Name: culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens
Uploaded: 2022-12-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Kersi Pestonjamasp del Moores Cancer Center imaging core facility per l'aiuto con i microscopi UCSD Specialized Cancer Support Center P30 grant 2P30CA023100. Questo lavoro è stato inoltre supportato da una sovvenzione di pubblicazione JoVE (JRW), nonché da generose donazioni dalla tenuta di Elisabeth e Ad Creemers, dalla Euske Family Foundation, dal Gastrointestinal Cancer Research Fund e dal Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).

La deidentificazione e l'acquisizione di tutti i tessuti sono state eseguite secondo un protocollo approvato dall'IRB presso l'Università della California, San Diego.
1. Preparazione di tessuti PMP umani per la lavorazione e la coltura di tessuti
<ol><li>Trasporto di tessuti tumorali e microdissezione<ol><li>Preparare i terreni di trasporto e coltura: completare il 10% (v/v) di Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-Glutammina, 1% Penicillina/Streptomycin (Pe...

<ol>
	<li>Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei.">Pseudomyxoma peritonei.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendiceal+cancer+patient-specific+tumor+organoid+model+for+predicting+chemotherapy+efficacy+prior+to+initiation+of+treatment:+A+feasibility+study.">Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Misra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+organotypic+culture+system+of+precision-cut+slices+of+human+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).</li><li>Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+glioma+cell+invasion+using+organotypic+brain+slice+culture.">A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture.</a> Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).</li><li>Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mucinous+tumors+of+the+ovary+and+appendix.+A+clinicopathologic+study+of+25+cases.">Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases.</a> The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).</li><li>Mizuta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+accompanied+by+intraductal+papillary+mucinous+neoplasm+of+the+pancreas.">Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas.</a> Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).</li><li>Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+originating+from+transverse+colon+mucinous+adenocarcinoma:+A+case+report+and+literature+review.">Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).</li><li>Fleten, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+treatment+of+mucinous+peritoneal+metastases+using+patient-derived+xenograft+models.">Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models.</a> Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).</li><li>Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+mouse+models+of+pseudomyxoma+peritonei+recapitulate+the+human+inflammatory+tumor+microenvironment.">Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment.">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoid+(PDO)+platforms+to+facilitate+clinical+decision+making.">Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).</li><li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies.">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).</li><li>Carr, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+in+the+pathology+of+peritoneal+surface+malignancy.">New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+repeat+cytoreductive+surgery+with+hyperthermic+intraperitoneal+chemotherapy+for+the+treatment+of+peritoneal+surface+malignancy.">Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).</li><li>Weitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-vivo+organotypic+culture+platform+for+functional+interrogation+of+human+appendiceal+cancer+reveals+a+prominent+and+heterogenous+immunological+landscape.">An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape.</a> Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies.">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).</li></ol>

Questo manoscritto descrive una tecnica che può essere utilizzata per coltivare, interrogare e analizzare campioni di tumore umano di pseudomixoma peritonei (PMP). Abbiamo utilizzato numerosi saggi funzionali a valle per interrogare il microambiente immunitario del tumore e una piattaforma per i test da banco a letto.
Mentre il metodo è altamente efficiente nelle nostre mani, richiederà una certa pratica per tagliare campioni tumorali usando un vibratomo. Vale a dire, abbiamo riscontrato pr...

Lo pseudomixoma peritonei (PMP) è una sindrome rara con un tasso di incidenza di 1 per milione di persone all'anno1. La maggior parte dei casi di PMP sono causati da metastasi da neoplasie appendicolari. Dato che i topi non hanno un'appendice simile a quella umana, modellare questo tipo di cancro rimane estremamente impegnativo. Mentre la malattia primaria è spesso curabile con la resezione chirurgica, le opzioni di trattamento per la malattia metastatica sono limitate. Pertanto, il razionale per lo sviluppo di questo nuovo modello di fetta organotipica è quello di studiare la patobiologia della PMP. Ad oggi, non esistono modelli di organoidi appendicolari che possano essere coltivati perpetuamente; Tuttavia, un modello recente si è dimostrato utile per la sperimentazione farmacologica di agenti terapeutici e immunoterapia2. Come tale, abbiamo adattato un sistema di coltura a fetta organotipica, che è stato utilizzato in altri tipi di tumori umani, come cervello, seno, pancreas, polmone, ovaio e altri 3,4,5,6.
Oltre alle neoplasie appendicolari, la PMP occasionalmente deriva da altri tipi di tumore, compresi i tumori ovarici7 e, in rare circostanze, neoplasie mucinose papillari intraduttali8 e cancro del colon9. Inoltre, questi tumori tendono a crescere lentamente, con bassi tassi di innesto nei modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX)10,11. Date queste sfide, c'è un bisogno insoddisfatto di sviluppare modelli per studiare questa malattia per iniziare a capire la patobiologia della PMP e come queste cellule tumorali: vengono reclutate sulle superfici peritoneali, proliferano e sfuggono alla sorveglianza immunitaria.
Mentre tagliate dalla circolazione vascolare sistemica, le fette tumorali contengono componenti cellulari e acellulari, tra cui la matrice extracellulare, le cellule stromali, le cellule immunitarie, le cellule tumorali, le cellule endoteliali e i nervi. Questo microambiente semi-intatto consente l'indagine funzionale di questi tipi di cellule, che è unicamente vantaggioso rispetto alle colture organoidi 3D, che consistono solo di cellule tumorali12. Mentre le colture organotipiche a fette sono vantaggiose sotto alcuni aspetti, sono anche intrinsecamente un approccio basato su basse entrate, rispetto agli organoidi 3D, che possono essere ampliati e sono adatti per lo screening terapeutico sperimentale multiplex13,14,15. Nel caso del PMP, non ci sono state segnalazioni che documentassero l'istituzione affidabile e il passaggio perpetuo di organoidi derivati da PMP16. Ciò è probabilmente dovuto alla natura a crescita lenta delle cellule tumorali derivate da PMP, nonché al basso numero di cellule epiteliali maligne presenti all'interno di questi tumori mucinosi. Data la necessità di sviluppare modelli per studiare la PMP, le fette organotipiche sono particolarmente adatte a studiare questa malattia. Presentiamo un protocollo per la preparazione, l'imaging e l'analisi di PMP da campioni umani.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 40 glass coverslips</td>
			<td>Daiggerbrand</td>
			<td>G15972H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S&#160;</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>4080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>321140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>555333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>357410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/Hyaluronidase&#160;</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>7912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD-Blue&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD imaging dyes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Isamtec</td>
			<td>ISM832C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens

Lo pseudomixoma peritonei (PMP) è una condizione rara che deriva dalla diffusione di un tumore primario mucinoso e dal conseguente accumulo di cellule tumorali che secernono mucina nella cavità peritoneale. La PMP può derivare da vari tipi di tumori, tra cui appendicolare, ovarico e colon-retto, sebbene le neoplasie appendicolari siano di gran lunga l'eziologia più comune. La PMP è difficile da studiare a causa della sua (1) rarità, (2) modelli murini limitati e (3) istologia mucinosa e acellulare. Il metodo qui presentato consente la visualizzazione e l'interrogazione in tempo reale di questi tipi di tumore utilizzando fette organotipiche ex vivo derivate dal paziente in una preparazione in cui il microambiente tumorale (TME) rimane intatto. In questo protocollo, descriviamo prima la preparazione delle fette tumorali usando un vibratomo e la successiva coltura a lungo termine. In secondo luogo, descriviamo l'imaging confocale delle fette tumorali e come monitorare le letture funzionali della vitalità, l'imaging del calcio e la proliferazione locale. In breve, le fette vengono caricate con coloranti di imaging e vengono poste in una camera di imaging che può essere montata su un microscopio confocale. I video time-lapse e le immagini confocali vengono utilizzati per valutare la fattibilità iniziale e la funzionalità cellulare. Questa procedura esplora anche il movimento cellulare traslazionale e le interazioni di segnalazione paracrina nella TME. Infine, descriviamo un protocollo di dissociazione per fette tumorali da utilizzare per l'analisi della citometria a flusso. L'analisi quantitativa della citometria a flusso può essere utilizzata per test terapeutici da banco a letto per determinare i cambiamenti che si verificano all'interno del panorama immunitario e del contenuto delle cellule epiteliali.

In breve, i campioni di tumore umano da PMP sono ottenuti secondo un protocollo approvato dall'IRB. Il tessuto viene preparato, micro-sezionato e solidificato in uno stampo di agarosio per essere tagliato usando un vibratomo (Figura 1A; Video 1). Una volta tagliate, le fette di tessuto vengono posizionate e coltivate su membrane di inserto permeabili (Figura 1B), che possono essere utilizzate per saggi di imaging in situ, nonché per in...

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Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Descriviamo un protocollo per la produzione, la coltura e la visualizzazione dei tumori umani, che hanno metastatizzato alle superfici peritoneali. I campioni tumorali resecati vengono tagliati utilizzando un vibratomo e coltivati su inserti permeabili per una maggiore ossigenazione e vitalità, seguiti da imaging e analisi a valle utilizzando microscopia confocale e citometria a flusso.

Coltura e imaging di fette tumorali ex vivo di pseudomixoma peritonei organotipico da campioni tumorali umani resecati

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Questa ricerca dimostra un nuovo approccio allo studio delle terapie antitumorali appendicolari e della patobiologia in un contesto preclinico. Questi metodi possono essere più ampiamente applicabili allo studio di altri tumori maligni. Il cancro dell'appendice è difficile da studiare data la sua bassa incidenza in assenza di un'appendice nei topi per la modellizzazione della malattia.Questa tecnica permette lo studio delle interazioni cellulari all'interno del microambiente tumorale. Questo metodo può essere applicato per studiare la biologia di più tipi di tumori che hanno la propensione a metastatizzare all'omento, come i tumori del colon-retto e delle ovaie. Inizia preparando i mezzi di trasporto e cultura.All'arrivo del tessuto, trasferire i tessuti tumorali dello pseudomixoma peritonei in 35 DMEM completi contenenti piatti di sei centimetri di diametro. Oltre a rimuovere qualsiasi mucina liquefatta o regioni di tessuto altamente mucinoso, rimuovere qualsiasi tessuto difficile da tagliare con un bisturi. Tagliare i noduli del tessuto tumorale approssimativamente in un centimetro cubo pezzi più piccoli.per la preparazione dell'agarosio e l'incorporazione dei tessuti, preparare una soluzione al 5% di agarosio a basso punto di fusione in PBS senza siero bovino fetale o FBS lo stesso giorno se arrivano i tessuti. Aggiungere la soluzione liquida al 5% di agarosio ai piatti di sei centimetri contenenti da due a tre campioni tumorali più piccoli fino a coprire il campione. Mettere i fazzoletti incorporati in un frigorifero a quattro gradi Celsius per 30 minuti.Smontare i campioni di tessuto sul vibratomo, rimuovere la coclea solidificata dal frigorifero e tagliare i cubetti di agarosio leggermente più grandi della larghezza del tessuto usando un bisturi. Applicare la super colla sullo stadio vibratome e posizionare delicatamente il cubo di agarosio sulla super colla per uno o due minuti per il fissaggio. Fissare la lama al vibratomo e impostare lo spessore della sezione del tessuto a circa 150-250 micron per un'imaging ottimale a valle.Per coltivare le fette di tessuto, preparare una piastra di inserimento permeabile aggiungendo due millilitri di media DMEM completo sopra la membrana permeabile e tre millilitri sotto la membrana permeabile. Quindi, sollevare delicatamente le fette di tessuto dalla camera di taglio del vibratomo usando un pennello sottile e posizionare da due a quattro fette in piatti di coltura permeabili contenenti DMEM completo. Coltiva le fette fino a sette giorni a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.Durante la sostituzione del terreno, ogni 24 ore, aggiungere bortezomib come controlli per l'uccisione cellulare e chemioterapie testabili 5-fluorouracile, o 5-FU, ai terreni di coltura per eseguire l'intervento farmacologico. Posizionare le fette tumorali per l'analisi di imaging confocale in un singolo pozzetto di un piatto a 12 pozzetti contenente PBS con 1% FBS. Per gli esperimenti di imaging del calcio, invece di PBS, incubare le fette in una soluzione di calcio extracellulare.Campioni di macchie con coloranti di imaging per determinare la vitalità delle fette di tessuto. Incubare per 10 minuti a un'ora dopo aver aggiunto il colorante di vitalità. Dopo l'incubazione, trasferire le fette in una capsula di Petri con fondo di vetro otticamente trasparente contenente PBS con 1% FBS da utilizzare per l'imaging su un dispositivo di imaging confocale.Tagliare un piccolo pezzo dall'estremità di una punta di pipetta da un millilitro per allargare l'apertura, consentendo una vigorosa dissociazione meccanica mediante pipettaggio. Incubare le fette a 37 gradi Celsius con rotazione da cinque a 15 minuti in un millilitro di tampone digestivo, con una vigorosa rottura del tessuto due o tre volte durante l'incubazione utilizzando la dissociazione meccanica. Una volta digerito il tessuto, trasferire il tessuto interrotto con mezzi di digestione su un filtro da 70 micrometri posto sopra un tubo conico da 50 millilitri.Scegli pezzi più grandi usando una pinza sterile o una pipetta. Utilizzando il backend smussato di una siringa di plastica da cinque millilitri, schiacciare eventuali fette non dissociate più grandi e lavarle con quattro millilitri di PBS contenente il 2% di FBS. Prendere il surnatante cellulare dissociato e centrifugare a 300G per cinque a 10 minuti.Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con un millilitro di PBS contenente il 2% di FBS. Per preparare il campione per la citometria a flusso, aggiungere il tampone bloccante contenente 50 microlitri di blocco FC umano e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Eseguire la colorazione extracellulare utilizzando i rispettivi anticorpi in 50 microlitri di PBS contenenti il 2% di FBS.Aliquot cinque millilitri di mezzi completi per il controllo e le condizioni di trattamento. Sulle due o quattro fette placcate sulle piastre permeabili, aggiungere i mezzi delle aliquote di trattamento di controllo e le terapie combinate aggiuntive da utilizzare per la vitalità a valle, analisi dei morti vivi. Lasciare le fette di tessuto in una coltura contenente DMEM completo da due a cinque giorni, cambiando i mezzi anche bortezomib e 5-FU a giorni alterni.Per l'analisi della vitalità luminescente, aggiungere 500 microlitri di PBS in un piatto da 12 pozzetti e trasferire le fette di tessuto sequenzialmente abbinate alla soluzione PBS utilizzando un pennello o una pipetta da un millilitro. Rimuovere il PBS dalle sezioni. Aggiungere 500 microlitri della soluzione di vitalità luminescente per condizione e incubare con una rotazione lenta sullo shaker a temperatura ambiente per 30 minuti prima di leggere la luminescenza utilizzando un lettore di piastre a luminescenza.La colorazione della mucina nelle fette di tessuto è stata visualizzata utilizzando la colorazione periodica dello spostamento dell'acido e anticorpi specifici della mucina. L'incubazione in calceina AM e ioduro di propidio ha determinato la salute e la vitalità. I nuclei si sovrapponevano alle cellule proliferate durante la coltura.Questi risultati sono stati quantificati per determinare il numero di cellule proliferanti all'interno della fetta di tumore. Le fette incubate in CD11b PE coniugato anticorpo e Fluo-4 AM, etichettate le cellule immunitarie locali in CTU. Le immagini in scala pseudocolorata che mostrano i livelli di calcio intracellulare hanno permesso di visualizzare i livelli differenziali di calcio intracellulare.L'attività spontanea monitorata e il tempo trascorso prima, durante e dopo la risposta intercellulare del calcio all'interno della cellula immunitaria CD11b positiva evidenziata sono mostrati qui. Sono state quantificate le tracce grezze delle risposte del calcio nella cellula immunitaria CD11b, insieme ad altre cellule sensibili e non reattive. I risultati rappresentativi dell'immunotipizzazione di un campione di tumore di un paziente con pseudomixoma peritonei sono mostrati qui.La quantificazione del profilo immunologico tumorale ha mostrato che il campione donatore 337 ha alti livelli di macrofagi M2, indicando che l'utilizzo di fette di tessuto derivate dallo pseudomixoma peritonei ha permesso l'interrogazione del paesaggio cellulare unico del donatore dei campioni tumorali del paziente. La farmacotipizzazione e l'analisi a valle di fette di tessuto da tessuti umani di pseudomixoma peritonei hanno mostrato l'uccisione di cellule in fette tumorali, come confermato dall'analisi di citotossicità e dall'imaging confocale a tunnel. In risposta al farmaco citotossico, bortezomib e 5-fluorouracile.L'analisi di vitalità luminescente è stata eseguita utilizzando fette sequenzialmente abbinate. La produzione di successo di fette da tumori mucinosi richiede una meticolosa dissezione e rimozione di componenti del tessuto cellulare e acellulare come il grasso e il tessuto denso della parete addominale. Questa tecnica può consentire di modellare le interazioni tra cellule tumorali e più tipi di cellule nel microambiente tumorale, come le interazioni adipose, vascolari e delle cellule immunitarie.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

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Modello in vivo per la prova Effetto dell&#39;ipossia sul tumore metastasi

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

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Ex Vivo Imaging dei linfociti T CD8 residente nel tumore del polmone umano mediante microscopia confocale a fette

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

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In Vivo EPR valutazione di pH, pO2, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

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Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

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Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

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Un nuovo modello di spheroid del tumore strutturato in 3D modulato come fibromastro per studiare l'interazione tumora-stroma e la scoperta di farmaci

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