Name: culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens
Uploaded: 2022-12-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

저자는 현미경 UCSD 전문 암 지원 센터 P30 보조금 2P30CA023100에 도움을 준 Moores Cancer Center 이미징 핵심 시설의 Kersi Pestonjamasp에게 감사를 표합니다. 이 작업은 JoVE 출판 보조금(JRW)과 Elisabeth 및 Ad Creemers의 유산, Euske 가족 재단, 위장암 연구 기금 및 복막 전이 연구 기금(AML)의 관대한 선물로 추가로 지원되었습니다.

모든 조직의 비식별화 및 획득은 샌디에이고 캘리포니아 대학교에서 IRB 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 조직 가공 및 배양을 위한 인간 PMP 조직의 제조
<ol><li>종양 조직의 운반 및 미세 해부<ol><li>수송 및 배양 배지 준비: 10%(v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM), 10% FBS, 2mM L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신(Pen Strep)을 완료합니다.</li>
		<li>조직 도착 시...

<ol>
	<li>Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei.">Pseudomyxoma peritonei.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendiceal+cancer+patient-specific+tumor+organoid+model+for+predicting+chemotherapy+efficacy+prior+to+initiation+of+treatment:+A+feasibility+study.">Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Misra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+organotypic+culture+system+of+precision-cut+slices+of+human+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).</li><li>Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+glioma+cell+invasion+using+organotypic+brain+slice+culture.">A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture.</a> Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).</li><li>Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mucinous+tumors+of+the+ovary+and+appendix.+A+clinicopathologic+study+of+25+cases.">Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases.</a> The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).</li><li>Mizuta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+accompanied+by+intraductal+papillary+mucinous+neoplasm+of+the+pancreas.">Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas.</a> Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).</li><li>Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+originating+from+transverse+colon+mucinous+adenocarcinoma:+A+case+report+and+literature+review.">Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).</li><li>Fleten, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+treatment+of+mucinous+peritoneal+metastases+using+patient-derived+xenograft+models.">Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models.</a> Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).</li><li>Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+mouse+models+of+pseudomyxoma+peritonei+recapitulate+the+human+inflammatory+tumor+microenvironment.">Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment.">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoid+(PDO)+platforms+to+facilitate+clinical+decision+making.">Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).</li><li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies.">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).</li><li>Carr, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+in+the+pathology+of+peritoneal+surface+malignancy.">New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+repeat+cytoreductive+surgery+with+hyperthermic+intraperitoneal+chemotherapy+for+the+treatment+of+peritoneal+surface+malignancy.">Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).</li><li>Weitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-vivo+organotypic+culture+platform+for+functional+interrogation+of+human+appendiceal+cancer+reveals+a+prominent+and+heterogenous+immunological+landscape.">An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape.</a> Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies.">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).</li></ol>

이 원고는 인간 가성 점액종 복막종(PMP) 종양 표본을 배양, 심문 및 분석하는 데 사용할 수 있는 기술을 설명합니다. 우리는 종양 면역 미세 환경과 벤치 투 베드사이드 테스트를 위한 플랫폼을 조사하기 위해 수많은 다운스트림 기능 분석을 활용했습니다.
이 방법은 우리 손에서 매우 효율적이지만 비브라톰을 사용하여 종양 표본을 절단하는 데는 약간의 연습이 필요합니다. ...

복막가점액종(PMP)은 연간 발병률이 100만 명당 1명인 희귀 증후군입니다1. 대부분의 PMP 사례는 맹장 신생물의 전이로 인해 발생합니다. 생쥐가 인간과 같은 맹장을 가지고 있지 않다는 점을 감안할 때, 이러한 유형의 암을 모델링하는 것은 여전히 매우 어려운 일입니다. 원발성 질환은 종종 외과적 절제로 치료할 수 있지만 전이성 질환에 대한 치료 옵션은 제한적입니다. 따라서 이 새로운 기관형 절편 모델을 개발하는 근거는 PMP의 병리학을 연구하는 것입니다. 현재까지 영구적으로 배양할 수 있는 맹장 오가노이드 모델은 없습니다. 그러나, 최근의 모델은 치료제 및 면역요법의 약리학적 시험에 유용한 것으로 나타났다2. 따라서 우리는 뇌암, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암 등과 같은 다른 유형의 인간 암에 사용된 기관형 절편 배양 시스템을 채택했습니다 3,4,5,6.
맹장 신생물 외에도 PMP는 난소암7을 포함한 다른 종양 유형에서 발생하는 경우도 있으며, 드물게 유두내 점액성 신생물8 및 결장암9을 유발한다. 또한, 이들 종양은 천천히 성장하는 경향이 있으며, 환자 유래 이종이식(PDX) 모델에서 생착률이 낮다(10,11). 이러한 문제를 감안할 때 PMP의 병리학을 이해하기 시작하고 이러한 암세포가 복막 표면으로 모집되고 증식하며 면역 감시를 피하는 방법을 이해하기 시작하기 위해 이 질병을 연구하기 위한 모델을 개발해야 할 미충족 요구가 있습니다.
전신 혈관 순환에서 절단되는 동안 종양 조각에는 세포외 기질, 기질 세포, 면역 세포, 암세포, 내피 세포 및 신경을 포함한 세포 및 무세포 구성 요소가 포함되어 있습니다. 이러한 반온전한 미세환경은 이러한 세포 유형의 기능적 조사를 가능하게 하며, 이는 암세포로만 구성된 3D 오가노이드 배양에 비해 유일하게 유리하다12. 기관형 절편 배양은 일부 측면에서 유리하지만, 확장이 가능한 3D 오가노이드에 비해 본질적으로 낮은 처리량 기반 접근 방식이며 다중 연구 치료 약물 스크리닝에 적합합니다13,14,15. PMP의 경우, PMP 유래 오가노이드16의 신뢰할 수 있는 확립 및 영구적인 계대배양을 문서화한 보고는 없었다. 이는 PMP 유래 종양 세포의 느린 성장 특성과 이러한 점액성 종양 내에서 발견되는 악성 상피 세포의 수가 적기 때문일 수 있습니다. PMP를 연구하기 위한 모델을 개발할 필요성을 감안할 때 기관형 절편은 이 질병을 연구하는 데 고유하게 적합합니다. 우리는 인간 표본에서 PMP를 준비, 이미징 및 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 40 glass coverslips</td>
			<td>Daiggerbrand</td>
			<td>G15972H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S&#160;</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>4080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>321140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>555333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>357410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/Hyaluronidase&#160;</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>7912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD-Blue&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD imaging dyes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Isamtec</td>
			<td>ISM832C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens

가성 점액종 복막종(PMP)은 점액성 원발성 종양의 파종과 그에 따른 복강 내 점액 분비 종양 세포의 축적으로 인해 발생하는 드문 질환입니다. PMP는 맹장암, 난소암, 결장직장암을 포함한 다양한 유형의 암에서 발생할 수 있지만 맹장 신생물이 단연코 가장 흔한 병인입니다. PMP는 (1) 희귀성, (2) 제한된 쥐 모델 및 (3) 점액성, 무세포 조직학으로 인해 연구하기 어렵습니다. 여기에 제시된 방법은 종양 미세 환경(TME)이 손상되지 않은 제제에서 환자 유래 생체 외 기관형 슬라이스를 사용하여 이러한 종양 유형을 실시간으로 시각화하고 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 비브라톰을 사용하여 종양 절편을 준비하고 후속 장기 배양을 설명합니다. 둘째, 종양 절편의 컨포칼 이미징과 생존력, 칼슘 이미징 및 국소 증식의 기능적 판독값을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 요컨대, 슬라이스에는 이미징 염료가 로드되고 컨포칼 현미경에 장착할 수 있는 이미징 챔버에 배치됩니다. 타임랩스 비디오와 컨포칼 이미지는 초기 생존력과 세포 기능을 평가하는 데 사용됩니다. 이 절차는 또한 TME에서 번역 세포 이동 및 측분비 신호 상호작용을 탐구합니다. 마지막으로, 유세포 분석에 사용되는 종양 절편에 대한 해리 프로토콜을 설명합니다. 정량적 유세포 분석은 면역 환경 및 상피 세포 함량 내에서 발생하는 변화를 확인하기 위해 벤치 투 베드사이드 치료 테스트에 사용할 수 있습니다.

요컨대, PMP의 인간 종양 표본은 IRB 승인 프로토콜에 따라 얻어집니다. 조직을 준비하고, 미세 해부하고, 비브라톰을 사용하여 절단할 아가로스 주형에서 고형화한다(도 1A; 비디오 1). 절단된 조직 절편은 투과성 삽입막(그림 1B)에 배치되고 배양되며, 이는 현장 이미징 분석뿐만 아니라 유세포 분석, 컨포칼 이미징 분석 및 세포 독성 ?...

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Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

우리는 복막 표면으로 전이된 인간 암의 생산, 배양 및 시각화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 절제된 종양 표본은 비브라톰을 사용하여 절단하고 투과성 삽입물에서 배양하여 산소 공급 및 생존력을 높인 다음 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 이미징 및 다운스트림 분석을 수행합니다.

절제된 인간 종양 표본에서 생체 외 유기형 가성 점액종 복막 종양 절편의 배양 및 이미징

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

이 연구는 전임상 환경에서 맹장암 치료제 및 병리학 연구에 대한 새로운 접근 방식을 보여줍니다. 이러한 방법은 다른 악성 종양 연구에 더 광범위하게 적용될 수 있습니다. 맹장암은 질병 모델링을 위한 마우스에서 맹장이 없는 경우 발병률이 낮기 때문에 연구하기 어렵습니다.이 기술을 사용하면 종양 미세 환경 내에서 세포 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 이 방법은 결장직장암 및 난소암과 같이 망막으로 전이되는 경향이 있는 여러 유형의 암의 생물학을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 운송 및 배양 배지를 준비하는 것으로 시작하십시오.조직이 도착하면 가성 점액종 복막 종양 조직을 직경 6cm의 접시를 포함하는 35개의 완전한 DMEM으로 옮깁니다. 액화된 점액 또는 점액이 많은 조직 영역을 제거하는 것 외에도 메스로 자르기 어려운 조직을 제거합니다. 종양 조직 결절을 대략 1 입방체 센티미터의 작은 조각으로 자릅니다.아가로스 제제 및 조직 포매를 위해, 조직이 도착하는 경우 같은 날 태아 소 혈청 또는 FBS가 없는 PBS에 저융점 아가로스의 5% 용액을 준비합니다. 표본을 덮을 때까지 2-3개의 작은 종양 표본이 들어 있는 6cm 접시에 액체 5% 아가로스 용액을 추가합니다. 내장된 티슈를 섭씨 4도의 냉장고에 30분 동안 넣습니다.비브라톰에서 조직 표본을 분리하고, 냉장고에서 응고된 오거를 제거하고, 메스를 사용하여 조직 너비보다 약간 큰 아가로스 큐브를 자릅니다. 비브라톰 단계에 슈퍼 접착제를 바르고 아가로스 큐브를 슈퍼 접착제에 1-2분 동안 부드럽게 올려 고정합니다. 블레이드를 비브라톰에 고정하고 최적의 다운스트림 이미징을 위해 조직 섹션의 두께를 약 150-250미크론으로 설정합니다.조직 절편을 배양하기 위해, 투과성 멤브레인 위에 2밀리리터의 완전한 DMEM 배지를 첨가하고 투과성 멤브레인 아래에 3밀리리터를 첨가하여 투과성 삽입판을 준비한다. 다음으로, 얇은 페인트 브러시를 사용하여 비브라톰의 절단 챔버에서 조직 조각을 부드럽게 들어 올리고 완전한 DMEM이 들어 있는 투과성 배양 접시에 2-4개의 조각을 넣습니다. 섭씨 37도에서 최대 7일 동안 5% 이산화탄소로 슬라이스를 배양합니다.배지를 교체하는 동안 24시간마다 세포 사멸을 위한 대조군으로 보르테조밉을 추가하고 테스트 가능한 화학 요법 5-플루오로우라실 또는 5-FU를 배양 배지에 추가하여 약리학적 개입을 수행합니다. 컨포칼 이미징 분석을 위해 종양 절편을 1%FBS가 포함된 PBS가 포함된 12웰 접시의 단일 웰에 놓습니다. 칼슘 이미징 실험의 경우 PBS 대신 세포를 추가 칼슘 용액에서 슬라이스를 배양합니다.조직 절편의 생존력을 결정하기 위해 이미징 염료로 샘플을 염색합니다. 생존성 염료를 첨가한 후 10분 내지 1시간 동안 배양한다. 배양 후 슬라이스를 1%FBS가 포함된 PBS가 들어 있는 광학적으로 투명한 유리 바닥 페트리 접시에 옮겨 공초점 이미징 장치에서 이미징에 사용합니다.1밀리리터 피펫 팁의 끝에서 작은 조각을 잘라 개구부를 넓히고 피펫팅에 의한 강력한 기계적 해리를 허용합니다. 섭씨 37도에서 1 밀리리터의 소화 완충액에서 5-15 분 동안 회전하면서 슬라이스를 배양하고, 기계적 해리를 사용하여 배양하는 동안 2-3 회 격렬한 조직 파괴를 가합니다. 조직이 소화되면 50밀리리터 원뿔형 튜브 위에 놓인 70마이크로미터 필터에 분해 매체로 파기된 조직을 옮깁니다.멸균 집게 또는 피펫을 사용하여 더 큰 조각을 선택하십시오. 플라스틱 5밀리리터 주사기의 뭉툭한 백엔드를 사용하여 해리되지 않은 더 큰 조각을 으깨고 2%FBS가 포함된 PBS 4밀리리터로 세척합니다. 해리된 세포 상층액과 원심분리기를 300G에서 5-10분 동안 취한다.상청액을 제거하고 2%FBS를 함유한 PBS 1밀리리터로 펠릿을 세척합니다. 유세포 분석을 위해 샘플을 준비하기 위해, 50 마이크로리터의 인간 FC 블록을 함유하는 블로킹 완충액을 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 2%FBS를 함유한 PBS 50마이크로리터에서 각각의 항체를 사용하여 추가 세포 염색을 수행합니다.대조군 및 치료 조건을 위한 완전한 배지 5밀리리터를 분취합니다. 투과성 접시 상에 도말된 2 내지 4개의 슬라이스 상에, 대조군 처리 분취액 및 하류 생존력, 생사 분석에 사용될 추가의 조합 요법으로부터의 배지를 첨가한다. 조직 절편을 완전한 DMEM이 포함된 배양물에 2-5일 동안 방치하고 배지와 보르테조밉 및 5-FU를 격일로 교체합니다.발광 생존도 분석을 위해, 500 마이크로리터의 PBS를 12-웰 디쉬에 첨가하고, 페인트브러시 또는 1밀리리터 피펫을 사용하여 순차적으로 매칭된 조직 절편을 PBS 용액으로 옮긴다. 조각에서 PBS를 제거합니다. 조건당 500 마이크로리터의 발광 생존도 용액을 첨가하고, 발광 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 판독하기 전에 실온에서 30분 동안 쉐이커 상에서 천천히 회전하면서 인큐베이션한다.조직 절편에서의 뮤신 염색은 주기적 산 이동 염색 및 뮤신 특이적 항체를 사용하여 시각화하였다. 칼세인 AM과 프로피듐 요오드화물에서의 배양은 건강과 생존력을 결정했습니다. 핵은 배양 중에 증식된 세포와 겹쳤다.이들 결과를 정량화하여 종양 절편 내에서 증식하는 세포의 수를 결정하였다. CD11b PE 접합 항체 및 Fluo-4 AM에서 배양된 슬라이스를 CTU에서 국소 면역 세포로 표지하였다. 세포 내 칼슘 수준을 보여주는 유사 색상 스케일 이미지를 통해 세포 내 칼슘의 차등 수준을 시각화 할 수있었습니다.강조된 CD11b 양성 면역 세포 내에서 세포간 칼슘 반응 전, 도중 및 후에 대한 자발적 활동 추적 및 시간 경과가 여기에 표시됩니다. CD11b 면역 세포에서 칼슘 반응의 원시 흔적과 다른 반응성 및 비반응성 세포를 정량화했습니다. 복막막성 가성점액종을 갖는 환자 종양 샘플의 면역형 분석의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있다.종양 면역 프로파일의 정량화는 공여자 표본(337)이 높은 수준의 M2 대식세포를 갖는 것으로 나타났으며, 이는 가성점액종 복막-유래 조직 절편을 이용하는 것이 환자 종양 샘플의 독특한 공여자 세포 풍경의 심문을 허용한다는 것을 나타낸다. 가성 점액종 복막종 인간 조직의 조직 절편의 약물형 분석 및 다운스트림 분석은 세포독성 분석 및 터널 공초점 이미징에 의해 확인된 바와 같이 종양 절편에서 세포의 사멸을 보여주었습니다. 세포 독성 약물, 보르 테조 밉 및 5- 플루오로 우라실에 대한 반응.발광 생존율 분석은 순차적으로 매칭된 슬라이스를 사용하여 수행하였다. 점액성 종양에서 절편을 성공적으로 생산하려면 지방 및 조밀한 복벽 조직과 같은 세포 및 무세포 조직 구성 요소를 세심하게 해부하고 제거해야 합니다. 이 기술은 지방, 혈관 및 면역 세포 상호 작용과 같은 종양 미세 환경에서 암세포와 여러 세포 유형 간의 상호 작용을 모델링할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

종양의 전이에 저산소증의 테스트 효과에 대한 생체 내 모델에서

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

연구

암 연구학

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

제브라피시 종양 이종이식에서 숙주 혈관조형성 반응의 생체 내 이미징 및 정량화

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

마우스 방광 종양 오르가노이드의 문화, 조작 및 정형 외과 이식

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

종양-기질 상호 작용 및 약물 발견을 연구하기 위한 새로운 기질 섬유아세포 변조 3D 종양 스페로이드 모델

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...