Name: implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid via optical coherence tomography
Uploaded: 2022-12-02T14:10:00
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Diese Studie wurde zum Teil durch das Stipendium 1304/20 der Israel Science Foundation (ISF), Israel, für Arie Marcovich unterstützt. Wir danken Shahar Ish-Shalom und Ady Yosipovich von der Abteilung für Pathologie des Kaplan Medical Center, Rehovot, Israel, für die histologische Analyse.

Die Experimente im Protokoll wurden vom israelischen Nationalen Rat für Tierversuche genehmigt und entsprechen der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-10 Wochen wurden für die vorliegende Studie verwendet und 12/12 h Hell-Dunkel-Zyklen ausgesetzt. Die Tiere stammen aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle).
1. Zellkultur
<ol><li>Kultivieren Sie B16LS9-Zellen in ...

<ol>
	<li>Jager, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+melanoma.">Uveal melanoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 6 (1), 1-25 (2020).</li><li>Bustamante, P., Piquet, L., Landreville, S., Burnier, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+melanoma+pathobiology:+Metastasis+to+the+liver.">Uveal melanoma pathobiology: Metastasis to the liver.</a> Seminars in Cancer Biology. 71, 65-85 (2021).</li><li>Damato, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+treatment+of+choroidal+melanoma+in+relation+to+the+prevention+of+metastatic+death-A+personal+view.">Ocular treatment of choroidal melanoma in relation to the prevention of metastatic death-A personal view.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 66, 187-199 (2018).</li><li>Jouhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+fatal+choroidal+melanoma+study.+A+survey+by+the+European+Ophthalmic+Oncology+Group.">The small fatal choroidal melanoma study. A survey by the European Ophthalmic Oncology Group.</a> American Journal of Ophthalmology. 202, 100-108 (2019).</li><li>Cao, J., Jager, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+eye+models+for+uveal+melanoma.">Animal eye models for uveal melanoma.</a> Ocular Oncology and Pathology. 1 (3), 141-150 (2015).</li><li>Uner, O. E., Gandrakota, N., Azarcon, C. P., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+uveal+melanoma.">Animal models of uveal melanoma.</a> Annals of Eye Science. 7, 21-30 (2022).</li><li>Yang, H., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+2b+decreases+hepatic+micrometastasis+in+a+murine+model+of+ocular+melanoma+by+activation+of+intrinsic+hepatic+natural+killer+cells.">Interferon alpha 2b decreases hepatic micrometastasis in a murine model of ocular melanoma by activation of intrinsic hepatic natural killer cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (7), 2056-2064 (2004).</li><li>Yang, H., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunologic+and+anti-angiogenic+therapy+reduces+hepatic+micrometastases+in+a+murine+ocular+melanoma+model.">Combined immunologic and anti-angiogenic therapy reduces hepatic micrometastases in a murine ocular melanoma model.</a> Current Eye Research. 31 (6), 557-562 (2006).</li><li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+liver+metastasis.">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion &amp; Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li><li>Diaz, C. E., Rusciano, D., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16LS9+melanoma+cells+spread+to+the+liver+from+the+murine+ocular+posterior+compartment+(PC).">B16LS9 melanoma cells spread to the liver from the murine ocular posterior compartment (PC).</a> Current Eye Research. 18 (2), 125-129 (1999).</li><li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+liver+metastasis.">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion &amp; Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li><li>Ashur-Fabian, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrac+delayed+the+onset+of+ocular+melanoma+in+an+orthotopic+mouse+model.">Tetrac delayed the onset of ocular melanoma in an orthotopic mouse model.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 632335 (2019).</li><li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+c-met+overexpression+in+liver-metastatic+B16-LS9+melanoma+cells.">Mechanisms regulating c-met overexpression in liver-metastatic B16-LS9 melanoma cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 81 (3), 477-487 (2001).</li><li>Harning, R., Szalay, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+metastasis+of+in+vivo+and+in+vitro+derived+syngeneic+murine+melanoma.">Ocular metastasis of in vivo and in vitro derived syngeneic murine melanoma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 28 (9), 1599-1604 (1987).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Notting, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+bioluminescent+imaging+of+human+uveal+melanoma+in+a+new+mouse+model+of+local+tumor+growth+and+metastasis.">Whole-body bioluminescent imaging of human uveal melanoma in a new mouse model of local tumor growth and metastasis.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (5), 1581-1587 (2005).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+xenograft+murine+human+uveal+melanoma+model+develops+hepatic+micrometastases.">In-vivo xenograft murine human uveal melanoma model develops hepatic micrometastases.</a> Melanoma Research. 18 (2), 95-103 (2008).</li><li>Murthy, R. K., Haji, S., Sambhav, K., Grover, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+retinal+diseases.">Clinical applications of spectral domain optical coherence tomography in retinal diseases.</a> Biomedical Journal. 39 (2), 107-120 (2016).</li><li>Drexler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-resolution+ophthalmic+optical+coherence+tomography.">Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography.</a> Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).</li><li>Ochakovski, G. A., Fischer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+of+mouse+models+with+OCT.">Phenotyping of mouse models with OCT.</a> Methods in Molecular Biology. 1834, 285-291 (2019).</li><li>Zaks, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+imaging+for+assessing+tumor+growth+in+mouse+models+of+ocular+melanoma.">In-vivo imaging for assessing tumor growth in mouse models of ocular melanoma.</a> Experimental Eye Research. 204, 108431 (2021).</li><li>Brar, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Academy+of+Ophthalmology+2022-2023+BCSC.+2.">American Academy of Ophthalmology 2022-2023 BCSC. 2.</a> Fundamentals and principles of ophthalmology. , (2022).</li><li>Duker, J. 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Das Uvealmelanom ist eine verheerende Erkrankung, für die neue Therapieansätze dringend benötigt werden. Die Forschung zum Aderhautmelanom und zu möglichen Therapien ist jedoch durch die technischen Herausforderungen von Aderhautmelanom-Tiermodellen begrenzt 1,25. Augentumoren, die durch intraokulare Injektion von Krebszellen induziert werden, sind sowohl in ihrer Lokalisation als auch in ihrer Größe sehr variabel, was wahrscheinlich auf die geringen Abmess...

Das Uvealmelanom (UM) ist die häufigste intraokulare primäre Malignität bei Erwachsenen. Etwa 90 % der okulären Melanome stammen von Melanozyten in der Aderhautregion des Adergangs1. UM ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität, da schätzungsweise fast 50 % der Patienten eine metastasierende Erkrankung entwickeln, wobei die Leber der Hauptort der Metastasierungist 2. Eine frühzeitige Behandlung von primären Läsionen kann die Wahrscheinlichkeit von Metastasen verringern, aber keine wirksame Behandlung verhindert die Bildung von Metastasen3.
Die Standardbehandlung des Aderhautmelanoms umfasst die Strahlentherapie, die mit dem Verlust des Sehvermögens aufgrund von Optikusneuropathie, Retinopathie, Syndrom des trockenen Auges und Katarakt verbunden ist. Die chirurgische Resektion wird in der Regel verzögert, bis das Wachstum der Läsion erkannt und charakterisiert ist. Eine solche Verzögerung kann jedoch die Entwicklung von Metastasen ermöglichen4. In einigen Fällen ist eine vergebliche Enukleation erforderlich. Natürlich beeinträchtigt dieser radikale Eingriff das Sehvermögen und führt zu einer dramatischen ästhetischen Verschlechterung.
Es wurden viele Anstrengungen unternommen, um experimentelle Modelle zur Untersuchung des Aderhautmelanoms zu entwickeln. Präklinische Tiermodelle, die eine genaue Beurteilung dieser Malignität ermöglichen, sind der Schlüssel zur Erforschung neuer diagnostischer und therapeutischer Strategien für das Aderhautmelanom. Experimentelle Tiermodelle des okulären Melanoms basieren hauptsächlich auf der Inokulation von Tumorzellen bei Mäusen, Ratten und Kaninchen 5,6. Mausmodelle sind kostengünstig und werden aufgrund ihrer schnellen Reproduktionsrate und der hohen Genomähnlichkeit zum Menschen häufig für Melanomstudien verwendet. Die murine kutane Melanomzelllinie B16 wird häufig zur Inokulation von C57BL6-Mäusen und zur Induktion syngener Tumore verwendet. Bei Verwendung dieses Modells zur Induktion eines Aderhautmelanoms müssen tumortragende Augen in der Regel 7-14 Tage nach der Inokulation enukleiert werden. Darüber hinaus ist B16 ein hochinvasives Modell. Die immunprivilegierte Natur des Auges begünstigt die Metastasierung, und Metastasen können in der Regel 3-4 Wochen nach der Inokulation der Tumorzellen entdeckt werden. Subkulturen der ursprünglichen B16-Linie weisen ausgeprägte metastatische Eigenschaftenauf 6. Zum Beispiel hat die Queens-Melanomlinie eine hohe Metastasierungsratevon 7,8. Die B16LS9-Zelllinie weist eine dendritische Zellmorphologie auf und wurde aus Lebermetastasen von C57BL/6-Mäusen gewonnen, denen die elterliche kutane Melanomlinie B16F19 injiziert wurde. Bei der Injektion in das hintere Kompartiment des Auges bildeten diese Zellen intraokulare Tumore, die histologisch dem humanen Aderhautmelanom ähneln und leberspezifische Metastasen in C57BL/6, aber nicht in Balb/C, Mäusen bilden10,11,12. Genetisch sind die Zellen durch eine höhere Expression des c-met-Proto-Onkogens gekennzeichnet, das als zellulärer Rezeptor für den Hepatozyten-Wachstumsfaktor13 fungiert. Im Gegensatz dazu metastasiert B16F10, die 10. Passage des elterlichen B16, bei intraokularer Inokulation hauptsächlich in die Lunge14. Sowohl B16F10 als auch B16LS9 sind pigmentiert12.
Mehrere zentrale Herausforderungen schränken den Erfolg von murinen Aderhautmelanommodellen ein. Erstens kann ein Tumorzellreflux zu einem extraokularen oder subkonjunktivalen Melanom führen. Zweitens ist das Tumorwachstum nach intraokularer Inokulation von Melanomzellen oft sehr variabel, was die Beurteilung der Behandlung und des Fortschritts erschwert. Eine weitere große Schwierigkeit ist die eingeschränkte Fähigkeit, das Tumorwachstum in vivo zu verfolgen. Während die biolumineszente Bildgebung, z. B. von Luciferase-exprimierenden Tumoren, häufig zur Überwachung des okulären Tumorwachstums verwendet wird15,16, kann sie keine Informationen über die intraokulare Lage des Tumors liefern. Daher wird die Beurteilung des Tumors in der Regel nach der Enukleation des Auges durchgeführt10,17. Dies schränkt die Fähigkeit, die Tumorprogression und das Ansprechen auf Behandlungen umfassend zu charakterisieren, stark ein. Eine weitere große Hürde bei der Untersuchung des Aderhautmelanoms ist die Schwierigkeit, Läsionen bei pigmentierten Mäusen zu überwachen. Neue Ansätze, die diese Schwierigkeiten überwinden, sind erforderlich, um die Erforschung des Aderhautmelanoms im Tiermodell voranzutreiben.
Die optische Kohärenztomographie (OCT) bietet einzigartige Möglichkeiten, in hoher Auflösung tief in die verschiedenen Bereiche des Auges einzudringen, was von anderen Methoden, einschließlich Ultraschall, nicht erreichtwird 18,19. Die OCT-Bildgebung wurde in Tiermodellen verwendet, um verschiedene Augenerkrankungen zu untersuchen20. Kürzlich wurde die OCT-Bildgebung als nicht-invasives Mittel zur Beurteilung des intraokularen Tumorwachstums demonstriert21. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Implantation von Melanomzellen in die murine Aderhaut und die Verwendung der OCT zur Vorhersage der intraokularen Tumorlokalisation und -größe zum Zeitpunkt der Zellinokulation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &#956;L glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>721711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needles</td>
			<td>BD Microbalance</td>
			<td>2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Orion Phrma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16LS9 cells</td>
			<td>from Hans Grossniklaus USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine&#160;</td>
			<td>richter pharma</td>
			<td>102047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 female mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential vitamin mixture</td>
			<td>satorius</td>
			<td>01-025-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>rhenium</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>390862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight OCT segmentation software&#160;</td>
			<td>Phoenix Micron, Inc&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>bremer pharma GMBH (medimarket)</td>
			<td>17889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine&#160;</td>
			<td>zoetis (vetmarket)</td>
			<td>102532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin 0.3% eye drops</td>
			<td>allergan</td>
			<td>E92170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical coherence tomography&#160;</td>
			<td>Phoenix Micron, Inc&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxybuprocaine 0.4%</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>393050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-amphoteracin</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)&#160;</td>
			<td>satorius</td>
			<td>02-023-1a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI cell media</td>
			<td>satorius</td>
			<td>01-104-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>OPMI-6 CFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>390723</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid via optical coherence tomography

Die Etablierung experimenteller Aderhautmelanommodelle ist eine Herausforderung in Bezug auf die Fähigkeit, Tumore an der richtigen Lokalisation zu induzieren. Darüber hinaus schränken Schwierigkeiten bei der Beobachtung des Melanoms der hinteren Aderhaut in vivo die Tumorlokalisation und die Wachstumsbewertung in Echtzeit ein. Der hier beschriebene Ansatz optimiert Techniken zur Etablierung eines Aderhautmelanoms bei Mäusen durch ein mehrstufiges subchoroidales B16LS9-Zellinjektionsverfahren. Um eine präzise Injektion in die kleinen Abmessungen der Maus zu ermöglichen, wird der gesamte Eingriff unter dem Mikroskop durchgeführt. Zunächst wird eine konjunktivale Peritomie im dorsal-temporalen Bereich des Auges gebildet. Dann wird ein Trakt in den subchoroidalen Raum geschaffen, indem eine Nadel durch die freiliegende Lederhaut eingeführt wird. Es folgt das Einstechen einer stumpfen Nadel in den Trakt und die Injektion von Melanomzellen in die Aderhaut. Unmittelbar nach der Injektion wird eine nichtinvasive optische Kohärenztomografie (OCT) eingesetzt, um die Lokalisation und das Fortschreiten des Tumors zu bestimmen. Die Netzhautablösung wird als Prädiktor für die Lokalisation und Größe des Tumors ausgewertet. Die vorgestellte Methode ermöglicht die reproduzierbare Induktion von Aderhaut-lokalisierten Melanomen bei Mäusen und die Live-Bildgebung der Tumorwachstumsauswertung. Als solches bietet es ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von intraokularen Tumoren.

Die Augen wurden unmittelbar nach Injektion der B16LS9-Zellen mittels OCT untersucht. Nach der Injektion wurde eine lokale Netzhautablösung beobachtet. Die Mäuse zeigten drei RD-Muster: fokale (Abbildung 2, oberes Bild), Leckage in den Glaskörper (Abbildung 2, mittleres Bild) und erweiterte RD (Abbildung 2, unteres Bild). Eine verlängerte RD wird wahrscheinlich durch eine Schädigung durch die Injektion verursacht. Es b...

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Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Implantation und Beurteilung des Melanoms in der murinen Aderhaut mittels optischer Kohärenztomographie.

Implantation und Beurteilung des Melanoms in der Aderhaut der Maus mittels optischer Kohärenztomographie

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Die Etablierung von Tumoren im hinteren Teil des Auges ist eine Herausforderung. Diese Methode ermöglicht die Induktion von reproduzierbaren Aderhautmelanomtumoren bei Mäusen und die Live-Bildgebung des Tumorwachstums zur Auswertung. Dieses Protokoll nutzt die OCT-Live-Bildgebung, um die Lage der Tumore bereits zum Zeitpunkt der Inokulation der Tumorzellen zu beurteilen und das Tumorwachstum bei lebenden Tieren zu verfolgen.Das Uvealmelanom ist eine verheerende Erkrankung mit einer Metastasierungsrate von fast 50 %. Die Entwicklung experimenteller Modelle ist der Schlüssel zur Weiterentwicklung der Forschung, die auf neue therapeutische Möglichkeiten abzielt. Ein Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die unmittelbare Beurteilung des Injektionserfolgs es ermöglicht, Studiengruppen mit homogenen Tumoren zu erreichen und diese kontinuierlich per Live-Bildgebung zu verfolgen.Zur Untersuchung der Tumorprogression. Die Injektion in die Augen der kleinen Maus erfordert Übung. Die Möglichkeit, die injizierten Zellen zu visualisieren, ermöglicht es Ihnen, Ihren Erfolg sofort zu beurteilen und bei Bedarf mit weiteren Mäusen zu wiederholen.Das Verfahren wird von Dr. Dimitri Gaber vom Ophthalmology Research Laboratory des Kaplan Medical Center demonstriert. Tragen Sie zunächst ein 0,4%iges ophthalmologisches Anästhetikum, Oxybuprocain, auf beide Augen der anästhesierten Maus auf. Tragen Sie dann äußerlich 0,5 % Tropicamid auf beide Augen auf, um die Pupillen zu erweitern, gefolgt von 1,4 % Hydroxyethylcellulose als Gleitmittel, um ein Austrocknen der Augen zu vermeiden.Beobachten Sie ein Auge der Maus unter einem Operationsmikroskop. Halten Sie die Augenlider mit einer sterilen Augenzange offen. Halten Sie dann die obere temporale Limbo-Konjunktiva und ziehen Sie sie in eine infranasale Position.Sichern Sie diese Position, indem Sie die Schwebebindehaut während des gesamten Eingriffs halten. Führen Sie mit einer 30-Gauge-Nadelspitze eine kleine konjunktivale Peritomie im dorsalen Schläfenbereich etwa ein bis zwei Millimeter hinter dem Limbus durch. Entfernen Sie die überschüssige Sehnenkapsel aus der Öffnung der Peritomie.Führen Sie die Nadelspitze ein, um in die Sklera einzudringen, und erzeugen Sie eine Spur in den subchoroidalen Raum, bis die braune Farbe der Aderhaut durch die freiliegende weiße Substanz der Sklera erscheint. Laden Sie die Zellen in eine sterile 10-Mikroliter-Glasspritze aus Hamilton, die mit einer stumpfen 32-Gauge-Nadel montiert ist, die in einem Winkel von 45 Grad gedreht ist. Führen Sie die Nadel der geladenen Spritze etwa zwei Millimeter in den erzeugten Trakt ein und injizieren Sie zwei Mikroliter der Zellsuspension.Halten Sie die Nadel nach der Injektion zwei bis drei Sekunden lang fest, bis die gesamte Flüssigkeit verschwunden ist. Entfernen Sie die Nadel, indem Sie sie vorsichtig herausziehen, um ein Auslaufen aus dem Trakt zu vermeiden. Unmittelbar nach der Inokulation der Melanomzellen wird das injizierte Auge des Tieres mittels OCT-Scans beobachtet.Klassifizieren Sie auf der Grundlage der Scans die Netzhautablösung oder die RD-Muster in drei Kategorien: lokale RD, Leckage in den Glaskörper oder erweiterte RD. Öffnen Sie eine OCT-Segmentierungsanalysesoftware, um die Tumorgröße basierend auf der RD-Höhe vorherzusagen. Messen Sie die Höhe der lokalen RD in den OCT-Scans und klassifizieren Sie sie in drei Gruppen. In der postoperativen Phase werden 0,3 % Ofloxacin topisch aufgetragen.Die OCT-basierte Vorhersage des Tumorwachstums nach subchoroidaler Zellinjektion ist in dieser Abbildung dargestellt. Die Mäuse zeigten drei Muster von RD, Focal, Leakage To The Glaskörper und Extended RD. Es bestand ein Zusammenhang zwischen dem Muster der RD unmittelbar nach der Injektion und der Lokalisation der Tumore fünf Tage nach der Injektion. Die fokale RD war mit dem Tumorzellwachstum assoziiert, das auf die Aderhaut beschränkt war.Die Beobachtung von Zellen im Glaskörper nach der Injektion bei Tieren mit fokaler RD deutete jedoch auf ein Tumorwachstum in der Glaskörperhöhle und der Aderhaut hin. Wenn nach der Injektion eine erweiterte RD beobachtet wurde, waren die Tumore nach fünf Tagen in der Aderhaut und im Glaskörper verteilt. Der Bereich der in diesem Modell induzierten Tumorgrößen kann in klein, mittel und groß unterteilt werden.Gezeigt werden repräsentative Bilder der OCT-Messung der RD-Höhe nach der Injektion und das entsprechende Fundusbild, ein horizontaler OCT-Scan der Tumorhöhe und -breite am fünften Tag nach der Injektion und das entsprechende Fundusbild sowie der entsprechende H&E-gefärbte Augenschnitt, der vergleichbare Tumormessungen zeigt. Tumorvolumenmessungen von Mäusen, die unmittelbar nach der Zellinjektion eine kleine, mittlere oder große RD aufwiesen, werden hier vorgestellt. Die Anpassung der Injektionskraft kann sich auf die Größe und Lokalisation des Tumors auswirken.Es ist wichtig, dies zu kalibrieren und das Muster der induzierten Netzhautablösung durch OCT nach der Injektion zu bewerten. Die Live-Bildgebung von Aderhauttumoren ist ein wichtiges experimentelles Werkzeug, das es ermöglicht, die Wirkung verschiedener Faktoren oder potenzieller Therapien auf die Tumorprogression zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Ein Maus-Modell der Fatigue, induziert durch Peripheral Bestrahlung

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Forschung

Krebsforschung

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Nutzung von Ultraschall geführte Gewebe gerichtet zellulären Implantation für die Einrichtung der biologisch relevanten metastasiertem Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Schnelle Generierung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Räumliche und zeitweilige Kontrolle der Murine Melanom-Initiation aus Mutant Melanocyte Stammzellen

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

Generierung einer Leber orthotopischen Human Enuveal Melanom Xenograft Plattform bei immundefizienten Mäusen

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultraschallgeführte orthotopische Implantation von murine Pankreas-Ductalsocarcinom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...