Name: implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid via optical coherence tomography
Uploaded: 2022-12-02T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography at JoVE.com

Este estudio fue apoyado en parte por la subvención 1304/20 de la Fundación de Ciencia de Israel (ISF), Israel, para Arie Marcovich. Agradecemos a Shahar Ish-Shalom y Ady Yosipovich, del Departamento de Patología, Centro Médico Kaplan, Rehovot, Israel, por el análisis histológico.

Los experimentos en el protocolo fueron aprobados por el Consejo Nacional Israelí de Experimentación Animal y cumplen con la Declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6, de 8 a 10 semanas de edad, y se expusieron a ciclos de luz-oscuridad de 12/12 h. Los animales fueron obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).
1. Cultivo celular
...

<ol>
	<li>Jager, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+melanoma.">Uveal melanoma.</a> Nature Reviews Disease Primers. 6 (1), 1-25 (2020).</li><li>Bustamante, P., Piquet, L., Landreville, S., Burnier, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uveal+melanoma+pathobiology:+Metastasis+to+the+liver.">Uveal melanoma pathobiology: Metastasis to the liver.</a> Seminars in Cancer Biology. 71, 65-85 (2021).</li><li>Damato, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+treatment+of+choroidal+melanoma+in+relation+to+the+prevention+of+metastatic+death-A+personal+view.">Ocular treatment of choroidal melanoma in relation to the prevention of metastatic death-A personal view.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 66, 187-199 (2018).</li><li>Jouhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+fatal+choroidal+melanoma+study.+A+survey+by+the+European+Ophthalmic+Oncology+Group.">The small fatal choroidal melanoma study. A survey by the European Ophthalmic Oncology Group.</a> American Journal of Ophthalmology. 202, 100-108 (2019).</li><li>Cao, J., Jager, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+eye+models+for+uveal+melanoma.">Animal eye models for uveal melanoma.</a> Ocular Oncology and Pathology. 1 (3), 141-150 (2015).</li><li>Uner, O. E., Gandrakota, N., Azarcon, C. P., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+uveal+melanoma.">Animal models of uveal melanoma.</a> Annals of Eye Science. 7, 21-30 (2022).</li><li>Yang, H., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+2b+decreases+hepatic+micrometastasis+in+a+murine+model+of+ocular+melanoma+by+activation+of+intrinsic+hepatic+natural+killer+cells.">Interferon alpha 2b decreases hepatic micrometastasis in a murine model of ocular melanoma by activation of intrinsic hepatic natural killer cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (7), 2056-2064 (2004).</li><li>Yang, H., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunologic+and+anti-angiogenic+therapy+reduces+hepatic+micrometastases+in+a+murine+ocular+melanoma+model.">Combined immunologic and anti-angiogenic therapy reduces hepatic micrometastases in a murine ocular melanoma model.</a> Current Eye Research. 31 (6), 557-562 (2006).</li><li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+liver+metastasis.">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion &amp; Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li><li>Diaz, C. E., Rusciano, D., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B16LS9+melanoma+cells+spread+to+the+liver+from+the+murine+ocular+posterior+compartment+(PC).">B16LS9 melanoma cells spread to the liver from the murine ocular posterior compartment (PC).</a> Current Eye Research. 18 (2), 125-129 (1999).</li><li>Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+liver+metastasis.">Murine models of liver metastasis.</a> Invasion &amp; Metastasis. 14 (1-6), 349-361 (1994).</li><li>Ashur-Fabian, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrac+delayed+the+onset+of+ocular+melanoma+in+an+orthotopic+mouse+model.">Tetrac delayed the onset of ocular melanoma in an orthotopic mouse model.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 632335 (2019).</li><li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+c-met+overexpression+in+liver-metastatic+B16-LS9+melanoma+cells.">Mechanisms regulating c-met overexpression in liver-metastatic B16-LS9 melanoma cells.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 81 (3), 477-487 (2001).</li><li>Harning, R., Szalay, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+metastasis+of+in+vivo+and+in+vitro+derived+syngeneic+murine+melanoma.">Ocular metastasis of in vivo and in vitro derived syngeneic murine melanoma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 28 (9), 1599-1604 (1987).</li><li>Ezra-Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+an+in+vivo+imaging+system+be+used+to+determine+localization+and+biodistribution+of+AAV5-mediated+gene+expression+following+subretinal+and+intravitreal+delivery+in+mice.">Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice.</a> Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).</li><li>Notting, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+bioluminescent+imaging+of+human+uveal+melanoma+in+a+new+mouse+model+of+local+tumor+growth+and+metastasis.">Whole-body bioluminescent imaging of human uveal melanoma in a new mouse model of local tumor growth and metastasis.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (5), 1581-1587 (2005).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+xenograft+murine+human+uveal+melanoma+model+develops+hepatic+micrometastases.">In-vivo xenograft murine human uveal melanoma model develops hepatic micrometastases.</a> Melanoma Research. 18 (2), 95-103 (2008).</li><li>Murthy, R. K., Haji, S., Sambhav, K., Grover, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+retinal+diseases.">Clinical applications of spectral domain optical coherence tomography in retinal diseases.</a> Biomedical Journal. 39 (2), 107-120 (2016).</li><li>Drexler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-resolution+ophthalmic+optical+coherence+tomography.">Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography.</a> Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).</li><li>Ochakovski, G. A., Fischer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+of+mouse+models+with+OCT.">Phenotyping of mouse models with OCT.</a> Methods in Molecular Biology. 1834, 285-291 (2019).</li><li>Zaks, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+imaging+for+assessing+tumor+growth+in+mouse+models+of+ocular+melanoma.">In-vivo imaging for assessing tumor growth in mouse models of ocular melanoma.</a> Experimental Eye Research. 204, 108431 (2021).</li><li>Brar, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Academy+of+Ophthalmology+2022-2023+BCSC.+2.">American Academy of Ophthalmology 2022-2023 BCSC. 2.</a> Fundamentals and principles of ophthalmology. , (2022).</li><li>Duker, J. S., Waheed, N. K., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Retinal OCT: Optical Coherence Tomography, 2nd Edition. , (2021).</li><li>Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+subcutaneous+tumor+size+in+athymic+(nude)+mice.">Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).</li><li>Richards, J. R., Yoo, J. H., Shin, D., Odelberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+uveal+melanoma:+Strengths,+weaknesses,+and+future+directions.">Mouse models of uveal melanoma: Strengths, weaknesses, and future directions.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 33 (2), 264 (2020).</li><li>Chen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoacoustic+molecular+imaging-escorted+adipose+photodynamic-browning+synergy+for+fighting+obesity+with+virus-like+complexes.">Photoacoustic molecular imaging-escorted adipose photodynamic-browning synergy for fighting obesity with virus-like complexes.</a> Nature Nanotechnology. 16 (4), 455-465 (2021).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+visualization+of+early+cancer+hepatic+micrometastasis+and+intraoperative+image-guided+surgery+by+photoacoustic+imaging.">Label-free visualization of early cancer hepatic micrometastasis and intraoperative image-guided surgery by photoacoustic imaging.</a> Journal of Nuclear Medicine. 61 (7), 1079-1085 (2020).</li></ol>

El melanoma uveal es una enfermedad devastadora para la cual se necesitan nuevos enfoques terapéuticos. Sin embargo, la investigación sobre el melanoma uveal y los tratamientos potenciales está limitada por los desafíos técnicos de los modelos animales de melanoma uveal 1,25. Los tumores oculares, que son inducidos por la inyección intraocular de células cancerosas, son muy variables tanto en localización como en tamaño, probablemente debido a las peque?...

El melanoma uveal (UM) es la neoplasia maligna primaria intraocular más frecuente en adultos. Aproximadamente el 90% de los melanomas oculares se originan a partir de melanocitos en la región coroidea del tracto uveal1. La UM es una causa importante de morbilidad y mortalidad, ya que se estima que cerca del 50% de los pacientes desarrollan enfermedad metastásica, siendo el hígado el sitio principal de metástasis2. El tratamiento temprano de las lesiones primarias puede reducir la posibilidad de metástasis, pero ningún tratamiento eficaz previene la formación de metástasis3.
El tratamiento estándar del melanoma uveal incluye la terapia de irradiación, que se asocia con pérdida de la visión debido a neuropatía óptica, retinopatía, síndrome del ojo seco y cataratas. La resección quirúrgica generalmente se retrasa hasta que se reconoce y caracteriza el crecimiento de la lesión. Sin embargo, tal retraso puede permitir el desarrollo de la enfermedad metastásica4. En algunos casos, se requiere una enucleación inútil. Por supuesto, este procedimiento radical compromete la visión y resulta en un deterioro estético dramático.
Se han dedicado muchos esfuerzos al desarrollo de modelos experimentales para estudiar el melanoma uveal. Los modelos animales preclínicos que permiten una evaluación precisa de esta neoplasia maligna son clave para investigar nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas para el melanoma uveal. Los modelos animales experimentales de melanoma ocular se basan principalmente en la inoculación de células tumorales en ratones, ratas y conejos 5,6. Los modelos de ratón son rentables y ampliamente utilizados para estudios de melanoma debido a su rápida tasa de reproducción y alta similitud del genoma con los humanos. La línea celular de melanoma cutáneo murino B16 se utiliza comúnmente para inocular ratones C57BL6 e inducir tumores singénicos. Cuando se utiliza este modelo para inducir melanoma uveal, los ojos portadores de tumores generalmente necesitan ser enucleados 7-14 días después de la inoculación. Además, B16 es un modelo altamente invasivo. La naturaleza inmunoprivilegiada del ojo apoya la metástasis, y las metástasis generalmente se pueden detectar 3-4 semanas después de la inoculación de células tumorales. Los subcultivos de la línea B16 original muestran propiedades metastásicas distintas6. Por ejemplo, la línea de melanoma de Queens tiene una alta tasa metastásica 7,8. La línea celular B16LS9 tiene morfología de células dendríticas y se derivó de metástasis hepáticas de ratones C57BL/6 inyectados con la línea de melanoma cutáneo parental B16F19. Cuando se inyectaron en el compartimiento posterior del ojo, se demostró que estas células forman tumores intraoculares, que se asemejan histológicamente al melanoma uveal humano y forman metástasis específicas del hígado en ratones C57BL / 6, pero no en Balb / C, 10,11,12. Genéticamente, las células se caracterizan por una mayor expresión del protooncogén c-met, que actúa como receptor celular para el factor de crecimiento de hepatocitos13. En contraste, B16F10, eldécimo pasaje de la B16 parental, hace metástasis principalmente a los pulmones cuando se inocula intraocularmente14. Tanto B16F10 como B16LS9 están pigmentados12.
Varios desafíos clave limitan el éxito de los modelos murinos de melanoma uveal. En primer lugar, el reflujo de células tumorales puede conducir a melanoma extraocular o subconjuntival. En segundo lugar, el crecimiento tumoral después de la inoculación intraocular de células de melanoma es a menudo muy variable, lo que plantea dificultades para evaluar el tratamiento y el progreso. Otra dificultad importante es la capacidad limitada para seguir el crecimiento del tumor in vivo. Si bien las imágenes bioluminiscentes, como las de tumores que expresan luciferasa, se usan comúnmente para monitorear el crecimiento del tumor ocular15,16, no pueden proporcionar información sobre la ubicación intraocular del tumor. Por lo tanto, la evaluación del tumor se realiza típicamente después de la enucleación del ojo10,17. Esto limita en gran medida la capacidad de caracterizar ampliamente la progresión del tumor y la respuesta a los tratamientos. Otro obstáculo importante en el estudio del melanoma uveal es la dificultad para monitorear las lesiones en ratones pigmentados. Se requieren nuevos enfoques, que superen estas dificultades, para promover la investigación del melanoma uveal en modelos animales.
La tomografía de coherencia óptica (OCT) proporciona capacidades distintivas para obtener imágenes profundas en las diferentes secciones del ojo en alta resolución, lo que no tiene paralelo con otras metodologías, incluida la ecografía18,19. La imagen de OCT se ha utilizado en modelos animales para estudiar diversas enfermedades oculares20. Recientemente, la imagen de OCT fue demostrada como medio no invasivo para evaluar el crecimiento tumoral intraocular21. El protocolo descrito aquí describe la implantación de células de melanoma en la coroides murina y la utilización de OCT para predecir la localización y el tamaño del tumor intraocular en el momento de la inoculación celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 &#956;L glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>721711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needles</td>
			<td>BD Microbalance</td>
			<td>2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride</td>
			<td>Orion Phrma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16LS9 cells</td>
			<td>from Hans Grossniklaus USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine&#160;</td>
			<td>richter pharma</td>
			<td>102047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 female mice</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential vitamin mixture</td>
			<td>satorius</td>
			<td>01-025-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>rhenium</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>390862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight OCT segmentation software&#160;</td>
			<td>Phoenix Micron, Inc&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>bremer pharma GMBH (medimarket)</td>
			<td>17889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine&#160;</td>
			<td>zoetis (vetmarket)</td>
			<td>102532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin 0.3% eye drops</td>
			<td>allergan</td>
			<td>E92170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical coherence tomography&#160;</td>
			<td>Phoenix Micron, Inc&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxybuprocaine 0.4%</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>393050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin-amphoteracin</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)&#160;</td>
			<td>satorius</td>
			<td>02-023-1a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI cell media</td>
			<td>satorius</td>
			<td>01-104-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>satorius</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>OPMI-6 CFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Fisher Pharmaceutical</td>
			<td>390723</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid via optical coherence tomography

El establecimiento de modelos experimentales de melanoma coroideo es un desafío en términos de la capacidad de inducir tumores en la localización correcta. Además, las dificultades para observar el melanoma coroideo posterior in vivo limitan la localización del tumor y la evaluación del crecimiento en tiempo real. El enfoque descrito aquí optimiza las técnicas para establecer el melanoma coroideo en ratones a través de un procedimiento de inyección de células B16LS9 subcoroidea de varios pasos. Para permitir la precisión en la inyección en las pequeñas dimensiones de la úvea del ratón, el procedimiento completo se realiza bajo un microscopio. Primero, se forma una peritomía conjuntival en el área dorsal-temporal del ojo. Luego, se crea un tracto en el espacio subcoroideo insertando una aguja a través de la esclerótica expuesta. Esto es seguido por la inserción de una aguja roma en el tracto y la inyección de células de melanoma en la coroides. Inmediatamente después de la inyección, se utilizan imágenes de tomografía de coherencia óptica (OCT) no invasivas para determinar la ubicación y el progreso del tumor. El desprendimiento de retina se evalúa como un predictor del sitio y tamaño del tumor. El método presentado permite la inducción reproducible de melanoma localizado en coroides en ratones y la obtención de imágenes en vivo de la evaluación del crecimiento tumoral. Como tal, proporciona una herramienta valiosa para estudiar los tumores intraoculares.

Los ojos se examinaron a través de OCT inmediatamente después de la inyección de las células B16LS9. Se observó desprendimiento de retina local después de la inyección. Los ratones exhibieron tres patrones de DR: focal (Figura 2, panel superior), fuga al vítreo (Figura 2, panel medio) y RD extendida (Figura 2, panel inferior). La RD extendida es probablemente causada por el daño de la inyección. Hubo una asociaci?...

Watch this Scientific Journal Video about Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography at JoVE.com

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

El presente protocolo describe la implantación y evaluación del melanoma en la coroides murina mediante tomografía de coherencia óptica.

Implantación y evaluación del melanoma en la coroides murina mediante tomografía de coherencia óptica

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Establecer tumores como la parte posterior del ojo es un desafío. Este método permite la inducción de tumores de melanoma coroideo reproducibles en ratones, y la obtención de imágenes en vivo del crecimiento tumoral para su evaluación. Este protocolo utiliza imágenes OCT en vivo para evaluar la ubicación de los tumores ya en el momento de la inoculación de células tumorales y para seguir el crecimiento tumoral en animales vivos.El melanoma uveal es una enfermedad devastadora con una tasa cercana al 50% de metástasis. El desarrollo de modelos experimentales es clave para avanzar en la investigación dirigida a nuevas posibilidades terapéuticas. Una ventaja de este método es que la evaluación inmediata del éxito de la inyección permite llegar a grupos de estudio con tumores homogéneos y seguirlos continuamente mediante imágenes en vivo.Para examinar la progresión del tumor. Inyectar en los ojos del ratón pequeño requiere práctica. La capacidad de visualizar las células inyectadas le permite evaluar su éxito de inmediato y repetir con más ratones según sea necesario.Demostrando el procedimiento estará el Dr. Dimitri Gaber del Laboratorio de Investigación de Oftalmología del Centro Médico Kaplan. Para comenzar, aplique 0.4% de anestésico oftálmico tópico, oxibuprocaína a ambos ojos del ratón anestesiado. Luego aplique tópicamente 0.5% de Tropicamida en ambos ojos para dilatar las pupilas, seguido de 1.4% de hidroxietilcelulosa como lubricante para evitar el secado de los ojos.Observe un ojo del ratón bajo un microscopio operativo. Mantenga los párpados abiertos con fórceps intraoculares estériles. Luego sostenga la limbo-conjuntiva temporal superior y tire hacia una posición infranasal.Asegure esta posición sosteniendo la limbo-conjuntiva durante todo el procedimiento. Usando una punta de aguja de calibre 30 hacer una pequeña peritomía conjuntival en el área temporal dorsal aproximadamente de uno a dos milímetros posterior al limbo. Retire la cápsula de exceso de tendones de la abertura de la peritomía.Inserte la punta de la aguja para penetrar en la esclerótica creando una pista en el espacio subcoroideo hasta que aparezca el color marrón de la coroides a través de la materia blanca expuesta de la esclerótica. Cargue las células en una jeringa Hamilton de vidrio estéril de 10 microlitros montada con una aguja roma de calibre 32 torcida en un ángulo de 45 grados. Inserte la aguja de la jeringa cargada aproximadamente dos milímetros en el tracto creado e inyecte dos microlitros de la suspensión celular.Mantenga la aguja en su lugar después de la inyección durante dos o tres segundos hasta que todo el líquido se haya eliminado. Retire la aguja tirando de ella suavemente para evitar fugas del tracto. Inmediatamente después de la inoculación de células de melanoma, observe el ojo inyectado del animal mediante exploraciones OCT.Con base en las exploraciones, clasifique el desprendimiento de retina o los patrones de RD de acuerdo con tres categorías de RD local, Fuga en el vítreo o RD extendida. Abra un software de análisis de segmentación de OCT para predecir el tamaño del tumor en función de la altura de la RD. Mida la altura de la DR local en las exploraciones de OCT y clasifíquelas en tres grupos. En la fase postoperatoria, aplicar 0,3% de ofloxacino tópicamente.La predicción basada en OCT del crecimiento tumoral después de la inyección de células subcoroideas se representa en esta figura. Los ratones exhibieron tres patrones de RD, Focal, Leakage To The Vitreous y Extended RD. Hubo una asociación entre el patrón de DR inmediatamente después de la inyección y la localización de los tumores cinco días después de la inyección. La DR focal se asoció con el crecimiento de células tumorales que se limitó a la coroides.Sin embargo, la observación de células en el vítreo después de la inyección en animales que mostraban RD focal indicó crecimiento tumoral en la cavidad vítrea y la coroides. cuando se observó RD extendida después de la inyección, los tumores se dispersaron por toda la coroides y el vítreo después de cinco días. El rango de tamaños tumorales inducidos en este modelo se puede dividir en pequeño, mediano y grande.Aquí se muestran imágenes representativas de la medición de OCT de la altura de RD después de la inyección, y la imagen de fondo de ojo correspondiente, una exploración horizontal de OCT de la altura y anchura del tumor en el quinto día después de la inyección, y su imagen de fondo de ojo correspondiente, y la sección correspondiente de ojo teñido de H&E que demuestra mediciones tumorales comparables. Aquí se presentan las mediciones del volumen tumoral de ratones que presentaron DR pequeña, mediana o grande inmediatamente después de la inyección celular. El ajuste de la fuerza de inyección puede afectar el tamaño y la ubicación del tumor.Es importante calibrar esto y evaluar el patrón de desprendimiento de retina inducido por OCT después de la inyección. La imagen en vivo de los tumores coroideos es una herramienta experimental importante que permite examinar el efecto de diferentes factores o terapias potenciales sobre la progresión tumoral.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Un modelo de ratón de la fatiga inducida por irradiación periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Enriquecimiento y caracterización de los microambientes Tumor inmunes y no inmunes en tumores murinos subcutáneos establecidos

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Generación rápida de cultivos primarios de melanocitos muritonos y fibroblastos

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Control espacial y temporal de la iniciación del melanoma murino a partir de células madre de melanocitos mutantes

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

Generación de una plataforma de xenoinjerto de melanoma uveal humano ortotópico hepático en ratones inmunodeficientes

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultrasonido-Guiado Implantación Ortotópica de Adenocarcinoma Ductal Pancreático Murino

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...