Name: implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid via optical coherence tomography
Uploaded: 2022-12-02T14:10:00
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Cette étude a été financée en partie par la subvention 1304/20 de la Fondation israélienne pour la science (ISF), Israël, pour Arie Marcovich. Nous remercions Shahar Ish-Shalom et Ady Yosipovich, du département de pathologie du Kaplan Medical Center, Rehovot, Israël, pour l’analyse histologique.

Les expériences du protocole ont été approuvées par le Conseil national israélien de l’expérimentation animale et sont conformes à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Des souris C57BL/6 femelles, âgées de 8 à 10 semaines, ont été utilisées pour la présente étude et ont été exposées à des cycles lumière-obscurité de 12/12 h. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).</...

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	<li>Jager, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+melanoma.">Uveal melanoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 6 (1), 1-25 (2020).</li><li>Bustamante, P., Piquet, L., Landreville, S., Burnier, J. 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A survey by the European Ophthalmic Oncology Group.</a> American Journal of Ophthalmology. 202, 100-108 (2019).</li><li>Cao, J., Jager, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+eye+models+for+uveal+melanoma.">Animal eye models for uveal melanoma.</a> Ocular Oncology and Pathology. 1 (3), 141-150 (2015).</li><li>Uner, O. E., Gandrakota, N., Azarcon, C. P., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+uveal+melanoma.">Animal models of uveal melanoma.</a> Annals of Eye Science. 7, 21-30 (2022).</li><li>Yang, H., Dithmar, S., Grossniklaus, H. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunologic+and+anti-angiogenic+therapy+reduces+hepatic+micrometastases+in+a+murine+ocular+melanoma+model.">Combined immunologic and anti-angiogenic therapy reduces hepatic micrometastases in a murine ocular melanoma model.</a> Current Eye Research. 31 (6), 557-562 (2006).</li><li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+liver+metastasis.">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion &amp; Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li><li>Diaz, C. E., Rusciano, D., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16LS9+melanoma+cells+spread+to+the+liver+from+the+murine+ocular+posterior+compartment+(PC).">B16LS9 melanoma cells spread to the liver from the murine ocular posterior compartment (PC).</a> Current Eye Research. 18 (2), 125-129 (1999).</li><li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+liver+metastasis.">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion &amp; Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li><li>Ashur-Fabian, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrac+delayed+the+onset+of+ocular+melanoma+in+an+orthotopic+mouse+model.">Tetrac delayed the onset of ocular melanoma in an orthotopic mouse model.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 632335 (2019).</li><li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+c-met+overexpression+in+liver-metastatic+B16-LS9+melanoma+cells.">Mechanisms regulating c-met overexpression in liver-metastatic B16-LS9 melanoma cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 81 (3), 477-487 (2001).</li><li>Harning, R., Szalay, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+metastasis+of+in+vivo+and+in+vitro+derived+syngeneic+murine+melanoma.">Ocular metastasis of in vivo and in vitro derived syngeneic murine melanoma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 28 (9), 1599-1604 (1987).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Notting, I. 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Le mélanome uvéal est une maladie dévastatrice pour laquelle de nouvelles approches thérapeutiques sont grandement nécessaires. Cependant, la recherche sur le mélanome uvéal et les traitements potentiels est limitée par les défis techniques des modèles animaux de mélanome uvéal 1,25. Les tumeurs oculaires, qui sont induites par injection intraoculaire de cellules cancéreuses, sont très variables à la fois dans la localisation et la taille, probable...

Le mélanome uvéal (UM) est la tumeur maligne primitive intraoculaire la plus fréquente chez l’adulte. Environ 90 % des mélanomes oculaires proviennent de mélanocytes de la région choroïde du tractus uvéal1. L’UM est une cause majeure de morbidité et de mortalité, car on estime que près de 50% des patients développent une maladie métastatique, le foie étant le principal site de métastases2. Un traitement précoce des lésions primaires peut réduire le risque de métastases, mais aucun traitement efficace n’empêche la formation de métastases3.
Le traitement standard du mélanome uvéal comprend l’irradiation, qui est associée à une perte de vision due à la neuropathie optique, à la rétinopathie, au syndrome de l’œil sec et à la cataracte. La résection chirurgicale est généralement retardée jusqu’à ce que la croissance de la lésion soit reconnue et caractérisée. Cependant, un tel délai peut permettre le développement d’une maladie métastatique4. Dans certains cas, une énucléation futile est nécessaire. Bien sûr, cette procédure radicale compromet la vision et entraîne une détérioration esthétique dramatique.
De nombreux efforts ont été consacrés au développement de modèles expérimentaux pour étudier le mélanome uvéal. Les modèles animaux précliniques qui permettent une évaluation précise de cette malignité sont essentiels pour étudier de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques pour le mélanome uvéal. Les modèles animaux expérimentaux de mélanome oculaire sont principalement basés sur l’inoculation de cellules tumorales chez la souris, le rat et le lapin 5,6. Les modèles murins sont rentables et largement utilisés pour les études sur le mélanome en raison de leur taux de reproduction rapide et de leur grande similitude génomique avec les humains. La lignée cellulaire de mélanome cutané murin B16 est couramment utilisée pour inoculer des souris C57BL6 et induire des tumeurs syngéniques. Lors de l’utilisation de ce modèle pour induire un mélanome uvéal, les yeux porteurs de tumeurs doivent généralement être énucléés 7 à 14 jours après l’inoculation. De plus, la vitamine B16 est un modèle très invasif. La nature immuno-privilégiée de l’œil favorise les métastases, et les métastases peuvent généralement être détectées 3-4 semaines après l’inoculation des cellules tumorales. Les sous-cultures de la ligne B16 originale présentent des propriétés métastatiques distinctes6. Par exemple, la lignée du mélanome du Queens a un taux métastatique élevéde 7,8. La lignée cellulaire B16LS9 a une morphologie cellulaire dendritique et a été dérivée de métastases hépatiques de souris C57BL/6 injectées avec la lignée parentale de mélanome cutané B16F19. Lorsqu’elles ont été injectées dans le compartiment postérieur de l’œil, il a été démontré que ces cellules formaient des tumeurs intraoculaires, qui ressemblent histologiquement au mélanome uvéal humain et forment des métastases spécifiques au foie chez les souris C57BL / 6, mais pas Balb / C10,11,12. Génétiquement, les cellules sont caractérisées par une expression plus élevée du proto-oncogène c-met, qui agit comme un récepteur cellulaire du facteur de croissance des hépatocytes13. En revanche, B16F10, le 10epassage de la B16 parentale, métastase principalement aux poumons lorsqu’elle est inoculée par voie intraoculaire14. B16F10 et B16LS9 sont pigmentés12.
Plusieurs défis clés limitent le succès des modèles murins de mélanome uvéal. Tout d’abord, le reflux des cellules tumorales peut conduire à un mélanome extraoculaire ou sous-conjonctival. Deuxièmement, la croissance tumorale après inoculation intraoculaire des cellules de mélanome est souvent très variable, ce qui pose des difficultés dans l’évaluation du traitement et des progrès. Une autre difficulté majeure est la capacité limitée à suivre la croissance tumorale in vivo. Bien que l’imagerie bioluminescente, telle que celle des tumeurs exprimant la luciférase, soit couramment utilisée pour surveiller la croissance tumoraleoculaire 15,16, elle ne peut pas fournir d’informations sur l’emplacement intraoculaire de la tumeur. Par conséquent, l’évaluation de la tumeur est généralement réalisée après énucléation de l’œil10,17. Cela limite considérablement la capacité de caractériser la progression tumorale et la réponse aux traitements de manière approfondie. Un autre obstacle majeur dans l’étude du mélanome uvéal est la difficulté de surveiller les lésions chez les souris pigmentées. De nouvelles approches, qui surmontent ces difficultés, sont nécessaires pour promouvoir la recherche sur le mélanome uvéal dans les modèles animaux.
La tomographie par cohérence optique (TCO) offre des capacités distinctives pour imager profondément dans les différentes sections de l’œil en haute résolution, ce qui est inégalé par d’autres méthodologies, y compris l’échographie18,19. L’imagerie OCT a été utilisée dans des modèles animaux pour étudier diverses maladies oculaires20. Récemment, l’imagerie OCT a été démontrée comme moyen non invasif d’évaluer la croissance tumorale intraoculaire21. Le protocole décrit ici décrit l’implantation de cellules de mélanome dans la choroïde murine et l’utilisation de l’OCT pour prédire la localisation et la taille de la tumeur intraoculaire au moment de l’inoculation cellulaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &#956;L glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>721711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needles</td>
			<td>BD Microbalance</td>
			<td>2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Orion Phrma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16LS9 cells</td>
			<td>from Hans Grossniklaus USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine&#160;</td>
			<td>richter pharma</td>
			<td>102047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 female mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential vitamin mixture</td>
			<td>satorius</td>
			<td>01-025-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>rhenium</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>390862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight OCT segmentation software&#160;</td>
			<td>Phoenix Micron, Inc&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>bremer pharma GMBH (medimarket)</td>
			<td>17889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine&#160;</td>
			<td>zoetis (vetmarket)</td>
			<td>102532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin 0.3% eye drops</td>
			<td>allergan</td>
			<td>E92170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical coherence tomography&#160;</td>
			<td>Phoenix Micron, Inc&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxybuprocaine 0.4%</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>393050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-amphoteracin</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)&#160;</td>
			<td>satorius</td>
			<td>02-023-1a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI cell media</td>
			<td>satorius</td>
			<td>01-104-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>OPMI-6 CFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>390723</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid via optical coherence tomography

L’établissement de modèles expérimentaux de mélanome choroïdien est difficile en termes de capacité à induire des tumeurs à la localisation correcte. De plus, les difficultés à observer le mélanome choroïdien postérieur in vivo limitent l’emplacement de la tumeur et l’évaluation de la croissance en temps réel. L’approche décrite ici optimise les techniques d’établissement du mélanome choroïdien chez la souris via une procédure d’injection de cellules sous-choroïdiennes B16LS9 en plusieurs étapes. Pour permettre une injection précise dans les petites dimensions de l’uvée de la souris, la procédure complète est réalisée au microscope. Tout d’abord, une péritomie conjonctivale se forme dans la région dorso-temporale de l’œil. Ensuite, un tractus dans l’espace sous-choroïdien est créé en insérant une aiguille à travers la sclérotique exposée. Ceci est suivi par l’insertion d’une aiguille émoussée dans le tractus et l’injection de cellules de mélanome dans la choroïde. Immédiatement après l’injection, l’imagerie non invasive par tomographie par cohérence optique (OCT) est utilisée pour déterminer l’emplacement et la progression de la tumeur. Le décollement de la rétine est évalué comme un prédicteur du site et de la taille de la tumeur. La méthode présentée permet l’induction reproductible du mélanome localisé choroïde chez la souris et l’imagerie en direct de l’évaluation de la croissance tumorale. En tant que tel, il fournit un outil précieux pour l’étude des tumeurs intraoculaires.

Les yeux ont été examinés par OCT immédiatement après l’injection des cellules B16LS9. Un décollement local de la rétine a été observé après l’injection. Les souris présentaient trois modèles de DR : focale (Figure 2, panneau supérieur), fuite vers le vitré (Figure 2, panneau du milieu) et DR étendue (Figure 2, panneau inférieur). La DR prolongée est probablement causée par des dommages causés par l?...

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Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Le présent protocole décrit l’implantation et l’évaluation du mélanome dans la choroïde murine à l’aide de la tomographie par cohérence optique.

Implantation et évaluation du mélanome dans la choroïde murine par tomographie par cohérence optique

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Établir des tumeurs comme la partie postérieure de l’œil est difficile. Cette méthode permet l’induction de tumeurs reproductibles du mélanome choroïdien chez la souris et l’imagerie en direct de la croissance tumorale pour évaluation. Ce protocole utilise l’imagerie en direct OCT pour évaluer l’emplacement des tumeurs déjà au moment de l’inoculation des cellules tumorales et pour suivre la croissance tumorale chez les animaux vivants.Le mélanome uvéal est une maladie dévastatrice avec un taux de métastases de près de 50%. Le développement de modèles expérimentaux est essentiel pour faire avancer la recherche visant de nouvelles possibilités thérapeutiques. Un avantage de cette méthode est que l’évaluation immédiate du succès de l’injection permet d’atteindre des groupes d’étude avec des tumeurs homogènes et de les suivre en continu par imagerie en direct.Examiner la progression tumorale. L’injection dans les yeux de la petite souris nécessite de la pratique. La possibilité de visualiser les cellules injectées vous permet d’évaluer votre succès immédiatement et de répéter avec plus de souris si nécessaire.La démonstration de la procédure sera le Dr Dimitri Gaber du laboratoire de recherche en ophtalmologie du centre médical Kaplan. Pour commencer, appliquez un anesthésique ophtalmique topique à 0,4%, Oxybuprocaïne, sur les deux yeux de la souris anesthésiée. Ensuite, appliquez localement 0,5% de tropicamide sur les deux yeux pour dilater les pupilles, suivi de 1,4% d’hydroxyéthylcellulose comme lubrifiant pour éviter le dessèchement des yeux.Observez un œil de la souris sous un microscope opératoire. Tenez les paupières ouvertes avec des pinces intraoculaires stériles. Tenez ensuite les limbes-conjonctives temporales supérieures et tirez vers une position infranasale.Sécurisez cette position en maintenant les limbes-conjonctives tout au long de la procédure. À l’aide d’une pointe d’aiguille de calibre 30, faites une petite péritomie conjonctivale dans la région temporale dorsale d’environ un à deux millimètres en arrière du limbe. Retirez l’excès de capsule tendineuse de l’ouverture de la péritomie.Insérez la pointe de l’aiguille pour pénétrer dans la sclérotique en créant une trace dans l’espace sous-choroïdien jusqu’à ce que la couleur brune de la choroïde apparaisse à travers la substance blanche exposée de la sclérotique. Chargez les cellules dans une seringue Hamilton en verre stérile de 10 microlitres montée avec une aiguille émoussée de calibre 32 torsadée à un angle de 45 degrés. Insérez l’aiguille de la seringue chargée d’environ deux millimètres dans le tractus créé et injectez deux microlitres de la suspension cellulaire.Maintenez l’aiguille en place après l’injection pendant deux à trois secondes jusqu’à ce que tout le liquide se soit dissipé. Retirez l’aiguille en la tirant doucement pour éviter les fuites du tractus. Immédiatement après l’inoculation des cellules de mélanome, observer l’œil injecté de l’animal par des tomodensitogrammes.Sur la base des scans, classez le décollement de la rétine ou les modèles RD selon trois catégories RD local, fuite dans le vitreux ou RD étendu. Ouvrez un logiciel d’analyse de segmentation OCT pour prédire la taille de la tumeur en fonction de la hauteur RD. Mesurez la hauteur de la RD locale dans les scans de l’OPO et classez-les en trois groupes. Dans la phase postopératoire, appliquer 0,3% d’ofloxacine par voie topique.La prédiction de la croissance tumorale basée sur l’OCT après l’injection de cellules sous-choroïdiennes est représentée dans cette figure. Les souris présentaient trois modèles de RD, Focal, Leakage To The Vitreous et Extended RD. Il y avait une association entre le schéma de RD immédiatement après l’injection et la localisation des tumeurs cinq jours après l’injection. La RD focale était associée à la croissance des cellules tumorales limitée à la choroïde.Cependant, l’observation de cellules dans le vitré après injection chez des animaux présentant une DR focale a indiqué une croissance tumorale dans la cavité vitréenne et la choroïde. lorsque la RD étendue a été observée après l’injection, les tumeurs ont été dispersées dans toute la choroïde et le vitré après cinq jours. La gamme de tailles de tumeurs induites dans ce modèle peut être divisée en petite, moyenne et grande.On voit ici des images représentatives de la mesure OCT de la hauteur DR après injection, et l’image du fond d’œil correspondant, un scan OCT horizontal de la hauteur et de la largeur de la tumeur le cinquième jour après l’injection, et son image du fond d’œil correspondant, et la section oculaire colorée H & E correspondante démontrant des mesures tumorales comparables. Les mesures du volume tumoral de souris qui ont présenté une RD petite, moyenne ou grande immédiatement après l’injection cellulaire sont présentées ici. L’ajustement de la force d’injection peut affecter la taille et l’emplacement de la tumeur.Il est important de calibrer cela et d’évaluer le schéma de décollement induit de la rétine par OCT après injection. L’imagerie en direct des tumeurs choroïdiennes est un outil expérimental important qui permet d’examiner l’effet de différents facteurs ou thérapies potentielles sur la progression tumorale.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Un modèle de souris de la fatigue induite par périphérique Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

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Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

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