Name: implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid via optical coherence tomography
Uploaded: 2022-12-02T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography at JoVE.com

Este estudo foi parcialmente financiado pelo subsídio 1304/20 da Israel Science Foundation (ISF), Israel, para Arie Marcovich. Agradecemos a Shahar Ish-Shalom e Ady Yosipovich, do Departamento de Patologia do Kaplan Medical Center, Rehovot, Israel, pela análise histológica.

Os experimentos do protocolo foram aprovados pelo Conselho Nacional de Experimentação Animal de Israel e estão de acordo com a Declaração ARVO para uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e de Visão. Camundongos C57BL/6 fêmeas, com idade entre 8-10 semanas, foram utilizados para o presente estudo e foram expostos a ciclos claro-escuro de 12/12 h. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Cultura celular
<ol><li>Cultur...

<ol>
	<li>Jager, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+melanoma.">Uveal melanoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 6 (1), 1-25 (2020).</li><li>Bustamante, P., Piquet, L., Landreville, S., Burnier, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+melanoma+pathobiology:+Metastasis+to+the+liver.">Uveal melanoma pathobiology: Metastasis to the liver.</a> Seminars in Cancer Biology. 71, 65-85 (2021).</li><li>Damato, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+treatment+of+choroidal+melanoma+in+relation+to+the+prevention+of+metastatic+death-A+personal+view.">Ocular treatment of choroidal melanoma in relation to the prevention of metastatic death-A personal view.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 66, 187-199 (2018).</li><li>Jouhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+fatal+choroidal+melanoma+study.+A+survey+by+the+European+Ophthalmic+Oncology+Group.">The small fatal choroidal melanoma study. A survey by the European Ophthalmic Oncology Group.</a> American Journal of Ophthalmology. 202, 100-108 (2019).</li><li>Cao, J., Jager, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+eye+models+for+uveal+melanoma.">Animal eye models for uveal melanoma.</a> Ocular Oncology and Pathology. 1 (3), 141-150 (2015).</li><li>Uner, O. E., Gandrakota, N., Azarcon, C. P., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+uveal+melanoma.">Animal models of uveal melanoma.</a> Annals of Eye Science. 7, 21-30 (2022).</li><li>Yang, H., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+2b+decreases+hepatic+micrometastasis+in+a+murine+model+of+ocular+melanoma+by+activation+of+intrinsic+hepatic+natural+killer+cells.">Interferon alpha 2b decreases hepatic micrometastasis in a murine model of ocular melanoma by activation of intrinsic hepatic natural killer cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (7), 2056-2064 (2004).</li><li>Yang, H., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunologic+and+anti-angiogenic+therapy+reduces+hepatic+micrometastases+in+a+murine+ocular+melanoma+model.">Combined immunologic and anti-angiogenic therapy reduces hepatic micrometastases in a murine ocular melanoma model.</a> Current Eye Research. 31 (6), 557-562 (2006).</li><li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+liver+metastasis.">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion &amp; Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li><li>Diaz, C. E., Rusciano, D., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16LS9+melanoma+cells+spread+to+the+liver+from+the+murine+ocular+posterior+compartment+(PC).">B16LS9 melanoma cells spread to the liver from the murine ocular posterior compartment (PC).</a> Current Eye Research. 18 (2), 125-129 (1999).</li><li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+liver+metastasis.">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion &amp; Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li><li>Ashur-Fabian, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrac+delayed+the+onset+of+ocular+melanoma+in+an+orthotopic+mouse+model.">Tetrac delayed the onset of ocular melanoma in an orthotopic mouse model.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 632335 (2019).</li><li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+c-met+overexpression+in+liver-metastatic+B16-LS9+melanoma+cells.">Mechanisms regulating c-met overexpression in liver-metastatic B16-LS9 melanoma cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 81 (3), 477-487 (2001).</li><li>Harning, R., Szalay, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+metastasis+of+in+vivo+and+in+vitro+derived+syngeneic+murine+melanoma.">Ocular metastasis of in vivo and in vitro derived syngeneic murine melanoma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 28 (9), 1599-1604 (1987).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Notting, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+bioluminescent+imaging+of+human+uveal+melanoma+in+a+new+mouse+model+of+local+tumor+growth+and+metastasis.">Whole-body bioluminescent imaging of human uveal melanoma in a new mouse model of local tumor growth and metastasis.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (5), 1581-1587 (2005).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+xenograft+murine+human+uveal+melanoma+model+develops+hepatic+micrometastases.">In-vivo xenograft murine human uveal melanoma model develops hepatic micrometastases.</a> Melanoma Research. 18 (2), 95-103 (2008).</li><li>Murthy, R. K., Haji, S., Sambhav, K., Grover, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+retinal+diseases.">Clinical applications of spectral domain optical coherence tomography in retinal diseases.</a> Biomedical Journal. 39 (2), 107-120 (2016).</li><li>Drexler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-resolution+ophthalmic+optical+coherence+tomography.">Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography.</a> Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).</li><li>Ochakovski, G. A., Fischer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+of+mouse+models+with+OCT.">Phenotyping of mouse models with OCT.</a> Methods in Molecular Biology. 1834, 285-291 (2019).</li><li>Zaks, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+imaging+for+assessing+tumor+growth+in+mouse+models+of+ocular+melanoma.">In-vivo imaging for assessing tumor growth in mouse models of ocular melanoma.</a> Experimental Eye Research. 204, 108431 (2021).</li><li>Brar, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Academy+of+Ophthalmology+2022-2023+BCSC.+2.">American Academy of Ophthalmology 2022-2023 BCSC. 2.</a> Fundamentals and principles of ophthalmology. , (2022).</li><li>Duker, J. S., Waheed, N. K., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Retinal OCT: Optical Coherence Tomography, 2nd Edition. , (2021).</li><li>Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+subcutaneous+tumor+size+in+athymic+(nude)+mice.">Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).</li><li>Richards, J. R., Yoo, J. H., Shin, D., Odelberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+uveal+melanoma:+Strengths,+weaknesses,+and+future+directions.">Mouse models of uveal melanoma: Strengths, weaknesses, and future directions.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 33 (2), 264 (2020).</li><li>Chen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+molecular+imaging-escorted+adipose+photodynamic-browning+synergy+for+fighting+obesity+with+virus-like+complexes.">Photoacoustic molecular imaging-escorted adipose photodynamic-browning synergy for fighting obesity with virus-like complexes.</a> Nature Nanotechnology. 16 (4), 455-465 (2021).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+visualization+of+early+cancer+hepatic+micrometastasis+and+intraoperative+image-guided+surgery+by+photoacoustic+imaging.">Label-free visualization of early cancer hepatic micrometastasis and intraoperative image-guided surgery by photoacoustic imaging.</a> Journal of Nuclear Medicine. 61 (7), 1079-1085 (2020).</li></ol>

O melanoma uveal é uma doença devastadora para a qual novas abordagens terapêuticas são extremamente necessárias. No entanto, a pesquisa sobre melanoma uveal e potenciais tratamentos é limitada pelos desafios técnicos dos modelos animais de melanoma uveal 1,25. Os tumores oculares, que são induzidos pela injeção intraocular de células cancerosas, são altamente variáveis em localização e tamanho, provavelmente devido às pequenas dimensões do olho ...

O melanoma uveal (UMT) é a neoplasia maligna primária intraocular mais frequente em adultos. Aproximadamente 90% dos melanomas oculares originam-se de melanócitos da região coroide do trato uveal1. A UMTT é uma importante causa de morbidade e mortalidade, pois estima-se que cerca de 50% dos pacientes desenvolvam doença metastática, sendo o fígado o principal sítio de metástase2. O tratamento precoce das lesões primárias pode reduzir a chance de metástases, porém nenhum tratamento efetivo previne a formação de metástases3.
O tratamento padrão do melanoma uveal inclui terapia de irradiação, que está associada à perda da visão devido à neuropatia óptica, retinopatia, síndrome do olho seco e catarata. A ressecção cirúrgica é tipicamente retardada até que o crescimento da lesão seja reconhecido e caracterizado. No entanto, esse atraso pode permitir o desenvolvimento de doençametastática4. Em alguns casos, a enucleação fútil é necessária. É claro que esse procedimento radical compromete a visão e resulta em dramática deterioração estética.
Muitos esforços têm sido dedicados ao desenvolvimento de modelos experimentais para o estudo do melanoma uveal. Modelos animais pré-clínicos que permitam a avaliação precisa dessa malignidade são fundamentais para a investigação de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para o melanoma uveal. Modelos animais experimentais de melanoma ocular baseiam-se principalmente na inoculação de células tumorais em camundongos, ratos ecoelhos5,6. Modelos em camundongos são custo-efetivos e amplamente utilizados para estudos de melanoma devido à sua rápida taxa de reprodução e alta similaridade genômica com humanos. A linhagem celular de melanoma cutâneo murino B16 é comumente utilizada para inocular camundongos C57BL6 e induzir tumores singênicos. Ao usar esse modelo para induzir melanoma uveal, os olhos portadores de tumor normalmente precisam ser enucleados 7-14 dias após a inoculação. Além disso, o B16 é um modelo altamente invasivo. A natureza imunoprivilegiada do olho suporta metástases, e as metástases podem tipicamente ser detectadas 3-4 semanas após a inoculação de células tumorais. Subculturas da linhagem B16 original exibem propriedades metastáticas distintas6. Por exemplo, a linhagem de melanoma de Queens tem alta taxa de metástase7,8. A linhagem celular B16LS9 possui morfologia de células dendríticas e foi derivada de metástases hepáticas de camundongos C57BL/6 injetados com a linhagem de melanoma cutâneo parental B16F19. Quando injetadas no compartimento posterior do olho, essas células formaram tumores intraoculares, que histologicamente se assemelham ao melanoma uveal humano e formam metástases hepatoespecíficas em camundongos C57BL/6, mas não Balb/C10,11,12. Geneticamente, as células são caracterizadas por maior expressão do proto-oncogene c-met, que atua como receptor celular para o fator de crescimento de hepatócitos13. Em contraste, o B16F10, a10ª passagem do B16 parental, metastatiza primariamente para os pulmões quando inoculado intraocularmente14. Tanto o B16F10 quanto o B16LS9 são pigmentados12.
Vários desafios-chave limitam o sucesso de modelos de melanoma uveal murino. Primeiro, o refluxo de células tumorais pode levar a melanoma extraocular ou subconjuntival. Em segundo lugar, o crescimento tumoral após a inoculação intraocular de células de melanoma é frequentemente muito variável, dificultando a avaliação do tratamento e da evolução. Outra grande dificuldade é a capacidade limitada de acompanhar o crescimento tumoral in vivo. Embora imagens bioluminescentes, como a luciferase expressando tumores, sejam comumente usadas para monitorar o crescimento ocular do tumor15,16, elas não podem fornecer informações sobre a localização intraocular do tumor. Portanto, a avaliação do tumor é tipicamente realizada após a enucleação doolho10,17. Isso limita muito a capacidade de caracterizar a progressão tumoral e a resposta aos tratamentos extensivamente. Outro grande obstáculo no estudo do melanoma uveal é a dificuldade de monitoramento de lesões em camundongos pigmentados. Novas abordagens, que superem essas dificuldades, são necessárias para promover a pesquisa do melanoma uveal em modelos animais.
A tomografia de coerência óptica (OCT) fornece capacidades distintas para obter imagens profundas nas diferentes seções do olho em alta resolução, o que é incomparável com outras metodologias, incluindo a ultrassonografia18,19. A OCT tem sido utilizada em modelos animais para o estudo de diversas doenças oculares20. Recentemente, a OCT foi demonstrada como meio não invasivo para avaliar o crescimento tumoralintraocular21. O protocolo aqui descrito descreve a implantação de células de melanoma na coroide murina e o uso da OCT para predizer a localização e o tamanho do tumor intraocular no momento da inoculação celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &#956;L glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>721711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needles</td>
			<td>BD Microbalance</td>
			<td>2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Orion Phrma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16LS9 cells</td>
			<td>from Hans Grossniklaus USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine&#160;</td>
			<td>richter pharma</td>
			<td>102047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 female mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential vitamin mixture</td>
			<td>satorius</td>
			<td>01-025-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>rhenium</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>390862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight OCT segmentation software&#160;</td>
			<td>Phoenix Micron, Inc&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>bremer pharma GMBH (medimarket)</td>
			<td>17889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine&#160;</td>
			<td>zoetis (vetmarket)</td>
			<td>102532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin 0.3% eye drops</td>
			<td>allergan</td>
			<td>E92170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical coherence tomography&#160;</td>
			<td>Phoenix Micron, Inc&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxybuprocaine 0.4%</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>393050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-amphoteracin</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)&#160;</td>
			<td>satorius</td>
			<td>02-023-1a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI cell media</td>
			<td>satorius</td>
			<td>01-104-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>OPMI-6 CFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>390723</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid via optical coherence tomography

O estabelecimento de modelos experimentais de melanoma de coroide é um desafio em termos da capacidade de induzir tumores na localização correta. Além disso, as dificuldades na observação in vivo do melanoma de coroide posterior limitam a localização do tumor e a avaliação do crescimento em tempo real. A abordagem aqui descrita otimiza as técnicas para o estabelecimento do melanoma de coroide em camundongos por meio de um procedimento de injeção de células B16LS9 subcoroidal em várias etapas. Para permitir a precisão na injeção nas pequenas dimensões da úvea do rato, o procedimento completo é realizado sob um microscópio. Primeiro, uma peritomia conjuntival é formada na área dorso-temporal do olho. Em seguida, um trato no espaço subcoroidal é criado inserindo uma agulha através da esclera exposta. Isto é seguido pela inserção de uma agulha romba no trato e a injeção de células de melanoma na coroide. Imediatamente após a injeção, a tomografia de coerência óptica (OCT) não invasiva é utilizada para determinar a localização e a evolução do tumor. O descolamento de retina é avaliado como preditor da localização e tamanho do tumor. O método apresentado permite a indução reprodutível de melanoma localizado em coroide em camundongos e a avaliação do crescimento tumoral em imagens ao vivo. Como tal, fornece uma ferramenta valiosa para o estudo de tumores intraoculares.

Os olhos foram examinados via OCT imediatamente após a injeção das células B16LS9. Descolamento local de retina foi observado após a injeção. Os camundongos exibiram três padrões de RD: focal (Figura 2, painel superior), vazamento para o vítreo (Figura 2, painel médio) e RD estendida (Figura 2, painel inferior). A DR estendida é provavelmente causada por danos causados pela injeção. Houve associação entre o ...

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Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

O presente protocolo descreve o implante e a avaliação do melanoma em coroide murina utilizando tomografia de coerência óptica.

Implantação e Avaliação do Melanoma na Coroide Murina via Tomografia de Coerência Óptica

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Estabelecer tumores como parte posterior do olho é um desafio. Este método permite a indução de tumores reprodutíveis de melanoma de coroide em camundongos e imagens ao vivo do crescimento tumoral para avaliação. Este protocolo utiliza imagens ao vivo da OCT para avaliar a localização dos tumores já no momento da inoculação de células tumorais e acompanhar o crescimento tumoral em animais vivos.O melanoma uveal é uma doença devastadora com cerca de 50% de metástase. O desenvolvimento de modelos experimentais é fundamental para o avanço de pesquisas voltadas para novas possibilidades terapêuticas. Uma vantagem deste método é que a avaliação imediata do sucesso da injeção permite alcançar grupos de estudo com tumores homogêneos e segui-los continuamente por imagens ao vivo.Examinar a progressão do tumor. Injetar nos olhos do pequeno rato requer prática. A capacidade de visualizar as células injetadas permite que você avalie seu sucesso imediatamente e repita com mais camundongos, conforme necessário.Quem demonstrará o procedimento será o Dr. Dimitri Gaber, do Laboratório de Pesquisa em Oftalmologia do Kaplan Medical Center. Para começar, aplique 0,4% de anestésico oftálmico tópico, Oxybuprocaine em ambos os olhos do camundongo anestesiado. Em seguida, aplicar topicamente 0,5% de Tropicamida em ambos os olhos para dilatar as pupilas, seguido de 1,4% de hidroxietil celulose como lubrificante para evitar o ressecamento dos olhos.Observe um olho do mouse sob um microscópio cirúrgico. Mantenha as pálpebras abertas com pinça intraocular estéril. Em seguida, segure o limbo-conjuntiva temporal superior e puxe para uma posição infranasal.Garanta essa posição segurando o limbo-conjuntiva durante todo o procedimento. Com ponta de agulha calibre 30, consegue-se uma pequena peritomia conjuntival na área temporal dorsal, aproximadamente um a dois milímetros posterior ao limbo. Remova o excesso de cápsula tendinosa da abertura da peritomia.Insira a ponta da agulha para penetrar na esclera criando um rastro no espaço subcoroidal até que a cor marrom da coroide apareça através da substância branca exposta da esclera. Coloque as células em uma seringa Hamilton de vidro estéril de 10 microlitros montada com uma agulha romba de calibre 32 torcida em um ângulo de 45 graus. Insira a agulha da seringa carregada aproximadamente dois milímetros no trato criado e injete dois microlitros da suspensão celular.Segure a agulha no lugar após a injeção durante dois a três segundos até que todo o líquido tenha eliminado. Retire a agulha puxando-a suavemente para evitar fugas do tracto. Imediatamente após a inoculação das células de melanoma, observar o olho injetado do animal por meio de exames de OCT.Com base nos exames, classifique os padrões de descolamento de retina ou DR de acordo com três categorias DR local, Vazamento para o vítreo ou DR estendida. Abra um software de análise de segmentação da OCT para prever o tamanho do tumor com base na altura da DR. Meça a altura da DR Local nos exames de OCT e classifique-os em três grupos. Na fase pós-operatória, aplicar 0,3% de Ofloxacina topicamente.A predição baseada na OCT do crescimento tumoral após injeção de células subcoroidais é mostrada nesta figura. Os camundongos exibiram três padrões de RD, Focal, Leakage To The Vitreous e Extended RD. Houve associação entre o padrão de DR imediatamente após a injeção e a localização dos tumores cinco dias após a injeção. A DR focal foi associada ao crescimento de células tumorais que se limitava à coroide.No entanto, a observação de células no vítreo após a injeção em animais com DR Focal indicou crescimento tumoral na cavidade vítrea e na coroide. quando a DR estendida foi observada após a injeção, os tumores estavam dispersos por toda a coroide e vítreo após cinco dias. A variedade de tamanhos de tumor induzidos neste modelo pode ser dividida em pequeno, médio e grande.Aqui são mostradas imagens representativas da medida da OCT da altura da RD após a injeção, e a imagem de fundo de olho correspondente, uma varredura horizontal da OCT da altura e largura do tumor no quinto dia após a injeção, e sua imagem de fundo de olho correspondente, e a seção correspondente do olho corado por H&E demonstrando medidas comparáveis do tumor. Medidas de volume tumoral de camundongos que apresentaram DR pequena, média ou grande imediatamente após a injeção celular são apresentadas aqui. O ajuste da força de injeção pode afetar o tamanho e a localização do tumor.É importante calibrá-lo e avaliar o padrão de descolamento de retina induzido pela OCT após a injeção. A imagem ao vivo de tumores de coroide é uma importante ferramenta experimental que permite examinar o efeito de diferentes fatores ou potenciais terapias na progressão tumoral.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Um mouse modelo de fadiga induzida por irradiação periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Pesquisa do câncer

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Utilização do ultra-som guiado implantação celular tecido-dirigido para o estabelecimento de Xenografts biologicamente relevantes Tumor metastático

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Controle espacial e temporal da iniciação de melanoma murino de células-tronco de melanócitos mutantes

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

Geração de uma plataforma de xenoenxerto de melanoma uveal humano ortotópico do fígado em camundongos imunodeficientes

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Implantação ortotópica guiada por ultrassom do Adenocarcinoma Ductal Pancreático murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...