Name: establishment and characterization of patient-derived xenograft models of anaplastic thyroid carcinoma and head and neck squamous cell carcinoma
Uploaded: 2023-06-02T14:50:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (Grant Nos. 2019JDRC0019 e 2021ZYD0097), o projeto 1.3.5 para disciplinas de excelência, West China Hospital, Sichuan University (Grant No. ZYJC18026), o projeto 1.3.5 para disciplinas de excelência-Projeto de Incubação de Pesquisa Clínica, West China Hospital, Sichuan University (Grant No. 2020HXFH023), os Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (SCU2022D025), o Projeto de Cooperação Internacional do Escritório de Ciência e Tecnologia de Chengdu (Processo nº 2022-GH02-00023-HZ), o Projeto Centelha de Inovação da Universidade de Sichuan (Bolsa nº 2019SCUH0015) e o Fundo de Treinamento de Talentos para a Integração de Engenharia Médica do Hospital da China Ocidental - Universidade de Ciência e Tecnologia Eletrônica (Bolsa nº. HXDZ22012).

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos da Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do West China Hospital, Sichuan University. Camundongos imunodeficientes NOD-SCID com idade entre 4-6 semanas de idade (de ambos os sexos) e camundongos fêmeas Balb/c nude com idade entre 4-6 semanas foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver <strong...

Este estudo estabeleceu com sucesso os modelos PDX subcutâneos de ATC e CEC de cabeça e pescoço. Há muitos aspectos a serem observados durante o processo de construção do modelo PDX. Quando o tecido tumoral é separado do paciente, ele deve ser colocado na caixa de gelo e enviado ao laboratório para inoculação o mais rápido possível. Depois que o tumor chega ao laboratório, o operador deve se atentar para manter um campo estéril e praticar procedimentos assépticos. Para amostras de biópsia por agulha, como...

O modelo PDX é um modelo animal no qual o tecido tumoral humano é transplantado em camundongos imunodeficientes e cresce no ambiente fornecido pelos camundongos1. Os modelos tradicionais de linhagens celulares tumorais sofrem de várias desvantagens, como a falta de heterogeneidade, a incapacidade de reter o microambiente tumoral, a vulnerabilidade a variações genéticas durante repetidas passagens in vitro e a pobre aplicaçãoclínica2,3. As principais desvantagens dos modelos animais geneticamente modificados são a perda potencial das características genômicas dos tumores humanos, a introdução de novas mutações desconhecidas e a dificuldade em identificar o grau de homologia entre tumores de camundongos e tumoreshumanos4. Além disso, a preparação de modelos animais geneticamente modificados é cara, demorada e relativamente ineficiente4.
O modelo PDX tem muitas vantagens sobre outros modelos tumorais em termos de refletir a heterogeneidade tumoral. Do ponto de vista histopatológico, embora a contraparte do camundongo substitua o estroma humano ao longo do tempo, o modelo PDX preserva bem a estrutura morfológica do tumor primário. Além disso, o modelo PDX conserva a identidade metabolômica do tumor primário por pelo menos quatro gerações e reflete melhor as complexas inter-relações entre as células tumorais e seu microambiente, tornando-o único na simulação do crescimento, metástase, angiogênese e imunossupressão do tecido tumoralhumano5,6,7. Em nível celular e molecular, o modelo PDX reflete com precisão a heterogeneidade inter e intratumoral de tumores humanos, bem como as características fenotípicas e moleculares do câncer original, incluindo padrões de expressão gênica, status de mutação, número de cópias, metilação e proteômica do DNA 8,9. Modelos PDX com passagens diferentes têm a mesma sensibilidade à terapia medicamentosa, indicando que a expressão gênica de modelos PDX é altamente estável10,11. Estudos têm demonstrado excelente correlação entre a resposta do modelo PDX a um fármaco e as respostas clínicas dos pacientes a esse fármaco12,13. Portanto, o modelo PDX emergiu como um poderoso modelo de pesquisa pré-clínica e translacional, particularmente para triagem de drogas e predição de prognóstico clínico.
O câncer de tireoide é um tumor maligno comum do sistema endócrino e é uma neoplasia maligna humana que tem mostrado um rápido aumento na incidência nos últimosanos14. O carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) é o câncer mais maligno da tireoide, com sobrevida mediana de apenas 4,8meses15. Embora apenas uma minoria dos pacientes com câncer de tireoide seja diagnosticada com ATC a cada ano na China, a taxa de mortalidade é próxima de 100%16,17,18. A ATC geralmente cresce rapidamente e invade os tecidos adjacentes do pescoço, bem como os linfonodos cervicais, e cerca de metade dos pacientes apresenta metástases àdistância19,20. O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é o sexto câncer mais comum no mundo e uma das principais causas de morte por câncer, estimando-se que 600.000 pessoas sofram de CEC de cabeça e pescoço a cada ano21,22,23. O CEC de cabeça e pescoço inclui um grande número de tumores, incluindo nariz, seios da face, boca, amígdalas, faringe e laringe24. ATC e CEC de cabeça e pescoço são duas das principais neoplasias malignas de cabeça e pescoço. Para facilitar o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e tratamentos personalizados, é necessário desenvolver modelos animais pré-clínicos robustos e avançados, como os modelos PDX de ATC e HNSCC.
Este artigo apresenta métodos detalhados para estabelecer o modelo PDX subcutâneo de ATC e CEC de cabeça e pescoço, analisa os principais fatores que afetam a taxa de tomada tumoral na construção do modelo e compara as características histopatológicas entre o modelo PDX e o tumor primário. Enquanto isso, neste trabalho, testes farmacodinâmicos in vivo foram realizados utilizando os modelos PDX construídos com sucesso para validar sua relevância clínica.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2.4 mm x 2.0 mm trocar</td>
			<td>Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>18-9065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c nude mice</td>
			<td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td>
			<td>401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Suzhou Antai</td>
			<td>BSC-1300IIA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade</td>
			<td>Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>18-0823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791/430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopreservation tube</td>
			<td>Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custodiol HTK-Solution</td>
			<td>Custodiol</td>
			<td>2103417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td>
			<td>SIGMA-ALORICH</td>
			<td>D5879-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>METTLER</td>
			<td>ME104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital caliper</td>
			<td>Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd</td>
			<td>0-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum(FBS)</td>
			<td>VivaCell</td>
			<td>C04001-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBM SPSS Statistics 26</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd&#160;</td>
			<td>100761663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenvatinib</td>
			<td>ApexBio</td>
			<td>A2174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD SCID immunodeficient mice</td>
			<td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td>
			<td>406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-03101BCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>WHB</td>
			<td>WHB-60/WHB-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline&#160;</td>
			<td>Sichuan Kelun</td>
			<td>W220051705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>18-0110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>18-1241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet ointment</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>P10015353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd</td>
			<td>070031777</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of patient-derived xenograft models of anaplastic thyroid carcinoma and head and neck squamous cell carcinoma

Os modelos de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) preservam fielmente as características histológicas e genéticas do tumor primário e mantêm sua heterogeneidade. Os resultados farmacodinâmicos baseados em modelos PDX são altamente correlacionados com a prática clínica. O carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) é o subtipo mais maligno de câncer de tireoide, com forte invasividade, prognóstico ruim e tratamento limitado. Embora a taxa de incidência de ATC seja responsável por apenas 2%-5% do câncer de tireoide, sua taxa de mortalidade é tão alta quanto 15%-50%. O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é uma das neoplasias malignas mais comuns de cabeça e pescoço, com mais de 600.000 novos casos em todo o mundo a cada ano. Neste trabalho, são apresentados protocolos detalhados para estabelecer modelos PDX de ATC e CECP. Neste trabalho, os principais fatores que influenciam a taxa de sucesso de construção do modelo foram analisados, e as características histopatológicas foram comparadas entre o modelo PDX e o tumor primário. Além disso, a relevância clínica do modelo foi validada pela avaliação da eficácia terapêutica in vivo de fármacos representativos de uso clínico nos modelos PDX construídos com sucesso.

Um total de 18 espécimes de câncer de tireoide foram transplantados, e cinco modelos PDX de câncer de tireoide foram construídos com sucesso (taxa de tomada tumoral de 27,8%), incluindo quatro casos de câncer indiferenciado de tireoide e um caso de câncer anaplásico de tireoide. A correlação entre a taxa de sucesso de construção do modelo e a idade, sexo, diâmetro do tumor, grau e diferenciação tumoral foram analisadas. Embora a taxa de sucesso do modelo de amostras tumorais de grau 4 tenha sido maior do qu...

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Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

O presente protocolo estabelece e caracteriza um modelo de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) de carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) e carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP), uma vez que os modelos PDX estão rapidamente se tornando o padrão no campo da oncologia translacional.

Estabelecimento e Caracterização de Modelos de Xenoenxerto Derivado de Pacientes de Carcinoma Anaplásico de Tireoide e Carcinoma Espinocelular de Cabeça e Pescoço

Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully preserve the histological and genetic characteristics of the primary tumor and maintain its ...

Esse protocolo ajuda a estabelecer modelos de ATC e HNSCC PDX que melhor refletem a heterogeneidade tumoral, a diversidade molecular e predizem desfechos clínicos. A técnica é simples de operar, tem uma alta taxa de sucesso e também pode ser adequada para outros modelos PDX. Esta técnica pode ser estendida para o rastreamento de sensibilidade a drogas anti-câncer para orientar o tratamento personalizado de pacientes com câncer.Um indivíduo que nunca realizou esta técnica pode encontrar algumas dificuldades e recomenda-se prestar atenção a cada detalhe do esquema. Após a obtenção de amostras tumorais de ATC e CEC de cabeça e pescoço em tubo centrífugo de 50 milímetros contendo solução estéril de HTK, desinfetá-las com álcool a 75%. Use pinças oftálmicas esterilizadas para transferir o tecido tumoral para uma placa de Petri de seis centímetros cheia de soro fisiológico e corte-os em pequenos pedaços usando uma lâmina.Em seguida, transfira as peças para uma nova placa de Petri de seis centímetros contendo o soro fisiológico e envolva-a com filme selante. Coloque o prato embrulhado em uma caixa de gelo, leve-o para a sala de animais livre de patógenos com tesouras, pinças e agulhas de inoculação. Depois de anestesiar o rato, remova os pelos no tórax lateral direito e desinfete a área com álcool a 75%.Use uma tesoura para fazer uma incisão de dois milímetros no meio do tórax lateral direito. Com a pinça, retire o tecido da placa de Petri e coloque-o na agulha do trocarte. Segure o rato e aperte a pele no local da punção.Insira o trocarte com a peça do tumor na incisão para o espaço subcutâneo, em seguida, mova-se para a parte de trás do ombro e empurre o núcleo do trocarte. Para reservar o tecido restante usando uma gaze estéril, remova o soro fisiológico da superfície do tumor, garantindo que não esteja excessivamente úmido. Coloque de quatro a seis pedaços de tecido em um tubo de criopreservação celular de dois mililitros e adicione um mililitro de solução de criopreservação no tubo.Em seguida, coloque o tubo em uma caixa de resfriamento gradiente e congele-o a menos 80 graus Celsius durante a noite. Por fim, transfira-o para nitrogênio líquido. Para ressuscitar os tumores modelo PDX, utilizar paquímetro de Vernier para medir o comprimento e a largura do tumor subcutâneo uma vez por semana.Calcular o volume do tumor e desenhar a curva de crescimento do tumor. Em seguida, usando tesoura, corte a pele de camundongo eutanasiada ao redor do tumor. Retire o tumor com pinça e coloque-o em uma placa de Petri.Realizar o transplante tumoral até a quinta geração de camundongos, conforme demonstrado anteriormente. Selecionar o tecido tumoral de um camundongo modelo ATC PDX de geração P5. Corte-o em pedaços de dois a quatro milímetros cúbicos.Inocular essas peças por via subcutânea, como demonstrado anteriormente, na parte de trás direita de um camundongo BALB/c fêmea nu, de quatro a seis semanas. Quando o tumor crescer de 50 a 150 milímetros cúbicos, divida os camundongos em três grupos. Depois de administrar lenvatinib, cisplatina e controle duas vezes por semana, meça o peso corporal do camundongo.Além disso, meça o volume do tumor. A análise de correlação mostrou que a taxa de sucesso da construção do modelo ATC PDX não foi dependente da idade, sexo, diâmetro do tumor, grau e diferenciação tumoral. A taxa de tomada tumoral na construção do modelo PDX de CEC de cabeça e pescoço demonstrou que o grau de diferenciação foi associado com a taxa de sucesso do modelo, enquanto os outros parâmetros não afetaram a taxa de tomada do tumor.As curvas de crescimento tumoral para cada modelo de PDX ilustraram que as amostras de ATC foram passadas de forma estável para a geração P3, enquanto dois casos de amostras de CEC de cabeça e pescoço não formaram tumores após passarem para a geração P1. A taxa de crescimento tumoral da geração P0 para a maioria dos modelos PDX foi relativamente mais lenta do que para as passagens posteriores, provavelmente devido à adaptação do microambiente de camundongos. O exame histopatológico demonstrou que os tumores PDX mantêm as características morfológicas dos tumores primários.O tratamento com lenvatinib inibiu significativamente o crescimento tumoral e mostrou menor peso tumoral no modelo ATC PDX em comparação com o grupo controle. Além disso, os camundongos tratados com lenvatinibe não exibiram mudanças perceptíveis em seu peso total. A dosagem excessiva de cisplatina resultou em toxicidade significativa, evidenciada pela perda de peso e até morte.Os tumores frescos devem ser lavados várias vezes com soro fisiológico normal antes de serem cortados em pedaços. A mistura por amostras tumorais biopsiadas com e inoculá-las provavelmente causará a formação de tumores. Este modelo pode ser usado para pesquisa de biologia tumoral, triagem de drogas, terapia personalizada.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Um Modelo para Perineural Invasion em cabeça e pescoço carcinoma espinocelular

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Pesquisa do câncer

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Imuno-histoquímica de fluorescência de quatro cores das subpopulações de células T em amostras de carcinoma de células escamosas humano oftaríngeas fixadas em formalina, arquivadas, formadas por formalina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapia de testes em um modelo de cultura celular 3D baseado no Spheroid para cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabricação de língua matriz extracelular e reconstituição da língua Carcinoma de células escamosas In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal inoculação de células de Carcinoma de células escamosas em ratos para perfil imune de Tumor e tratamento avaliação de resposta

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Modelos de xenoenxertos Ortotópicos derivados do paciente para Carcinoma de células urotelial humana e crescimento do tumor do câncer colorretal e metástase espontânea

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolamento e caracterização de modelos organóides de adenocarcinoma ductatopansa pâncreas derivados do paciente

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Sistema de Cocultura Multidimensional para Modelar Progressão do Carcinoma Escamoso Pulmonar

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...