Name: culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens
Uploaded: 2022-12-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

著者らは、顕微鏡UCSD専門がんサポートセンターP30助成金2P30CA023100を支援してくれたムーアがんセンターのイメージングコア施設のKersi Pestonjamaspに感謝したいと思います。この研究は、JoVE出版助成金(JRW)と、エリザベスとアドクリーマーズの財産、ユースケ家族財団、消化器がん研究基金、腹膜転移研究基金(AML)からの寛大な贈り物によってさらに支援されました。

すべての組織の非同定と取得は、カリフォルニア大学サンディエゴ校でIRB承認プロトコルの下で実施されました。
1.組織処理および培養のためのヒトPMP組織の調製
<ol><li>腫瘍組織の輸送と微小解剖<ol><li>輸送および培養培地の準備:10%(v/v)ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、10%FBS、2 mM L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(ペンストレプトレプ)を完...

<ol>
	<li>Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei.">Pseudomyxoma peritonei.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendiceal+cancer+patient-specific+tumor+organoid+model+for+predicting+chemotherapy+efficacy+prior+to+initiation+of+treatment:+A+feasibility+study.">Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).</li><li>Holliday, D. 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D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mucinous+tumors+of+the+ovary+and+appendix.+A+clinicopathologic+study+of+25+cases.">Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases.</a> The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).</li><li>Mizuta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+accompanied+by+intraductal+papillary+mucinous+neoplasm+of+the+pancreas.">Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas.</a> Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).</li><li>Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+originating+from+transverse+colon+mucinous+adenocarcinoma:+A+case+report+and+literature+review.">Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).</li><li>Fleten, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+treatment+of+mucinous+peritoneal+metastases+using+patient-derived+xenograft+models.">Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models.</a> Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).</li><li>Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+mouse+models+of+pseudomyxoma+peritonei+recapitulate+the+human+inflammatory+tumor+microenvironment.">Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment.">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoid+(PDO)+platforms+to+facilitate+clinical+decision+making.">Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).</li><li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies.">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).</li><li>Carr, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+in+the+pathology+of+peritoneal+surface+malignancy.">New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+repeat+cytoreductive+surgery+with+hyperthermic+intraperitoneal+chemotherapy+for+the+treatment+of+peritoneal+surface+malignancy.">Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).</li><li>Weitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-vivo+organotypic+culture+platform+for+functional+interrogation+of+human+appendiceal+cancer+reveals+a+prominent+and+heterogenous+immunological+landscape.">An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape.</a> Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies.">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).</li></ol>

この原稿では、ヒト腹膜偽粘液腫(PMP)腫瘍標本の培養、尋問、分析に使用できる技術について説明しています。私たちは、腫瘍免疫微小環境を調べるために多数のダウンストリーム機能アッセイと、ベンチからベッドサイドまでのテストのためのプラットフォームを利用しました。
この方法は私たちの手の中で非常に効率的ですが、ビブラトームを使用して腫瘍標本を切...

腹膜偽粘液腫(PMP)はまれな症候群で、発生率は年間100万人あたり1人です1。ほとんどのPMP症例は虫垂腫瘍からの転移によって引き起こされます。マウスには人間のような虫垂がないことを考えると、このタイプの癌のモデル化は依然として非常に困難です。原発性疾患は外科的切除によって治癒することが多いが、転移性疾患の治療選択肢は限られている。したがって、この新しい有機型スライスモデルを開発する理論的根拠は、PMPの病理生物学を研究することです。現在まで、永久培養できる虫垂オルガノイドモデルはありません。しかし、最近のモデルは、治療薬の薬理学的試験および免疫療法に有用であることが示された2。そのため、脳、乳がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がんなど、他の種類のヒトがんで使用されている有機型スライス培養システムを適応させました3,4,5,6。
虫垂腫瘍に加えて、PMPは時折、卵巣癌7、まれに膝管内乳頭粘液性腫瘍8および結腸癌9を含む他の腫瘍タイプから生じる。さらに、これらの腫瘍はゆっくりと成長する傾向があり、患者由来の異種移植片(PDX)モデルでは生着率が低くなります10,11。これらの課題を考えると、PMPの病理生物学と、これらの癌細胞がどのように腹膜表面に動員され、増殖し、免疫監視から逃れるかを理解し始めるために、この疾患を研究するためのモデルを開発する必要があります。
腫瘍スライスは、全身の血管循環から切り取られていますが、細胞外マトリックス、間質細胞、免疫細胞、癌細胞、内皮細胞、神経などの細胞および無細胞成分を含んでいます。この半無傷の微小環境は、これらの細胞タイプの機能的研究を可能にし、これは癌細胞のみからなる3Dオルガノイド培養と比較して独特の利点である12。オルガノタイプスライス培養はいくつかの点で有利であるが、それらはまた、拡張可能な3Dオルガノイドと比較して本質的に低スループットベースのアプローチであり、多重化された治験治療薬スクリーニングに適している13、14、15。PMPの場合、PMP由来のオルガノイドの信頼できる樹立と永続的な継代を文書化した報告はありません16。これは、PMP由来の腫瘍細胞の増殖が遅いこと、およびこれらの粘液性腫瘍内に見られる悪性上皮細胞の数が少ないことが原因である可能性があります。PMPを研究するためのモデルを開発する必要性を考えると、有機型スライスはこの病気を研究するのにユニークに適しています。ヒト検体からPMPを調製、イメージング、および分析するためのプロトコルを紹介します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 40 glass coverslips</td>
			<td>Daiggerbrand</td>
			<td>G15972H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S&#160;</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>4080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>321140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>555333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>357410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/Hyaluronidase&#160;</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>7912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD-Blue&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD imaging dyes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Isamtec</td>
			<td>ISM832C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens

腹膜偽粘液腫(PMP)は、粘液性原発腫瘍の播種とその結果としての腹腔内のムチン分泌腫瘍細胞の蓄積に起因するまれな状態です。PMPは、虫垂、卵巣、結腸直腸などのさまざまな種類の癌から発生する可能性がありますが、虫垂腫瘍が群を抜いて最も一般的な病因です。PMPは、その(1)希少性、(2)限られたマウスモデル、および(3)粘液性の無細胞組織学のために研究が困難です。ここで紹介する方法は、腫瘍微小環境(TME)が無傷のままである調製物において、患者由来の ex vivo 器官型スライスを使用して、これらの腫瘍タイプのリアルタイムの視覚化および調査を可能にする。このプロトコルでは、まず、ビブラトームを使用した腫瘍スライスの調製とその後の長期培養について説明します。次に、腫瘍スライスの共焦点イメージングと、生存率、カルシウムイメージング、および局所増殖の機能的読み出しを監視する方法について説明します。要するに、スライスにはイメージング色素が装填され、共焦点顕微鏡に取り付けることができるイメージングチャンバーに配置されます。タイムラプスビデオと共焦点画像を使用して、初期の生存率と細胞機能を評価します。この手順では、TMEにおける翻訳細胞運動、およびパラクリンシグナル伝達相互作用についても調べます。最後に、フローサイトメトリー分析に使用する腫瘍スライスの解離プロトコルについて説明します。定量的フローサイトメトリー分析は、ベンチからベッドサイドまでの治療試験に使用でき、免疫ランドスケープと上皮細胞含有量内で発生する変化を判断できます。

要するに、PMPからのヒト腫瘍標本は、IRB承認プロトコルの下で取得されます。組織を調製し、微小解剖し、アガロース型で固化させ、ビブラトームを使用して切断する(図1A;ビデオ1)。切断された組織スライスは、透過性インサートメンブレン上に置かれて培養され(図1B)、in situでのイメージングアッセイ、フローサイトメトリー...

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Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

腹膜表面に転移したヒトがんの産生、培養、可視化のためのプロトコルについて説明します。切除した腫瘍標本をビブラトームを使用して切断し、透過性インサートで培養して酸素化と生存率を高めた後、共焦点顕微鏡とフローサイトメトリーを使用したイメージングとダウンストリーム分析を行います。

切除されたヒト腫瘍標本からの ex vivo 器官型偽粘液腫腹膜腫瘍スライスの培養とイメージング

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

この研究は、前臨床環境での虫垂がんの治療法と病理生物学の研究への新しいアプローチを示しています。これらの方法は、他の悪性腫瘍の研究により広く適用できる可能性があります。虫垂がんは、疾患モデリングのためのマウスに虫垂がない場合の発生率が低いため、研究が困難です。この技術は、腫瘍微小環境内の細胞相互作用の研究を可能にする。この方法は、結腸直腸癌や卵巣癌など、大網に転移する傾向がある複数の種類の癌の生物学を研究するために適用できます。輸送培地と培地を準備することから始めます。組織が到着したら、腹膜偽粘液腫腫瘍組織を直径6センチメートルの皿を含む35の完全なDMEMに移します。液化したムチンや粘液性の高い組織領域を除去することに加えて、メスで切断するのが難しい組織を取り除きます。腫瘍組織の結節を大まかに1立方センチメートルの小さな断片に切ります。アガロース調製および組織包埋のために、組織が到着した場合は同日にウシ胎児血清またはFBSを含まないPBS中の低融点アガロースの5%溶液を調製します。液体5%アガロース溶液を、標本を覆うまで、2〜3個の小さな腫瘍標本を含む6センチメートルの皿に加えます。埋め込まれたティッシュを摂氏4度の冷蔵庫に30分間置きます。組織標本をビブラトムに取り外し、固化したオーガーを冷蔵庫から取り出し、メスを使用して組織の幅よりわずかに大きいアガロースキューブを切り取ります。ビブラトームステージに瞬間接着剤を塗布し、アガロースキューブを瞬間接着剤に1〜2分間そっと置き、固定します。ブレードをビブラトームに固定し、組織切片の厚さを約150〜250ミクロンに設定して、最適な下流イメージングを実現します。組織スライスを培養するには、透過膜の上に2ミリリットルの完全DMEM培地を、透過膜の下に3ミリリットルの完全DMEM培地を加えて、透過性インサートプレートを作製します。次に、細い絵筆を使用して組織スライスをビブラトムの切断チャンバーからそっと持ち上げ、完全なDMEMを含む透過性培養皿に2〜4枚のスライスを入れます。スライスを摂氏37度で最大7日間、5%の二酸化炭素で培養します。培地交換中、24時間ごとに、細胞殺傷のコントロールとしてボルテゾミブを追加し、テスト可能な化学療法5-フルオロウラシルまたは5-FUを培地に追加して薬理学的介入を実行します。共焦点イメージング解析用の腫瘍スライスを、1%FBSを含むPBSを含む12ウェルディッシュの単一ウェルに配置します。カルシウムイメージング実験では、PBSの代わりに、余分な細胞カルシウム溶液でスライスをインキュベートします。サンプルをイメージング色素で染色して、組織スライスの生存率を判断します。生存率色素を添加した後、10分から1時間インキュベートします。インキュベーション後、スライスを1%FBSを含むPBSを含む光学的に透明なガラス底のペトリ皿に移し、共焦点イメージングデバイスでのイメージングに使用します。1ミリリットルのピペットチップの端から小片を切り取って開口部を広げ、ピペッティングによる激しい機械的解離を可能にします。スライスを摂氏37度で1ミリリットルの消化バッファー中で5〜15分間回転させ、機械的解離を使用してインキュベーション中に2〜3回激しい組織破壊を行います。組織が消化されたら、50ミリリットルの円錐管の上に置かれた70マイクロメートルのフィルターに消化媒体で破壊された組織を移します。滅菌鉗子またはピペットを使用して大きな部分を選びます。プラスチック製の5ミリリットルシリンジの鈍いバックエンドを使用して、解離していない大きなスライスをマッシュし、2%FBSを含む4ミリリットルのPBSで洗浄します。解離した細胞上清を取り、300Gで5〜10分間遠心分離します。上清を除去し、2%FBSを含む1ミリリットルのPBSでペレットを洗浄する。フローサイトメトリー用のサンプルを調製するには、50マイクロリットルのヒトFCブロックを含むブロッキングバッファーを加え、室温で15分間インキュベートします。2%FBSを含む50マイクロリットルのPBS中のそれぞれの抗体を用いて細胞外染色を行う。制御および治療条件のために5ミリリットルの完全な培地を分注します。透過性ディッシュにプレーティングされた2〜4枚のスライスに、対照処理アリコートからの培地と、下流の生存率、生死分析に使用する追加の併用療法を追加します。組織スライスを完全なDMEMを含む培養物に2〜5日間放置し、培地とボルテゾミブと5-FUを1日おきに交換します。発光生存率分析のために、500マイクロリットルのPBSを12ウェルディッシュに加え、ペイントブラシまたは1ミリリットルのピペットを使用して、順次一致した組織スライスをPBS溶液に移します。スライスから PBS を削除します。条件ごとに500マイクロリットルの発光生存率溶液を加え、室温で30分間振とう機上でゆっくりと回転させてインキュベートしてから、発光プレートリーダーを使用して発光を読み取る。組織切片中のムチン染色を、周期的酸シフト染色およびムチン特異的抗体を用いて可視化した。カルセインAMとヨウ化プロピジウムでのインキュベーションは、健康と生存率を決定しました。核は培養中に増殖した細胞と重なった。これらの結果を定量化し、腫瘍スライス内の増殖細胞数を決定した。スライスをCD11b PE結合抗体およびFluo−4 AM中でインキュベートし、CTUで局所免疫細胞を標識した。細胞内カルシウムレベルを示す擬似カラースケーリング画像は、細胞内カルシウムの異なるレベルを視覚化することを可能にした。強調表示されたCD11b陽性免疫細胞内の細胞間カルシウム応答の前、最中、後の自発的活動の追跡および経過時間がここに示されている。CD11b免疫細胞におけるカルシウム応答の生の痕跡を、他の応答性および非応答性細胞と共に定量化した。腹膜偽粘液腫を有する患者腫瘍サンプルのイムノタイピングの代表的な結果をここに示す。腫瘍免疫プロファイルの定量化は、ドナー標本337が高レベルのM2マクロファージを有することを示し、腹膜由来組織切片の偽粘液腫を利用することで、患者の腫瘍試料の固有のドナー細胞景観の調査が可能になったことを示している。偽腹膜粘液腫ヒト組織からの組織スライスのファーマコタイピングおよび下流分析は、細胞毒性分析およびトンネル共焦点イメージングによって確認されるように、腫瘍スライスにおける細胞の死滅を示した。細胞傷害性薬物、ボルテゾミブおよび5-フルオロウラシルに応答して。発光生存率分析は、順次一致したスライスを用いて行った。粘液性腫瘍からのスライスの製造を成功させるには、脂肪や高密度の腹壁組織などの細胞および無細胞組織成分の綿密な解剖と除去が必要です。この技術により、がん細胞と、脂肪、血管、免疫細胞の相互作用など、腫瘍微小環境における複数の細胞型との相互作用をモデル化することができます。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

腫瘍転移に対する低酸素のテストの効果のためのインビボモデル

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

生体内でPH、 pO2、酸化還元状態とリン酸濃度および腫瘍微小環境におけるグルタチオンの EPR 評価

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

放射性核種蛍光レポーターの遺伝子齧歯動物腫瘍モデルで腫瘍の進行を追跡するイメージング

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

腫瘍標的免疫のパラミクソ ウイルス: 設計と評価 Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

ゼブラフィッシュ腫瘍異種移植片における宿主血管新生応答の生体内イメージングと定量

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

マウス膀胱腫瘍オルガノイドの培養、操作、および正体移植

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

腫瘍間質相互作用と創薬を研究するための新規ストロマ線維芽細胞変調3D腫瘍球状モデル

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...