Name: culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens
Uploaded: 2022-12-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Керси Пестонджамасп из центра визуализации Онкологического центра Мура за помощь с микроскопами UCSD Специализированный центр поддержки рака P30 грант 2P30CA023100. Эта работа была дополнительно поддержана грантом на публикацию JoVE (JRW), а также щедрыми подарками от поместья Элизабет и Эд Кримерс, Фонда семьи Юске, Фонда исследований рака желудочно-кишечного тракта и Фонда исследований метастазов в брюшной полости (AML).

Деидентификация и приобретение всех тканей были выполнены в соответствии с протоколом, одобренным IRB в Калифорнийском университете в Сан-Диего.
1. Подготовка тканей ПМП человека к тканевой обработке и культивированию
<ol><li>Транспорт опухолевых тканей и микроди?...

<ol>
	<li>Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei.">Pseudomyxoma peritonei.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendiceal+cancer+patient-specific+tumor+organoid+model+for+predicting+chemotherapy+efficacy+prior+to+initiation+of+treatment:+A+feasibility+study.">Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).</li><li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer.">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li><li>Misra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+organotypic+culture+system+of+precision-cut+slices+of+human+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).</li><li>Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+glioma+cell+invasion+using+organotypic+brain+slice+culture.">A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture.</a> Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).</li><li>Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+mucinous+tumors+of+the+ovary+and+appendix.+A+clinicopathologic+study+of+25+cases.">Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases.</a> The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).</li><li>Mizuta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+accompanied+by+intraductal+papillary+mucinous+neoplasm+of+the+pancreas.">Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas.</a> Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).</li><li>Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomyxoma+peritonei+originating+from+transverse+colon+mucinous+adenocarcinoma:+A+case+report+and+literature+review.">Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).</li><li>Fleten, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+treatment+of+mucinous+peritoneal+metastases+using+patient-derived+xenograft+models.">Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models.</a> Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).</li><li>Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+mouse+models+of+pseudomyxoma+peritonei+recapitulate+the+human+inflammatory+tumor+microenvironment.">Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment.">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).</li><li>Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+cultures+as+tools+for+functional+screening+in+the+CNS.">Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS.</a> Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).</li><li>Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoid+(PDO)+platforms+to+facilitate+clinical+decision+making.">Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).</li><li>Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+to+model+neurodegenerative+proteinopathies.">Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).</li><li>Carr, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+in+the+pathology+of+peritoneal+surface+malignancy.">New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).</li><li>Votanopoulos, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outcomes+of+repeat+cytoreductive+surgery+with+hyperthermic+intraperitoneal+chemotherapy+for+the+treatment+of+peritoneal+surface+malignancy.">Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy.</a> Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).</li><li>Weitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-vivo+organotypic+culture+platform+for+functional+interrogation+of+human+appendiceal+cancer+reveals+a+prominent+and+heterogenous+immunological+landscape.">An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape.</a> Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).</li><li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+slices+come+to+age:+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research.">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li><li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies.">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).</li></ol>

В этой рукописи описывается метод, который может быть использован для культивирования, опроса и анализа образцов опухолей псевдомиксомы брюшины человека (ПМП). Мы использовали многочисленные последующие функциональные анализы для опроса иммунного микроокружения опухоли и платформу ...

Псевдомиксома брюшины (ПМП) является редким синдромом с частотой заболеваемости 1 на миллион человек в год1. Большинство случаев ПМП вызвано метастазами из аппендикулярных новообразований. Учитывая, что у мышей нет аппендикса, похожего на человеческий, моделирование этого типа рака остается чрезвычайно сложной задачей. В то время как первичное заболевание часто излечивается хирургической резекцией, варианты лечения метастатического заболевания ограничены. Таким образом, обоснование разработки этой новой органотипической модели среза заключается в изучении патобиологии PMP. На сегодняшний день не существует аппендикулярных моделей органоидов, которые можно было бы постоянно культивировать; Однако было показано, что недавняя модель полезна для фармакологического тестирования терапевтических агентов и иммунотерапии2. Таким образом, мы адаптировали органотипическую систему культивирования срезов, которая использовалась при других типах рака человека, таких как рак головного мозга, молочной железы, поджелудочной железы, легких, яичников и других 3,4,5,6.
В дополнение к аппендикулярным новообразованиям, ПМП иногда возникает при других типах опухолей, включая рак яичников7, а в редких случаях - внутрипротоковые папиллярные муцинозные новообразования8 и рак толстой кишки9. Кроме того, эти опухоли, как правило, растут медленно, с низкими показателями приживления в моделях ксенотрансплантата пациента (PDX)10,11. Учитывая эти проблемы, существует неудовлетворенная потребность в разработке моделей для изучения этого заболевания, чтобы начать понимать патобиологию PMP и то, как эти раковые клетки: рекрутируются на поверхности брюшины, размножаются и избегают иммунного надзора.
Несмотря на то, что опухолевые срезы вырезаны из системного сосудистого кровообращения, они содержат клеточные и бесклеточные компоненты, включая внеклеточный матрикс, стромальные клетки, иммунные клетки, раковые клетки, эндотелиальные клетки и нервы. Это полуинтактное микроокружение позволяет проводить функциональное исследование этих типов клеток, что является уникальным преимуществом по сравнению с 3D-органоидными культурами, которые состоят только из раковых клеток12. Хотя органотипические культуры срезов в некоторых отношениях являются преимуществами, они также по своей сути являются подходом, основанным на низкой пропускной способности, по сравнению с 3D-органоидами, которые могут быть расширены, и подходят для мультиплексного скрининга исследуемых терапевтических препаратов13,14,15. В случае ПМП не было никаких отчетов, документально подтверждающих надежное укоренение и постоянное прохождение органоидов, полученных из ПМП16. Вероятно, это связано с медленно растущей природой опухолевых клеток, полученных из PMP, а также с низким количеством злокачественных эпителиальных клеток, обнаруженных в этих муцинозных опухолях. Учитывая необходимость разработки моделей для изучения ПМП, органотипические срезы уникально подходят для изучения этого заболевания. Мы представляем протокол подготовки, визуализации и анализа PMP из образцов человека.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron filter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 40 glass coverslips</td>
			<td>Daiggerbrand</td>
			<td>G15972H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M KCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP&#947;S&#160;</td>
			<td>Tocris&#160;</td>
			<td>4080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD206&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>321140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>555333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>357410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/Hyaluronidase&#160;</td>
			<td>Stem Cell</td>
			<td>7912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Chamber Platform</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD-Blue&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD imaging dyes</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Isamtec</td>
			<td>ISM832C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and imaging of ex vivo organotypic pseudomyxoma peritonei tumor slices from resected human tumor specimens

Псевдомиксома брюшины (ПМП) является редким заболеванием, которое возникает в результате распространения муцинозной первичной опухоли и, как следствие, накопления муцин-секретирующих опухолевых клеток в брюшной полости. ПМП может возникать при различных типах рака, включая аппендикулярный, яичниковый и колоректальный, хотя аппендикулярные новообразования на сегодняшний день являются наиболее распространенной этиологией. PMP сложно изучать из-за его (1) редкости, (2) ограниченных мышиных моделей и (3) муцинозной бесклеточной гистологии. Представленный здесь метод позволяет в режиме реального времени визуализировать и опрашивать эти типы опухолей с использованием органотипических срезов, полученных пациентом ex vivo , в препарате, где микроокружение опухоли (TME) остается нетронутым. В этом протоколе мы сначала описываем приготовление опухолевых срезов с использованием вибратома и последующего длительного посева. Во-вторых, мы описываем конфокальную визуализацию опухолевых срезов и способы мониторинга функциональных показаний жизнеспособности, визуализации кальция и локальной пролиферации. Короче говоря, срезы загружаются красителями для визуализации и помещаются в камеру визуализации, которая может быть установлена на конфокальный микроскоп. Покадровое видео и конфокальные изображения используются для оценки первоначальной жизнеспособности и клеточной функциональности. Эта процедура также исследует трансляционное клеточное движение и паракринные сигнальные взаимодействия в TME. Наконец, мы описываем протокол диссоциации опухолевых срезов, который будет использоваться для анализа проточной цитометрии. Количественный анализ проточной цитометрии может быть использован для терапевтического тестирования от скамьи до постели больного для определения изменений, происходящих в иммунном ландшафте и содержании эпителиальных клеток.

Короче говоря, образцы опухолей человека из PMP получают в соответствии с протоколом, одобренным IRB. Ткань подготавливают, микропрепарируют и затвердевают в агарозной форме для разрезания с помощью вибратома (рис. 1А; Видео 1). После разрезания срезы ткани помещаю?...

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens at JoVE.com

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

Мы описываем протокол производства, культивирования и визуализации рака человека, который метастазировал на поверхности брюшины. Резецированные образцы опухоли разрезают с помощью вибратома и культивируют на проницаемых вставках для повышения оксигенации и жизнеспособности, после чего следует визуализация и последующий анализ с использованием конфокальной микроскопии и проточной цитометрии.

Культура и визуализация органотипических срезов опухоли псевдомиксомы брюшины ex vivo из резецированных образцов опухолей человека

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare condition that results from the dissemination of a mucinous primary tumor and the resultant accumulation of ...

Это исследование демонстрирует новый подход к изучению терапии и патобиологии аппендикулярного рака в доклинических условиях. Эти методы могут быть более широко применимы для изучения других злокачественных новообразований. Аппендикулярный рак трудно изучать, учитывая его низкую заболеваемость при отсутствии аппендикса у мышей для моделирования заболевания.Этот метод позволяет изучать клеточные взаимодействия в микроокружении опухоли. Этот метод может быть применен для изучения биологии нескольких видов рака, которые имеют склонность к метастазированию в сальник, таких как колоректальный рак и рак яичников. Начните с подготовки транспорта и питательных сред.По прибытии ткани переносят опухолевые ткани псевдомиксомы брюшины в 35 полных DMEM, содержащих чашки диаметром шесть сантиметров. В дополнение к удалению любого разжиженного муцина или областей высокомуцинозной ткани, удалите любую ткань, которую трудно разрезать скальпелем. Разрезают узлы опухолевой ткани примерно на один кубик сантиметра помельче.для приготовления агарозы и заделки тканей приготовьте 5%-ный раствор слабоплавкой агарозы в PBS без эмбриональной бычьей сыворотки или FBS в тот же день, если ткани поступят. Добавьте жидкий 5%-ный раствор агарозы в шестисантиметровые чашки, содержащие два-три меньших образца опухоли, пока он не покроет образец. Поместите встроенные салфетки в холодильник с температурой четыре градуса Цельсия на 30 минут.Демонтируйте образцы тканей на вибратоме, достаньте затвердевший шнек из холодильника и нарежьте кубики агарозы немного больше ширины ткани с помощью скальпеля. Нанесите суперклей на стадию вибратома и аккуратно поместите кубик агарозы на суперклей на одну-две минуты для фиксации. Закрепите лезвие на вибратоме и установите толщину среза ткани примерно от 150 до 250 микрон для оптимальной последующей визуализации.Чтобы культивировать срезы ткани, подготовьте проницаемую вставную пластину, добавив два миллилитра полной среды DMEM над проницаемой мембраной и три миллилитра под проницаемой мембраной. Затем аккуратно извлеките кусочки ткани из режущей камеры вибратома с помощью тонкой кисти и поместите от двух до четырех ломтиков в проницаемые чашки для культуры, содержащие полный DMEM. Культивируйте срезы до семи дней при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислого газа.Во время замены среды каждые 24 часа добавляйте бортезомиб в качестве контроля для уничтожения клеток и тестируемую химиотерапию 5-фторурацилом или 5-ФУ в питательные среды для выполнения фармакологического вмешательства. Поместите срезы опухоли для анализа конфокальной визуализации в одну лунку 12-луночной чашки, содержащей PBS с 1% FBS. Для экспериментов по визуализации кальция вместо PBS инкубируйте срезы во внеклеточном растворе кальция.Окрашивайте образцы визуализирующими красителями, чтобы определить жизнеспособность срезов ткани. Инкубировать от 10 минут до одного часа после добавления красителя жизнеспособности. После инкубации перенесите ломтики в чашку Петри с оптически прозрачным стеклянным дном, содержащую PBS с 1% FBS, для использования для визуализации на конфокальном устройстве визуализации.Отрежьте небольшой кусочек от конца наконечника пипетки объемом один миллилитр, чтобы расширить отверстие, обеспечивая энергичную механическую диссоциацию путем пипетки. Инкубируйте ломтики при температуре 37 градусов Цельсия с вращением в течение пяти-15 минут в одном миллилитре буфера для переваривания, с энергичным разрушением тканей два-три раза во время инкубации с использованием механической диссоциации. После того, как ткань переварится, перенесите разрушенную ткань со средой для разложения на 70-микрометровый фильтр, помещенный поверх конической трубки объемом 50 миллилитров.Собирайте более крупные кусочки с помощью стерильных щипцов или пипетки. Используя тупую заднюю часть пластикового пятимиллилитрового шприца, разомните любые более крупные недиссоциированные ломтики и промойте их четырьмя миллилитрами PBS, содержащими 2% FBS. Возьмите надосадочную жидкость диссоциированной клетки и центрифугу при 300 г в течение пяти-10 минут.Удалите надосадочную жидкость и промойте гранулы одним миллилитром PBS, содержащим 2% FBS. Чтобы подготовить образец к проточной цитометрии, добавьте блокирующий буфер, содержащий 50 микролитров человеческого блока FC, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Выполните внеклеточное окрашивание с использованием соответствующих антител в 50 микролитрах PBS, содержащих 2% FBS.Аликвотируйте пять миллилитров полной среды для контроля и условий обработки. На два-четыре ломтика, нанесенных на проницаемую посуду, добавьте среду из аликвот контрольной обработки и дополнительную комбинированную терапию, которая будет использоваться для последующего анализа жизнеспособности живых мертвецов. Оставьте срезы ткани в культуре, содержащей полный ДМЭМ, на два-пять дней, меняя среду, а также бортезомиб и 5-ФУ через день.Для люминесцентного анализа жизнеспособности добавьте 500 микролитров PBS в 12-луночную чашку и перенесите последовательно подобранные срезы ткани в раствор PBS с помощью кисти или пипетки объемом один миллилитр. Удалите PBS со срезов. Добавьте 500 микролитров люминесцентного раствора жизнеспособности в каждом условии и инкубируйте с медленным вращением на шейкере при комнатной температуре в течение 30 минут перед считыванием люминесценции с помощью считывателя люминесцентных пластин.Окрашивание муцина в срезах тканей визуализировали с помощью периодического окрашивания кислотным сдвигом и муцин-специфических антител. Инкубация в кальцеине AM и йодиде пропидия определяла здоровье и жизнеспособность. Ядра перекрывали клетки, размножавшиеся во время культивирования.Эти результаты были количественно оценены для определения количества пролиферирующих клеток в опухолевом срезе. Срезы, инкубированные в конъюгированном антителе CD11b PE и Fluo-4 AM, мечены местными иммунными клетками в CTU. Псевдоцветные масштабированные изображения, показывающие внутриклеточные уровни кальция, позволили визуализировать дифференциальные уровни внутриклеточного кальция.Здесь показана отслеживаемая спонтанная активность и промежуток времени до, во время и после межклеточного кальциевого ответа в выделенной CD11b-положительной иммунной клетке. Необработанные следы кальциевых реакций в иммунной клетке CD11b, наряду с другими чувствительными и нечувствительными клетками, были количественно определены. Представлены репрезентативные результаты иммунотипирования образца опухоли пациента с псевдомиксомой брюшины.Количественная оценка иммунопрофиля опухоли показала, что донорский образец 337 имеет высокие уровни макрофагов M2, что указывает на то, что использование срезов ткани, полученных из псевдомиксомы брюшины, позволило исследовать уникальный донорский клеточный ландшафт образцов опухоли пациента. Фармакотипирование и последующий анализ срезов тканей из тканей псевдомиксомы брюшины человека показали гибель клеток в опухолевых срезах, что подтверждается анализом цитотоксичности и туннельно-конфокальной визуализацией. В ответ на цитостатический препарат применяют бортезомиб и 5-фторурацил.Люминесцентный анализ жизнеспособности проводили с использованием последовательно подобранных срезов. Успешное производство срезов муцинозных опухолей требует тщательного вскрытия и удаления клеточных и бесклеточных компонентов ткани, таких как жир и плотная ткань брюшной стенки. Этот метод может позволить моделировать взаимодействия между раковыми клетками и несколькими типами клеток в микроокружении опухоли, такими как взаимодействия жировых, сосудистых и иммунных клеток.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

В Vivo модели для тестирования влияния гипоксии на метастазирование опухолей

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Визуализация-резидентов CD8 Т-лимфоцитов в опухоли легких человека кусочки с помощью конфокальной микроскопии

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

В естественных условиях ЭПР Оценка рН, pO2, окислительно-восстановительного состояния и концентрации фосфатов и глутатиона в микроокружения опухоли

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Радионуклида флуоресценции Репортер ген Imaging для отслеживания опухолевой прогрессии в моделях грызунов опухоли

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Assay цифровой полимеразной цепной реакции для генетической вариации в спорадических семейное аденоматозное Polyposis пациента, используя формат чип в трубе

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Парамиксовирусы для ориентированных на опухоль иммуномодуляция: дизайн и оценке Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

В Vivo изображений и количественного пребывания ангиогенных ответ в опухоли зебрафиш ксенотрансплантатов

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Культура, манипуляция и ортотопическая трансплантация органов опухолевых опухолей мышелового пузыря

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Поколение ортотопических опухолей поджелудочной железы и Ex vivo Характеристика опухоли-проникновения T клеточной цитотоксичности

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Роман Стромальный Фибробласт-Модулированные 3D опухолевой сфероидной модели для изучения опухоли-Строма Взаимодействия и наркотиков Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...