Name: culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens
Uploaded: 2022-12-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer a Kersi Pestonjamasp da instalação do núcleo de imagem do Moores Cancer Center pela ajuda com os microscópios UCSD Specialized Cancer Support Center P30 grant 2P30CA023100. Este trabalho foi adicionalmente apoiado por uma bolsa de publicação JoVE (JRW), bem como generosos presentes do espólio de Elisabeth e Ad Creemers, da Euske Family Foundation, do Gastrointestinal Cancer Research Fund e do Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).

A desidentificação e aquisição de todos os tecidos foram realizadas sob um protocolo aprovado pelo IRB na Universidade da Califórnia, San Diego.
1. Preparação de tecidos humanos de PMP para processamento e cultura de tecidos
<ol><li>Transporte de tecidos tumorais e microdissecção<ol><li>Preparar os meios de transporte e cultura: completar 10% (v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-Glutamina, 1% Penicilina/Streptomicina (Pen Strep).</li>
		<li>...

<ol>
	<li>Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei.">Pseudomyxoma peritonei.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendiceal+cancer+patient-specific+tumor+organoid+model+for+predicting+chemotherapy+efficacy+prior+to+initiation+of+treatment:+A+feasibility+study.">Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Misra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+organotypic+culture+system+of+precision-cut+slices+of+human+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).</li><li>Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+glioma+cell+invasion+using+organotypic+brain+slice+culture.">A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture.</a> Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).</li><li>Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mucinous+tumors+of+the+ovary+and+appendix.+A+clinicopathologic+study+of+25+cases.">Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases.</a> The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).</li><li>Mizuta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+accompanied+by+intraductal+papillary+mucinous+neoplasm+of+the+pancreas.">Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas.</a> Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).</li><li>Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+originating+from+transverse+colon+mucinous+adenocarcinoma:+A+case+report+and+literature+review.">Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).</li><li>Fleten, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+treatment+of+mucinous+peritoneal+metastases+using+patient-derived+xenograft+models.">Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models.</a> Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).</li><li>Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+mouse+models+of+pseudomyxoma+peritonei+recapitulate+the+human+inflammatory+tumor+microenvironment.">Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment.">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoid+(PDO)+platforms+to+facilitate+clinical+decision+making.">Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).</li><li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies.">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).</li><li>Carr, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+in+the+pathology+of+peritoneal+surface+malignancy.">New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+repeat+cytoreductive+surgery+with+hyperthermic+intraperitoneal+chemotherapy+for+the+treatment+of+peritoneal+surface+malignancy.">Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).</li><li>Weitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-vivo+organotypic+culture+platform+for+functional+interrogation+of+human+appendiceal+cancer+reveals+a+prominent+and+heterogenous+immunological+landscape.">An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape.</a> Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies.">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).</li></ol>

Este manuscrito descreve uma técnica que pode ser usada para cultura, interrogação e análise de espécimes tumorais de pseudomixoma peritoneal humano (PMP). Utilizamos numerosos ensaios funcionais a jusante para interrogar o microambiente imune do tumor e uma plataforma para testes de bancada para leito.
Embora o método seja altamente eficiente em nossas mãos, será necessária alguma prática para cortar espécimes tumorais usando um vibratome. Ou seja, encontramos problemas que foram d...

O pseudomixoma peritoneal (PMP) é uma síndrome rara, com incidência de 1 por milhão de pessoas porano1. A maioria dos casos de PMF é causada por metástases de neoplasias do apêndice. Dado que os ratos não têm um apêndice semelhante ao humano, modelar este tipo de cancro continua a ser extremamente desafiante. Embora a doença primária seja frequentemente curável por ressecção cirúrgica, as opções de tratamento para doença metastática são limitadas. Portanto, a justificativa para o desenvolvimento deste novo modelo de fatiamento organotípico é estudar a patobiologia da PMP. Até o momento, não existem modelos organoides apendiculares que possam ser perpetuamente cultivados; entretanto, um modelo recente mostrou-se útil para o teste farmacológico de agentes terapêuticos eimunoterapia2. Para tanto, adaptamos um sistema de cultura organotípica de fatias que tem sido utilizado em outros tipos de cânceres humanos, como cérebro, mama, pâncreas, pulmão, ovário, entre outros3,4,5,6.
Além das neoplasias do apêndice, a PMF ocasionalmente resulta de outros tipos de tumores, incluindo cânceres ovarianos7 e, em raras circunstâncias, neoplasias mucinosas papilares intraductais8 e câncer de cólon9. Além disso, esses tumores tendem a crescer lentamente, com baixas taxas de enxerto em modelos de xenoenxerto derivado do paciente (PDX)10,11. Diante desses desafios, há uma necessidade não atendida de desenvolver modelos para estudar essa doença para começar a entender a fisiopatologia da PMP e como essas células cancerígenas são recrutadas para as superfícies peritoneais, proliferam e escapam da vigilância imunológica.
Embora cortados da circulação vascular sistêmica, os cortes tumorais contêm componentes celulares e acelulares, incluindo a matriz extracelular, células estromais, células imunes, células cancerosas, células endoteliais e nervos. Esse microambiente semi-intacto permite a investigação funcional desses tipos celulares, o que é excepcionalmente vantajoso em relação às culturas organoides 3D, que consistem apenas de célulascancerígenas12. Embora as culturas organotípicas de corte sejam vantajosas em alguns aspectos, elas também são inerentemente uma abordagem baseada em baixo rendimento, em comparação com organoides 3D, que podem ser expandidos e são adequados para triagem de drogas terapêuticas investigativas multiplexadas13,14,15. No caso da PMP, não há relatos documentando o estabelecimento confiável e a passagem perpétua de organoides derivados da PMP16. Isso provavelmente se deve à natureza de crescimento lento das células tumorais derivadas do PMP, bem como ao baixo número de células epiteliais malignas encontradas dentro desses tumores mucinosos. Dada a necessidade de desenvolver modelos para estudar PMF, fatias organotípicas são especialmente adequadas para estudar esta doença. Apresentamos um protocolo para preparação, aquisição de imagens e análise de PMP de espécimes humanos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 40 glass coverslips</td>
			<td>Daiggerbrand</td>
			<td>G15972H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S&#160;</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>4080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>321140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>555333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>357410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/Hyaluronidase&#160;</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>7912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD-Blue&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD imaging dyes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Isamtec</td>
			<td>ISM832C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens

O pseudomixoma peritoneal (PMP) é uma condição rara que resulta da disseminação de um tumor primário mucinoso e do consequente acúmulo de células tumorais secretoras de mucina na cavidade peritoneal. A PMF pode surgir de vários tipos de cânceres, incluindo apendicular, ovariano e colorretal, embora as neoplasias do apêndice sejam de longe a etiologia mais comum. O PMP é desafiador de estudar devido à sua (1) raridade, (2) modelos murinos limitados e (3) histologia mucinosa e acelular. O método aqui apresentado permite a visualização e interrogação em tempo real desses tipos tumorais utilizando cortes organotípicos ex vivo derivados do paciente em uma preparação onde o microambiente tumoral (TME) permanece intacto. Neste protocolo, primeiramente descrevemos o preparo de fatias tumorais utilizando um vibratomo e posterior cultura a longo prazo. Em segundo lugar, descrevemos imagens confocais de cortes tumorais e como monitorar leituras funcionais de viabilidade, imagens de cálcio e proliferação local. Em suma, as fatias são carregadas com corantes de imagem e são colocadas em uma câmara de imagem que pode ser montada em um microscópio confocal. Vídeos com lapso de tempo e imagens confocais são usados para avaliar a viabilidade inicial e a funcionalidade celular. Este procedimento também explora o movimento celular translacional e as interações de sinalização parácrina na EMT. Por fim, descrevemos um protocolo de dissociação de cortes tumorais a serem utilizados para análise por citometria de fluxo. A análise quantitativa por citometria de fluxo pode ser usada para testes terapêuticos de bancada para leito para determinar as mudanças que ocorrem na paisagem imune e no conteúdo das células epiteliais.

Em suma, espécimes tumorais humanos de PMP são obtidos sob um protocolo aprovado pelo IRB. O tecido é preparado, microdissecado e solidificado em molde de agarose para ser cortado com vibratomo (Figura 1A; Vídeo 1). Uma vez cortados, os cortes de tecido são colocados e cultivados em membranas de inserção permeável (Figura 1B), que podem ser utilizadas para exames de imagem in situ, bem como para interrogação celular e funciona...

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Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Descrevemos um protocolo para produção, cultura e visualização de cânceres humanos com metástase para as superfícies peritoneais. Os espécimes tumorais ressecados são cortados com vibratótomo e cultivados em insertos permeáveis para aumento da oxigenação e viabilidade, seguidos de análises de imagem e a jusante usando microscopia confocal e citometria de fluxo.

Cultura e Imagem de Cortes Extraviais de Tumor Organotípico de Pseudomixoma Peritonei Ex Vivo de Espécimes Tumorais Humanos Ressecados

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Esta pesquisa demonstra uma nova abordagem para o estudo da terapêutica e patobiologia do câncer de apêndice em um ambiente pré-clínico. Esses métodos podem ser mais amplamente aplicáveis ao estudo de outras neoplasias. O câncer de apêndice é difícil de estudar, dada sua baixa incidência na ausência de apêndice em camundongos para modelagem da doença.Esta técnica permite o estudo das interações celulares dentro do microambiente tumoral. Esse método pode ser aplicado para estudar a biologia de vários tipos de cânceres que têm propensão a metastatizar para o omento, como os cânceres colorretal e de ovário. Comece preparando os meios de transporte e cultura.Após a chegada do tecido, transferir os tecidos tumorais do pseudomixoma peritonei para 35 DMEM completos contendo placas de seis centímetros de diâmetro. Além de remover qualquer mucina liquificada, ou regiões de tecido altamente mucinoso, remova qualquer tecido que seja difícil de cortar com um bisturi. Corte nódulos de tecido tumoral aproximadamente em pedaços menores de um centímetro cúbico.para a preparação de agarose e incorporação de tecidos, preparar uma solução a 5% de agarose de baixo derretimento em PBS sem soro fetal bovino ou FBS no mesmo dia, se os tecidos chegarem. Adicione a solução líquida de agarose a 5% às placas de seis centímetros contendo dois a três espécimes tumorais menores até cobrir o espécime. Coloque os tecidos embutidos em um refrigerador de quatro graus Celsius por 30 minutos.Desmonte os espécimes de tecido no vibratome, retire o trado solidificado da geladeira e corte os cubos de agarose ligeiramente maiores do que a largura do tecido usando um bisturi. Aplique super cola no estágio de vibratómico e coloque suavemente o cubo de agarose sobre a super cola por um a dois minutos para fixação. Fixe a lâmina no vibratomo e ajuste a espessura da seção de tecido para aproximadamente 150 a 250 mícrons para obter imagens a jusante ideais.Para cultivar os cortes de tecido, prepare uma placa de inserção permeável adicionando dois mililitros de meio DMEM completo acima da membrana permeável e três mililitros abaixo da membrana permeável. Em seguida, levante suavemente as fatias de tecido para fora da câmara de corte do vibratomo usando um pincel fino e coloque de duas a quatro fatias em pratos de cultura permeáveis contendo DMEM completo. Cultive as fatias por até sete dias a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.Durante a troca de meios, a cada 24 horas, adicionar bortezomib como controle para morte celular, e quimioterapias testáveis 5-Fluorouracil, ou 5-FU, aos meios de cultura para realizar a intervenção farmacológica. Coloque fatias tumorais para análise de imagem confocal em um único poço de uma placa de 12 poços contendo PBS com 1% de SFB. Para experimentos de imagem de cálcio, em vez de PBS, incube as fatias em uma solução extra celular de cálcio.Coloração de amostras com corantes de imagem para determinar a viabilidade de cortes de tecido. Incubar por 10 minutos a uma hora após a adição do corante de viabilidade. Após a incubação, transfira as fatias para uma placa de Petri com fundo de vidro opticamente transparente contendo PBS com FBS a 1% para ser usada para aquisição de imagens em um dispositivo de imagem confocal.Corte um pequeno pedaço da extremidade de uma ponta de pipeta de um mililitro para alargar a abertura, permitindo uma dissociação mecânica vigorosa por pipetagem. Incubar fatias a 37 graus Celsius com rotação por cinco a 15 minutos em um mililitro de tampão de digestão, com ruptura vigorosa do tecido duas a três vezes durante a incubação usando dissociação mecânica. Uma vez que o tecido é digerido, transfira o tecido rompido com o meio de digestão em um filtro de 70 micrômetros colocado em cima de um tubo cônico de 50 mililitros.Escolha peças maiores usando pinças estéreis ou uma pipeta. Usando o backend rombo de uma seringa plástica de cinco mililitros, amasse quaisquer fatias maiores não dissociadas e lave-as com quatro mililitros de PBS contendo 2% FBS. Tome o sobrenadante celular dissociado e centrifuga a 300G por cinco a 10 minutos.Retire o sobrenadante e lave o pellet com um mililitro de PBS contendo 2% FBS. Para preparar a amostra para citometria de fluxo, adicionar o tampão de bloqueio contendo 50 microlitros de bloqueio FC humano e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Realizar coloração extracelular usando os respectivos anticorpos em 50 microlitros de PBS contendo 2% de SFB.Alíquota de cinco mililitros de meio completo para condições de controle e tratamento. Nas duas a quatro fatias banhadas nos pratos permeáveis, adicione os meios das alíquotas de tratamento de controle e as terapias combinadas adicionais a serem usadas para análise de viabilidade a jusante, morta viva. Deixar fatias de tecido em uma cultura contendo DMEM completo por dois a cinco dias, trocando de meio, bem como bortezomib e 5-FU a cada dois dias.Para análise de viabilidade luminescente, adicione 500 microlitros de PBS em um prato de 12 poços e transfira as fatias de tecido sequencialmente combinadas para a solução PBS usando um pincel ou uma pipeta de um mililitro. Remova o PBS das fatias. Adicionar 500 microlitros da solução de viabilidade luminescente por condição e incubar com uma rotação lenta no agitador à temperatura ambiente durante 30 minutos antes de ler a luminescência utilizando um leitor de placas de luminescência.A coloração de mucina em cortes de tecido foi visualizada usando coloração periódica por deslocamento ácido e anticorpos específicos para mucina. A incubação em calceína AM e iodeto de propídio determinou a saúde e a viabilidade. Os núcleos se sobrepuseram às células que proliferaram durante o cultivo.Estes resultados foram quantificados para determinar o número de células em proliferação dentro do corte tumoral. As fatias incubadas em anticorpo conjugado CD11b PE e Fluo-4 AM, marcaram as células imunes locais em CTU. Imagens em escala pseudocolorida mostrando níveis de cálcio intracelular permitiram visualizar níveis diferenciais de cálcio intracelular.A atividade espontânea rastreada e o tempo decorrido para antes, durante e após a resposta intercelular de cálcio dentro da célula imune CD11b positiva destacada são mostrados aqui. Os traços brutos de respostas de cálcio na célula imune CD11b, juntamente com outras células responsivas e não responsivas foram quantificados. Resultados representativos da imunotipagem de uma amostra tumoral de paciente com pseudomixoma peritoneal são mostrados aqui.A quantificação do perfil imunológico tumoral mostrou que o espécime doador 337 apresenta altos níveis de macrófagos M2, indicando que a utilização de cortes de tecido derivados do peritônio do pseudomixoma permitiu interrogar a paisagem celular única do doador das amostras tumorais dos pacientes. A farmacotipagem e a análise a jusante de fatias de tecido de tecidos humanos de pseudomixoma peritonei mostraram a morte de células em fatias tumorais, confirmada pela análise de citotoxicidade e imagens confocais em túnel. Em resposta à droga citotóxica, bortezomib e 5-fluorouracil.A análise luminescente da viabilidade foi realizada por meio de cortes sequencialmente pareados. A produção bem-sucedida de fatias de tumores mucinosos requer dissecção meticulosa e remoção de componentes celulares e do tecido acelular, como gordura e tecido denso da parede abdominal. Esta técnica pode permitir a modelagem de interações entre células cancerosas e múltiplos tipos celulares no microambiente tumoral, tais como interações adiposas, vasculares e imunes.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

No modelo in vivo para o ensaio do efeito de hipoxia em metástase tumoral

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Pesquisa do câncer

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Na Vivo Avaliação de EPR de pH, pO2, Status Redox e as concentrações de fosfato e glutationa no microambiente do Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuclídeo-fluorescência Gene do repórter de imagem para controlar a progressão do Tumor em modelos de roedores Tumor

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses para imunomodulação Tumor-alvo: Design e avaliação Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In vivo Imaging e Quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Cultura, Manipulação e Transplante Ortotópico de Organoides tumorais da bexiga de camundongo

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Um novo modelo esferoide de tumor 3D modulado por fibrosa estromal para estudar a interação tumoral-stroma e a descoberta de drogas

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...