Name: implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid via optical coherence tomography
Uploaded: 2022-12-02T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography at JoVE.com

Denne undersøgelse blev delvist støttet af bevilling 1304/20 fra Israel Science Foundation (ISF), Israel, til Arie Marcovich. Vi takker Shahar Ish-Shalom og Ady Yosipovich, fra Institut for Patologi, Kaplan Medical Center, Rehovot, Israel, for histologianalyse.

Forsøgene i protokollen blev godkendt af det israelske nationale råd for dyreforsøg og overholder ARVO-erklæringen for brug af dyr i oftalmisk og synsforskning. Hunmus i alderen 87-10 uger blev anvendt til dette studie og blev udsat for 12/12 timers lys-mørke cyklusser. Dyrene blev hentet fra en kommerciel kilde (se materialetabel).
1. Cellekultur
<ol><li>Dyrkning B16LS9-celler i RPMI 1640-medium, suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin,...

<ol>
	<li>Jager, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+melanoma.">Uveal melanoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 6 (1), 1-25 (2020).</li><li>Bustamante, P., Piquet, L., Landreville, S., Burnier, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+melanoma+pathobiology:+Metastasis+to+the+liver.">Uveal melanoma pathobiology: Metastasis to the liver.</a> Seminars in Cancer Biology. 71, 65-85 (2021).</li><li>Damato, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+treatment+of+choroidal+melanoma+in+relation+to+the+prevention+of+metastatic+death-A+personal+view.">Ocular treatment of choroidal melanoma in relation to the prevention of metastatic death-A personal view.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 66, 187-199 (2018).</li><li>Jouhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+fatal+choroidal+melanoma+study.+A+survey+by+the+European+Ophthalmic+Oncology+Group.">The small fatal choroidal melanoma study. A survey by the European Ophthalmic Oncology Group.</a> American Journal of Ophthalmology. 202, 100-108 (2019).</li><li>Cao, J., Jager, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+eye+models+for+uveal+melanoma.">Animal eye models for uveal melanoma.</a> Ocular Oncology and Pathology. 1 (3), 141-150 (2015).</li><li>Uner, O. E., Gandrakota, N., Azarcon, C. P., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+uveal+melanoma.">Animal models of uveal melanoma.</a> Annals of Eye Science. 7, 21-30 (2022).</li><li>Yang, H., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+2b+decreases+hepatic+micrometastasis+in+a+murine+model+of+ocular+melanoma+by+activation+of+intrinsic+hepatic+natural+killer+cells.">Interferon alpha 2b decreases hepatic micrometastasis in a murine model of ocular melanoma by activation of intrinsic hepatic natural killer cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (7), 2056-2064 (2004).</li><li>Yang, H., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunologic+and+anti-angiogenic+therapy+reduces+hepatic+micrometastases+in+a+murine+ocular+melanoma+model.">Combined immunologic and anti-angiogenic therapy reduces hepatic micrometastases in a murine ocular melanoma model.</a> Current Eye Research. 31 (6), 557-562 (2006).</li><li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+liver+metastasis.">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion &amp; Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li><li>Diaz, C. E., Rusciano, D., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16LS9+melanoma+cells+spread+to+the+liver+from+the+murine+ocular+posterior+compartment+(PC).">B16LS9 melanoma cells spread to the liver from the murine ocular posterior compartment (PC).</a> Current Eye Research. 18 (2), 125-129 (1999).</li><li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+liver+metastasis.">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion &amp; Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li><li>Ashur-Fabian, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrac+delayed+the+onset+of+ocular+melanoma+in+an+orthotopic+mouse+model.">Tetrac delayed the onset of ocular melanoma in an orthotopic mouse model.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 632335 (2019).</li><li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+c-met+overexpression+in+liver-metastatic+B16-LS9+melanoma+cells.">Mechanisms regulating c-met overexpression in liver-metastatic B16-LS9 melanoma cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 81 (3), 477-487 (2001).</li><li>Harning, R., Szalay, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+metastasis+of+in+vivo+and+in+vitro+derived+syngeneic+murine+melanoma.">Ocular metastasis of in vivo and in vitro derived syngeneic murine melanoma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 28 (9), 1599-1604 (1987).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Notting, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+bioluminescent+imaging+of+human+uveal+melanoma+in+a+new+mouse+model+of+local+tumor+growth+and+metastasis.">Whole-body bioluminescent imaging of human uveal melanoma in a new mouse model of local tumor growth and metastasis.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (5), 1581-1587 (2005).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+xenograft+murine+human+uveal+melanoma+model+develops+hepatic+micrometastases.">In-vivo xenograft murine human uveal melanoma model develops hepatic micrometastases.</a> Melanoma Research. 18 (2), 95-103 (2008).</li><li>Murthy, R. K., Haji, S., Sambhav, K., Grover, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+retinal+diseases.">Clinical applications of spectral domain optical coherence tomography in retinal diseases.</a> Biomedical Journal. 39 (2), 107-120 (2016).</li><li>Drexler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-resolution+ophthalmic+optical+coherence+tomography.">Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography.</a> Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).</li><li>Ochakovski, G. A., Fischer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+of+mouse+models+with+OCT.">Phenotyping of mouse models with OCT.</a> Methods in Molecular Biology. 1834, 285-291 (2019).</li><li>Zaks, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+imaging+for+assessing+tumor+growth+in+mouse+models+of+ocular+melanoma.">In-vivo imaging for assessing tumor growth in mouse models of ocular melanoma.</a> Experimental Eye Research. 204, 108431 (2021).</li><li>Brar, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Academy+of+Ophthalmology+2022-2023+BCSC.+2.">American Academy of Ophthalmology 2022-2023 BCSC. 2.</a> Fundamentals and principles of ophthalmology. , (2022).</li><li>Duker, J. S., Waheed, N. K., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Retinal OCT: Optical Coherence Tomography, 2nd Edition. , (2021).</li><li>Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+subcutaneous+tumor+size+in+athymic+(nude)+mice.">Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).</li><li>Richards, J. R., Yoo, J. H., Shin, D., Odelberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+uveal+melanoma:+Strengths,+weaknesses,+and+future+directions.">Mouse models of uveal melanoma: Strengths, weaknesses, and future directions.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 33 (2), 264 (2020).</li><li>Chen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+molecular+imaging-escorted+adipose+photodynamic-browning+synergy+for+fighting+obesity+with+virus-like+complexes.">Photoacoustic molecular imaging-escorted adipose photodynamic-browning synergy for fighting obesity with virus-like complexes.</a> Nature Nanotechnology. 16 (4), 455-465 (2021).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+visualization+of+early+cancer+hepatic+micrometastasis+and+intraoperative+image-guided+surgery+by+photoacoustic+imaging.">Label-free visualization of early cancer hepatic micrometastasis and intraoperative image-guided surgery by photoacoustic imaging.</a> Journal of Nuclear Medicine. 61 (7), 1079-1085 (2020).</li></ol>

Uveal melanom er en ødelæggende sygdom, for hvilken nye terapeutiske tilgange er meget nødvendige. Forskning i uveal melanom og potentielle behandlinger er imidlertid begrænset af de tekniske udfordringer ved uveal melanom dyremodeller 1,25. Okulære tumorer, som induceres ved intraokulær injektion af kræftceller, er meget variable i både lokalisering og størrelse, sandsynligvis på grund af de små dimensioner af museøjet. En sådan variabilitet er en h...

Uveal melanom (UM) er den hyppigste intraokulære primære malignitet hos voksne. Ca. 90% af okulære melanomer stammer fra melanocytter i choroidområdet i uvealkanalen1. UM er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed, da det anslås, at tæt på 50% af patienterne udvikler metastatisk sygdom, hvor leveren er det vigtigste sted for metastase2. Tidlig behandling af primære læsioner kan reducere risikoen for metastaser, men ingen effektiv behandling forhindrer metastasedannelse3.
Standardbehandlingen af uveal melanom omfatter strålebehandling, som er forbundet med synstab på grund af optisk neuropati, retinopati, tørre øjne syndrom og grå stær. Kirurgisk resektion er typisk forsinket, indtil væksten af læsionen er anerkendt og karakteriseret. En sådan forsinkelse kan dog muliggøre udvikling af metastatisk sygdom4. I nogle tilfælde kræves forgæves enukleation. Selvfølgelig kompromitterer denne radikale procedure synet og resulterer i dramatisk æstetisk forringelse.
Der har været mange bestræbelser dedikeret til at udvikle eksperimentelle modeller til at studere uveal melanom. Prækliniske dyremodeller, der muliggør nøjagtig vurdering af denne malignitet, er nøglen til at undersøge nye diagnostiske og terapeutiske strategier for uveal melanom. Eksperimentelle dyremodeller af okulært melanom er hovedsageligt baseret på podning af tumorceller hos mus, rotter og kaniner 5,6. Musemodeller er omkostningseffektive og anvendes i vid udstrækning til melanomundersøgelser på grund af deres hurtige reproduktionshastighed og høje genomlighed med mennesker. Den murin kutane melanom cellelinje B16 er almindeligt anvendt til at inokulere C57BL6 mus og inducere syngeneic tumorer. Når du bruger denne model til at inducere uveal melanom, skal tumorbærende øjne typisk være enukleerede 7-14 dage efter podning. Desuden er B16 en meget invasiv model. Øjets immunprivilegerede natur understøtter metastaser, og metastaser kan typisk påvises 3-4 uger efter tumorcellepodning. Subkulturer af den oprindelige B16-linje viser forskellige metastatiske egenskaber6. For eksempel har Queens melanomlinjen en høj metastatisk hastighed 7,8. B16LS9-cellelinjen har dendritisk cellemorfologi og blev afledt af levermetastaser fra C57BL/6-mus injiceret med forældrenes kutane melanomlinje B16F19. Når de injiceres i det bageste rum i øjet, viste disse celler sig at danne intraokulære tumorer, som histologisk ligner humant uvealt melanom og danner leverspecifikke metastaser i C57BL / 6, men ikke Balb / C, mus10,11,12. Genetisk er cellerne karakteriseret ved højere ekspression af c-met proto-onkogen, som fungerer som en cellulær receptor for hepatocytvækstfaktor13. I modsætning hertil metastaserer B16F10, den 10. passage af forældrenes B16, primært til lungerne, når de podes intraokulært14. Både B16F10 og B16LS9 er pigmenterede12.
Flere centrale udfordringer begrænser succesen med murine uveal melanom modeller. For det første kan tumorcelle refluks føre til ekstraokulært eller subkonjunktivalt melanom. For det andet er tumorvækst efter intraokulær inokulation af melanomceller ofte meget variabel, hvilket udgør vanskeligheder med at evaluere behandling og fremskridt. En anden stor vanskelighed er den begrænsede evne til at følge tumorvækst in vivo. Mens bioluminescerende billeddannelse, såsom luciferase, der udtrykker tumorer, almindeligvis anvendes til at overvåge okulær tumorvækst15,16, kan den ikke give oplysninger om tumorens intraokulære placering. Derfor udføres evaluering af tumoren typisk efter enukleation af øjet10,17. Dette begrænser i høj grad evnen til at karakterisere tumorprogression og respons på behandlinger i vid udstrækning. En anden stor hindring for at studere uveal melanom er vanskeligheden ved at overvåge læsioner hos pigmenterede mus. Nye tilgange, der overvinder disse vanskeligheder, er nødvendige for at fremme forskningen i uveal melanom i dyremodeller.
Optisk kohærenstomografi (OCT) giver karakteristiske evner til at afbilde dybt ind i de forskellige sektioner af øjet i høj opløsning, hvilket er uden sidestykke af andre metoder, herunder ultralyd18,19. OCT-billeddannelse er blevet brugt i dyremodeller til at studere forskellige øjensygdomme20. For nylig blev OCT-billeddannelse demonstreret som ikke-invasive midler til evaluering af intraokulær tumorvækst21. Protokollen beskrevet her skildrer implantationen af melanomceller i murine choroid og udnyttelsen af OCT til at forudsige intraokulær tumorlokalisering og størrelse på tidspunktet for celleinokulation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &#956;L glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>721711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needles</td>
			<td>BD Microbalance</td>
			<td>2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Orion Phrma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16LS9 cells</td>
			<td>from Hans Grossniklaus USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine&#160;</td>
			<td>richter pharma</td>
			<td>102047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 female mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential vitamin mixture</td>
			<td>satorius</td>
			<td>01-025-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>rhenium</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>390862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight OCT segmentation software&#160;</td>
			<td>Phoenix Micron, Inc&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>bremer pharma GMBH (medimarket)</td>
			<td>17889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine&#160;</td>
			<td>zoetis (vetmarket)</td>
			<td>102532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin 0.3% eye drops</td>
			<td>allergan</td>
			<td>E92170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical coherence tomography&#160;</td>
			<td>Phoenix Micron, Inc&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxybuprocaine 0.4%</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>393050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-amphoteracin</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)&#160;</td>
			<td>satorius</td>
			<td>02-023-1a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI cell media</td>
			<td>satorius</td>
			<td>01-104-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>OPMI-6 CFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>390723</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid via optical coherence tomography

Etablering af eksperimentelle choroidale melanommodeller er udfordrende med hensyn til evnen til at inducere tumorer ved den korrekte lokalisering. Derudover begrænser vanskeligheder med at observere posterior choroidalt melanom in vivo tumorplacering og vækstevaluering i realtid. Den her beskrevne fremgangsmåde optimerer teknikker til etablering af choroidalt melanom hos mus via en flertrins sub-choroidal B16LS9-celleinjektionsprocedure. For at muliggøre præcision i indsprøjtning i de små dimensioner af musens uvea, udføres den komplette procedure under et mikroskop. For det første dannes en konjunktival peritomi i øjets dorsal-temporale område. Derefter skabes en kanal ind i det subkoroidale rum ved at indsætte en nål gennem den udsatte sclera. Dette efterfølges af indsættelse af en stump nål i kanalen og injektion af melanomceller i choroid. Umiddelbart efter injektion anvendes ikke-invasiv optisk kohærenstomografi (OCT) billeddannelse til at bestemme tumorplacering og fremskridt. Nethindeløsning evalueres som en forudsigelse for tumorsted og størrelse. Den præsenterede metode muliggør reproducerbar induktion af choroidlokaliseret melanom hos mus og levende billeddannelse af tumorvækstevaluering. Som sådan giver det et værdifuldt værktøj til at studere intraokulære tumorer.

Øjnene blev undersøgt via OCT umiddelbart efter injektion af B16LS9-cellerne. Lokal nethindeløsning blev observeret efter injektion. Musene udviste tre mønstre af RD: fokal (figur 2, øverste panel), lækage til glaslegemet (figur 2, midterste panel) og udvidet RD (figur 2, nederste panel). Udvidet RD er sandsynligvis forårsaget af skader fra injektionen. Der var en sammenhæng mellem mønsteret af RD umiddelbart efter...

Watch this Scientific Journal Video about Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography at JoVE.com

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Denne protokol beskriver implantation og evaluering af melanom i murine choroid ved hjælp af optisk kohærenstomografi.

Implantation og evaluering af melanom i murine choroid via optisk kohærenstomografi

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Etablering af tumorer som den bageste del af øjet er udfordrende. Denne metode muliggør induktion af reproducerbare choroidale melanomtumorer hos mus og levende billeddannelse af tumorvækst til evaluering. Denne protokol anvender OCT live imaging til at vurdere placeringen af tumorerne allerede på tidspunktet for tumorcelleinokulation og til at følge tumorvækst hos levende dyr.Uveal melanom er en ødelæggende sygdom med tæt på en 50% metastase. Udvikling af eksperimentelle modeller er nøglen til at fremme forskning rettet mod nye terapeutiske muligheder. En fordel ved denne metode er, at den umiddelbare vurdering af injektionens succes gør det muligt at nå studiegrupper med homogene tumorer og løbende følge dem ved levende billeddannelse.At undersøge tumorprogression. Injektion i den lille mus' øjne kræver øvelse. Evnen til at visualisere de injicerede celler giver dig mulighed for at vurdere din succes med det samme og gentage med flere mus efter behov.Demonstration af proceduren vil være Dr.Dimitri Gaber fra Ophthalmology Research Laboratory ved Kaplan Medical Center. Til at begynde med skal du anvende 0,4% topisk oftalmisk bedøvelse, Oxybuprocain på begge øjne på den bedøvede mus. Påfør derefter topisk 0,5% Tropicamid på begge øjne for at udvide pupillerne, efterfulgt af 1,4% hydroxyethylcellulose som smøremiddel for at undgå tørring af øjnene.Overhold musens ene øje under et operationsmikroskop. Hold øjenlågene åbne med sterile intraokulære tang. Hold derefter den overlegne temporale limbo-conjunctiva og træk mod en infranasal position.Fastgør denne position ved at holde limbo-conjunctiva under hele proceduren. Brug en 30 gauge nålespids til at lave en lille konjunktival peritomi i det dorsale temporale område cirka en til to millimeter bagved limbussen. Fjern den overskydende sener kapsel fra åbningen af peritomien.Indsæt nålespidsen for at trænge ind i scleraen, hvilket skaber et spor ind i det subchoroidale rum, indtil den brune farve på choroid vises gennem det udsatte hvide stof i sclera. Læg cellerne i en steril 10 mikroliter glas Hamilton sprøjte monteret med en 32 gauge stump nål snoet i en 45 graders vinkel. Indsæt nålen på den indlæste sprøjte ca. to millimeter i den oprettede kanal, og injicer to mikroliter af cellesuspensionen.Hold nålen på plads efter injektion i to til tre sekunder, indtil al væske er ryddet. Fjern nålen ved at trække den forsigtigt ud for at undgå lækage fra kanalen. Umiddelbart efter melanomcelleinokulationen observeres dyrets injicerede øje ved OCT-scanninger.Baseret på scanningerne klassificeres retinal løsrivelse eller RD-mønstre i henhold til tre kategorier lokal RD, lækage i glaslegemet eller udvidet RD. Åbn en OCT-segmenteringsanalysesoftware for at forudsige tumorstørrelsen baseret på RD-højde. Mål højden af lokal RD i OCT-scanningerne, og klassificer dem i tre grupper. I den postoperative fase påføres 0,3% Ofloxacin topisk.Den OCT-baserede forudsigelse af tumorvækst efter subchoroidal celleinjektion er afbildet i denne figur. Musene udviste tre mønstre af RD, Focal, Leakage To The Vitreous og Extended RD. Der var en sammenhæng mellem mønsteret af RD umiddelbart efter injektion og lokaliseringen af tumorerne fem dage efter injektion. Fokal RD var forbundet med tumorcellevæksten, der var begrænset til choroid.Imidlertid indikerede observation af celler i glaslegemet efter injektion hos dyr, der viste fokal RD, tumorvækst i vitrealhulen og choroid. når udvidet RD blev observeret efter injektion, blev tumorer spredt gennem choroid og glaslegeme efter fem dage. Udvalget af tumorstørrelser induceret i denne model kan opdeles i små, mellemstore og store.Her vises repræsentative billeder af OCT-målingen af RD-højde efter injektion og det tilsvarende fundusbillede, en vandret OCT-scanning af tumorhøjden og -bredden på dag fem efter injektion og dets tilsvarende fundusbillede og det tilsvarende H&E-farvede øjenafsnit, der viser sammenlignelige tumormålinger. Tumorvolumenmålinger af mus, der præsenterede små, mellemstore eller store RD umiddelbart efter celleinjektion, præsenteres her. Justering af injektionskraften kan påvirke tumorstørrelse og placering.Det er vigtigt at kalibrere dette og evaluere mønstret for induceret nethindeløsning ved OCT efter injektion. Live imaging af choroidale tumorer er et vigtigt eksperimentelt værktøj, der gør det muligt at undersøge effekten af forskellige faktorer eller potentielle terapier på tumorprogression.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En mus Model af træthed induceret af perifere Bestråling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Udnyttelse af ultralyd guidede væv-instrueret cellulære Implantation for etablering af biologisk relevante metastatisk Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Berigelse og karakterisering af Tumor immun- og ikke-immune Microenvironments i etablerede subkutane Murine tumorer

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvågning af tre-dimensionelle Tumor Spheroids bruge optisk kohærens tomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Hurtig generering af primære murine melanocyte og fibroblast kulturer

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Rumlig og tidsmæssig kontrol af murine melanom initiering fra mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

Generation af en lever Orthotopic humant Ukalvekød melanom xenograft platform i immundefekt mus

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultralyd-guidet Ortotopisk implantation af murin Pankreatisk ductal adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering af onkogene transformation i humane mammary epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modellering af hjernemetastase via haleveneinjektion af inflammatoriske brystkræftceller

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...