases.">Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases.</a> The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).</li><li>Mizuta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+accompanied+by+intraductal+papillary+mucinous+neoplasm+of+the+pancreas.">Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas.</a> Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).</li><li>Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+originating+from+transverse+colon+mucinous+adenocarcinoma:+A+case+report+and+literature+review.">Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).</li><li>Fleten, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+treatment+of+mucinous+peritoneal+metastases+using+patient-derived+xenograft+models.">Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models.</a> Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).</li><li>Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. 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L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies.">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).</li><li>Carr, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+in+the+pathology+of+peritoneal+surface+malignancy.">New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+repeat+cytoreductive+surgery+with+hyperthermic+intraperitoneal+chemotherapy+for+the+treatment+of+peritoneal+surface+malignancy.">Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).</li><li>Weitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-vivo+organotypic+culture+platform+for+functional+interrogation+of+human+appendiceal+cancer+reveals+a+prominent+and+heterogenous+immunological+landscape.">An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape.</a> Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies.">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).</li></ol>

Dieses Manuskript beschreibt eine Technik, die zur Kultivierung, Abfrage und Analyse von humanen Pseudomyxoma peritonei (PMP)-Tumorproben verwendet werden kann. Wir haben zahlreiche nachgeschaltete funktionelle Assays verwendet, um die Mikroumgebung des Tumorimmunsystems zu untersuchen, und eine Plattform für Tests vom Labor bis zum Krankenbett.
Während die Methode in unseren Händen sehr effizient ist, erfordert es etwas Übung, Tumorproben mit einem Vibratom zu schneiden. Wir stießen näm...

Das Pseudomyxoma peritonei (PMP) ist ein seltenes Syndrom mit einer Inzidenzrate von 1 pro Million Menschen und Jahr1. Die meisten PMP-Fälle werden durch Metastasen aus Blinddarmneoplasien verursacht. Da Mäuse keinen menschenähnlichen Blinddarm haben, bleibt die Modellierung dieser Krebsart eine große Herausforderung. Während die Grunderkrankung oft durch eine chirurgische Resektion heilbar ist, sind die Behandlungsmöglichkeiten bei metastasierten Erkrankungen begrenzt. Daher ist die Begründung für die Entwicklung dieses neuartigen organotypischen Schnittmodells die Untersuchung der Pathobiologie von PMP. Bis heute gibt es keine Appendiceal-Organoid-Modelle, die dauerhaft kultiviert werden können. Ein aktuelles Modell hat sich jedoch als nützlich für die pharmakologische Testung von Therapeutika und Immuntherapie erwiesen2. Aus diesem Grund haben wir ein organotypisches Schnittkultursystem angepasst, das bereits bei anderen Krebsarten des Menschen eingesetzt wurde, wie z. B. Gehirn-, Brust-, Bauchspeicheldrüsen-, Lungen-, Eierstockkrebs und anderen 3,4,5,6.
Neben Appendiceal-Neoplasien resultiert PMP gelegentlich auch aus anderen Tumorarten, darunter Ovarialkarzinome7 und in seltenen Fällen intraduktale papilläre muzinöse Neoplasien8 und Kolonkarzinom9. Darüber hinaus neigen diese Tumoren dazu, langsam zu wachsen, mit schlechten Transplantatraten in patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen (PDX)10,11. Angesichts dieser Herausforderungen besteht ein ungedeckter Bedarf an der Entwicklung von Modellen zur Untersuchung dieser Krankheit, um die Pathobiologie von PMP zu verstehen und zu verstehen, wie diese Krebszellen an die Peritonealoberflächen rekrutiert werden, sich vermehren und der Immunüberwachung entkommen.
Während Tumorschnitte aus dem systemischen Gefäßkreislauf geschnitten werden, enthalten sie zelluläre und azelluläre Komponenten, darunter die extrazelluläre Matrix, Stromazellen, Immunzellen, Krebszellen, Endothelzellen und Nerven. Diese semi-intakte Mikroumgebung ermöglicht die funktionelle Untersuchung dieser Zelltypen, was im Vergleich zu 3D-Organoidkulturen, die nur aus Krebszellen bestehen, einen einzigartigen Vorteil hat12. Während organotypische Schnittkulturen in mancher Hinsicht vorteilhaft sind, sind sie im Vergleich zu 3D-Organoiden, die expandiert werden können, auch von Natur aus ein Ansatz mit niedrigem Durchsatz und eignen sich für das Multiplex-Screening therapeutischer Prüfpräparate13,14,15. Im Fall von PMP gibt es keine Berichte, die eine zuverlässige Etablierung und fortwährende Weitergabe von PMP-abgeleiteten Organoiden belegen16. Dies ist wahrscheinlich auf das langsame Wachstum von PMP-abgeleiteten Tumorzellen sowie auf die geringe Anzahl bösartiger Epithelzellen zurückzuführen, die in diesen muzinösen Tumoren zu finden sind. Angesichts der Notwendigkeit, Modelle zur Untersuchung von PMP zu entwickeln, sind organotypische Schnitte besonders gut geeignet, um diese Krankheit zu untersuchen. Wir stellen ein Protokoll zur Präparation, Bildgebung und Analyse von PMP aus menschlichen Proben vor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 40 glass coverslips</td>
			<td>Daiggerbrand</td>
			<td>G15972H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S&#160;</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>4080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>321140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>555333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>357410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/Hyaluronidase&#160;</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>7912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD-Blue&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD imaging dyes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Isamtec</td>
			<td>ISM832C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens

Das Pseudomyxoma peritonei (PMP) ist eine seltene Erkrankung, die durch die Ausbreitung eines muzinösen Primärtumors und die daraus resultierende Ansammlung von Muzin-sezernierenden Tumorzellen in der Bauchhöhle entsteht. PMP kann durch verschiedene Arten von Krebs entstehen, einschließlich Blinddarmkrebs, Eierstockkrebs und Darmkrebs, obwohl Blinddarmtumoren bei weitem die häufigste Ätiologie sind. PMP ist aufgrund seiner (1) Seltenheit, (2) begrenzten Mausmodellen und (3) muzinöser, azellulärer Histologie schwierig zu untersuchen. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung und -Abfrage dieser Tumorarten unter Verwendung von patienteneigenen ex vivo organotypischen Schnitten in einem Präparat, bei dem die Tumormikroumgebung (TME) intakt bleibt. In diesem Protokoll beschreiben wir zunächst die Präparation von Tumorschnitten mit einem Vibratom und die anschließende Langzeitkultur. Zweitens beschreiben wir die konfokale Bildgebung von Tumorschnitten und wie funktionelle Messwerte der Viabilität, der Kalziumbildgebung und der lokalen Proliferation überwacht werden können. Kurz gesagt, die Schichten werden mit bildgebenden Farbstoffen beladen und in eine Bildgebungskammer gelegt, die auf ein konfokales Mikroskop montiert werden kann. Zeitraffervideos und konfokale Bilder werden verwendet, um die anfängliche Lebensfähigkeit und zelluläre Funktionalität zu beurteilen. Dieses Verfahren untersucht auch die translationale zelluläre Bewegung und parakrine Signalinteraktionen im TME. Abschließend beschreiben wir ein Dissoziationsprotokoll für Tumorschnitte, die für die durchflusszytometrische Analyse verwendet werden sollen. Die quantitative Durchflusszytometrie kann für therapeutische Tests vom Labor bis zum Krankenbett verwendet werden, um Veränderungen innerhalb der Immunlandschaft und des Epithelzellgehalts zu bestimmen.

Kurz gesagt, menschliche Tumorproben von PMP werden nach einem vom IRB genehmigten Protokoll gewonnen. Das Gewebe wird präpariert, mikropräpariert und in einer Agaroseform verfestigt, um mit einem Vibratom geschnitten zu werden (Abbildung 1A; Video 1). Nach dem Schneiden werden Gewebeschnitte auf permeablen Einlegemembranen platziert und kultiviert (Abbildung 1B), die sowohl für bildgebende Assays in situ als auch für zelluläre und...

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Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Wir beschreiben ein Protokoll für die Herstellung, Kultivierung und Visualisierung von menschlichen Krebserkrankungen, die Metastasen in die Peritonealoberflächen gebildet haben. Resezierte Tumorproben werden mit einem Vibratom geschnitten und auf permeablen Einsätzen kultiviert, um die Sauerstoffversorgung und Viabilität zu erhöhen, gefolgt von Bildgebung und nachgeschalteten Analysen mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie.

Kultivierung und Bildgebung von ex vivo organotypischen Pseudomyxoma-Peritonei-Tumorschnitten aus resezierten humanen Tumorproben

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Diese Forschung demonstriert einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung von Blinddarmkrebstherapeutika und Pathobiologie in einem präklinischen Umfeld. Diese Methoden könnten auf breiterer Basis auf die Untersuchung anderer Malignome anwendbar sein. Blinddarmkrebs ist aufgrund seiner geringen Inzidenz in Abwesenheit eines Blinddarms bei Mäusen zur Krankheitsmodellierung schwer zu untersuchen.Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Zellinteraktionen innerhalb der Tumormikroumgebung. Diese Methode kann angewendet werden, um die Biologie verschiedener Krebsarten zu untersuchen, die dazu neigen, in das Omentum zu metastasieren, wie z. B. Darm- und Eierstockkrebs. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Transport- und Kulturmedien.Nach der Ankunft des Gewebes wird das Tumorgewebe des Pseudomyxoma peritonei in 35 vollständige DMEM-Gewebe mit Schalen mit einem Durchmesser von sechs Zentimetern überführt. Entfernen Sie nicht nur verflüssigten Schleim oder stark schleimige Geweberegionen, sondern auch Gewebe, das sich nur schwer mit einem Skalpell schneiden lässt. Tumorgewebeknötchen grob in einen Würfel Zentimeter kleinere Stücke schneiden.Für die Agarosepräparation und Gewebeeinbettung wird am selben Tag eine 5%ige Lösung der niedrigschmelzenden Agarose in PBS ohne fötales Kälberserum oder FBS hergestellt, wenn das Gewebe eintrifft. Geben Sie die flüssige 5%ige Agarose-Lösung in die sechs Zentimeter großen Schalen mit zwei bis drei kleineren Tumorproben, bis sie die Probe bedeckt. Legen Sie die eingebetteten Taschentücher für 30 Minuten in einen Kühlschrank bei vier Grad Celsius.Demontieren Sie die Gewebeproben auf dem Vibratom, nehmen Sie die erstarrte Schnecke aus dem Kühlschrank und schneiden Sie die Agarosewürfel mit einem Skalpell etwas größer als die Breite des Gewebes. Tragen Sie Sekundenkleber auf die Vibratomstufe auf und legen Sie den Agarosewürfel zum Fixieren vorsichtig ein bis zwei Minuten lang auf den Sekundenkleber. Befestigen Sie die Klinge am Vibratom und stellen Sie die Dicke des Gewebeabschnitts auf etwa 150 bis 250 Mikrometer ein, um eine optimale nachgeschaltete Bildgebung zu gewährleisten.Um die Gewebeschnitte zu kultivieren, bereiten Sie eine durchlässige Einlegeplatte vor, indem Sie zwei Milliliter des vollständigen DMEM-Mediums oberhalb der permeablen Membran und drei Milliliter unterhalb der permeablen Membran hinzufügen. Heben Sie anschließend die Gewebescheiben mit einem dünnen Pinsel vorsichtig aus der Schneidkammer des Vibratoms und legen Sie zwei bis vier Scheiben in durchlässige Kulturschalen mit komplettem DMEM. Kultivieren Sie die Scheiben bis zu sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid.Während des Medienaustauschs fügen Sie alle 24 Stunden Bortezomib als Kontrollen für die Zelltötung und testbare Chemotherapien 5-Fluorouracil oder 5-FU zu den Nährmedien hinzu, um eine pharmakologische Intervention durchzuführen. Legen Sie Tumorschnitte für die konfokale Bildgebungsanalyse in eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Schale, die PBS mit 1 % FBS enthält. Für Kalzium-Bildgebungsexperimente werden die Scheiben anstelle von PBS in einer extrazellulären Kalziumlösung inkubiert.Färben Sie Proben mit bildgebenden Farbstoffen, um die Lebensfähigkeit von Gewebeschnitten zu bestimmen. Nach Zugabe des Viabilitätsfarbstoffs 10 Minuten bis eine Stunde inkubieren. Übertragen Sie die Scheiben nach der Inkubation in eine Petrischale mit optisch klarem Glasboden, die PBS mit 1 % FBS enthält, um sie für die Bildgebung auf einem konfokalen Bildgebungsgerät zu verwenden.Schneiden Sie ein kleines Stück vom Ende einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ab, um die Öffnung zu erweitern und eine kräftige mechanische Dissoziation durch Pipettieren zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Scheiben bei 37 Grad Celsius unter Drehung für fünf bis 15 Minuten in einem Milliliter Verdauungspuffer, wobei das Gewebe während der Inkubation zwei- bis dreimal durch mechanische Dissoziation stark aufgebrochen wird. Sobald das Gewebe verdaut ist, übertragen Sie das aufgebrochene Gewebe mit Verdauungsmedien auf einen 70-Mikrometer-Filter, der auf einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist.Größere Stücke mit einer sterilen Pinzette oder einer Pipette entnehmen. Zerdrücken Sie mit dem stumpfen Ende einer Fünf-Milliliter-Plastikspritze alle größeren, nicht dissoziierten Scheiben und waschen Sie sie mit vier Millilitern PBS, das 2 % FBS enthält. Nehmen Sie den dissoziierten Zellüberstand und zentrifugieren Sie ihn fünf bis 10 Minuten lang bei 300 G.Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter PBS, das 2 % FBS enthält. Um die Probe für die Durchflusszytometrie vorzubereiten, fügen Sie den Blockierungspuffer mit 50 Mikrolitern humanem FC-Block hinzu und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Führen Sie eine extrazelluläre Färbung mit den entsprechenden Antikörpern in 50 Mikrolitern PBS mit 2 % FBS durch.Aliquotieren Sie fünf Milliliter Komplettmedien für Kontroll- und Behandlungsbedingungen. Auf die zwei bis vier Scheiben, die auf die durchlässigen Schalen gelegt werden, werden die Medien aus den Aliquoten der Kontrollbehandlung und die zusätzlichen Kombinationstherapien hinzugefügt, die für die nachgeschaltete Viabilitäts- und Lebendtotanalyse verwendet werden sollen. Lassen Sie die Gewebeschnitte zwei bis fünf Tage lang in einer Kultur, die vollständiges DMEM enthält, und wechseln Sie dabei alle zwei Tage das Medium sowie Bortezomib und 5-FU.Für die lumineszierende Viabilitätsanalyse geben Sie 500 Mikroliter PBS in eine 12-Well-Schale und übertragen die nacheinander aufeinander abgestimmten Gewebescheiben mit einem Pinsel oder einer Ein-Milliliter-Pipette in die PBS-Lösung. Entfernen Sie das PBS aus den Scheiben. Fügen Sie 500 Mikroliter der lumineszierenden Viabilitätslösung pro Bedingung hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang mit einer langsamen Drehung auf dem Schüttler bei Raumtemperatur, bevor Sie die Lumineszenz mit einem Lumineszenzplattenleser ablesen.Die Muzinfärbung in Gewebeschnitten wurde mittels periodischer Säureverschiebungsfärbung und muzinspezifischer Antikörper visualisiert. Die Inkubation in Calcein AM und Propidiumiodid bestimmte die Gesundheit und Lebensfähigkeit. Die Zellkerne überlappten die Zellen, die sich während der Kultur vermehrten.Diese Ergebnisse wurden quantifiziert, um die Anzahl der proliferierenden Zellen innerhalb des Tumorschnitts zu bestimmen. Die Scheiben inkubierten CD11b PE konjugierten Antikörper und Fluo-4 AM markierten die lokalen Immunzellen in CTU. Pseudofarbenskalierte Bilder, die den intrazellulären Kalziumspiegel zeigten, ermöglichten die Visualisierung unterschiedlicher Konzentrationen von intrazellulärem Kalzium.Die Spontanaktivität vor, während und nach der interzellulären Kalziumantwort innerhalb der hervorgehobenen CD11b-positiven Immunzelle wird hier gezeigt. Die rohen Spuren von Kalziumantworten in der CD11b-Immunzelle, zusammen mit anderen responsiven und nicht-responsiven Zellen, wurden quantifiziert. Repräsentative Ergebnisse der Immuntypisierung einer Patiententumorprobe mit Pseudomyxoma peritonei sind hier dargestellt.Die Quantifizierung des Tumorimmunprofils zeigte, dass die Spenderprobe 337 hohe Konzentrationen von M2-Makrophagen aufweist, was darauf hindeutet, dass die Verwendung von aus Pseudomyxoma peritonei gewonnenen Gewebeschnitten die Abfrage der einzigartigen zellulären Spenderlandschaft der Patiententumorproben ermöglichte. Die Pharmakotypisierung und die nachgelagerte Analyse von Gewebeschnitten aus humanem Gewebe des Pseudomyxoma peritonei zeigten die Abtötung von Zellen in Tumorschnitten, was durch Zytotoxizitätsanalysen und konfokale Tunnelbildgebung bestätigt wurde. Als Reaktion auf das Zytostatikum Bortezomib und 5-Fluorouracil.Die Lumineszenz-Viabilitätsanalyse wurde mit sequenziell abgestimmten Schichten durchgeführt. Die erfolgreiche Herstellung von Schnitten aus muzinösen Tumoren erfordert eine sorgfältige Präparation und Entfernung von zellulären und azellulären Gewebebestandteilen wie Fett und dichtem Bauchwandgewebe. Diese Technik kann die Modellierung von Interaktionen zwischen Krebszellen und mehreren Zelltypen in der Tumormikroumgebung ermöglichen, wie z. B. Interaktionen zwischen Fett-, Gefäß- und Immunzellen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In - vivo - Modell für die Prüfung von Wirkung von Hypoxie auf die Tumormetastasierung

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Forschung

Krebsforschung

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO2, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In Vivo Bildgebung und Quantifizierung der Angiogenreaktion des Wirts bei Zebrafischtumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Kultur, Manipulation und orthotopische Transplantation von Mausblase Tumororganoiden

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Ein neuartiges Stromal Fibroblast-moduliertes 3D-Tumor-Sphäroid-Modell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion und der Arzneimittelforschung

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...