Name: reconstituting cytoarchitecture and function of human epithelial tissues on an open-top organ-chip
Uploaded: 2023-02-17T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip at JoVE.com

تم الحصول على القولون البشري من استئصال الأمعاء وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة السلامة البيولوجية المؤسسية لمستشفى سينسيناتي للأطفال (IBC 2017-2011).
1. تنشيط السطح
<ol><li>إعداد المخزن المؤقت للتنشيط<ol><li>ضع الكواشف العازلة للربط المتشابك والمذيبات تحت خزانة السلامة البيو?...

<ol>
	<li>Van Norman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+animal+studies+for+predicting+toxicity+in+clinical+trials:+Is+it+time+to+rethink+our+current+approach.">Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).</li><li>Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+the+principles+of+the+3Rs+of+animal+testing+at+CDER:+Past,+present+and+future.">Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).</li><li>Mosig, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models:+New+opportunities+for+biomedical+research.">Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research.</a> Future Science OA. 3 (2), (2017).</li><li>Al&#233;p&#233;e, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+of+3D+cultures+(organs-on-a-chip)+in+safety+testing+and+pathophysiology.">State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology.</a> Altex. 31 (4), 441-477 (2014).</li><li>MacArron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research.">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).</li><li>Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+based+in+vitro+test+systems+for+anticancer+drug+screening.">Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).</li><li>Mao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+type+II+cells+in+primary+culture.">Human alveolar epithelial type II cells in primary culture.</a> Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).</li><li>Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+significantly+alters+gene+expression+profiles+and+reduces+differences+between+myometrial+and+fibroid+smooth+muscle+cells.">In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells.</a> Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).</li><li>Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+tissue+stiffness+and+bioadhesivity:+Advanced+biomaterials+to+model+tumor+microenvironments+and+drug+resistance.">Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance.</a> Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).</li><li>Nawroth, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+Lung-on-Chips:+The+best+of+both+worlds.">Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2d+to+3d+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Kapa&#322;czy&#324;ska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-component+radiation+survival+curve+using+an+in+vitro+tumour+model.">A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model.</a> International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).</li><li>Chandra, P., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+extracellular+microenvironment+for+modulating+stem+cell+behaviors.">Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors.</a> Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).</li><li>Nicolas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+extracellular+matrix+mimics:+Fundamental+concepts+and+role+of+materials+chemistry+to+influence+stem+cell+fate.">3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate.</a> Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).</li><li>Brassard, J. A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+self-organization+to+build+better+organoids.">Engineering stem cell self-organization to build better organoids.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Mantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+hydrogels+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Materials. 12 (20), 3323 (2019).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning.">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+cues+as+master+regulators+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).</li><li>Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+chips+and+microphysiological+systems+for+disease+modeling+and+drug+testing.">Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing.</a> Micromachines. 12 (2), 139 (2021).</li><li>Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-chip:+A+new+paradigm+for+drug+development.">Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).</li><li>Varone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organ-chip+system+emulates+three-dimensional+architecture+of+the+human+epithelia+and+the+mechanical+forces+acting+on+it.">A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it.</a> Biomaterials. 275, 120957 (2021).</li><li>Hassell, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organ+chip+models+recapitulate+orthotopic+lung+cancer+growth,+therapeutic+responses,+and+tumor+dormancy+in+vitro.">Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro.</a> Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking. 1897, 253-268 (2019).</li><li>Grant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+drug+concentrations+in+PDMS+microfluidic+organ+chips.">Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips.</a> Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).</li><li>Barrile, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+recapitulates+thrombosis+Induced+by+an+anti-CD154+monoclonal+antibody:+Translational+potential+of+advanced+microengineered+systems.">Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+human+lung+alveolus-on-a-chip+model+of+intravascular+thrombosis+for+assessment+of+therapeutics.">Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).</li><li>Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+polydimethylsiloxane:+Alternative+materials+for+fabrication+of+organ-on-a-chip+devices+and+microphysiological+systems.">Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).</li><li>Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+human+physiology+on-chip:+Historical+perspectives+and+future+directions.">Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions.</a> Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).</li></ol>

تمثل رقاقة Open-Top منصة تمكينية للتحقيق في التفاعل الخلوي المعقد الذي يحدث بين البطانة والسدى والظهارة في بيئة دقيقة خاضعة للرقابة ، في الوقت الفعلي. توفر هذه التقنية مزايا حاسمة على الثقافات العضوية والعضوية التقليدية ، مثل دمج الإشارات الفيزيائية والكيميائية الحيوية ذات الصلة بإعادة تكو...

تاريخيا ، اعتمد العلماء على الاختبارات قبل السريرية على الحيوانات لاكتشاف الأدوية ، ولكن تم التشكيك في عدد متزايد من هذه الطرق بسبب ضعف الارتباط بالنتيجة البشرية1. إن تنفيذ مبادئ "3Rs" لاستبدال التجارب على الحيوانات وتقليلها وصقلها يحث العلماء على إيجاد طرق بديلة جديدة في المختبر لدعم تقييم مخاطر الأدوية والسموم الكيميائية قبل السريرية2. ومع ذلك ، فإن العديد من النماذج المختبرية التي تم تطويرها حتى الآن تفتقر إلى البنية البيولوجية والتعقيد الخلوي والبيئة الميكانيكية اللازمة لتلخيص الطبيعة الديناميكية للأعضاء الحية البشرية 3,4.
عادة ما تستخدم الأنظمة قبل السريرية التقليدية في المختبر زراعات أحادية 2D للخلايا البشرية المزروعة على سطح بلاستيكي صلب. توفر هذه الأساليب أداة لإجراء دراسات ميكانيكية بسيطة وتمكن من الفحص السريع للأدوية المرشحة. نظرا لتكلفتها المنخفضة نسبيا وقوتها العالية ، غالبا ما يتم إقران نماذج 2D بأنظمة أوتوماتيكية عالية الإنتاجية وتستخدم لتحديد سريع للأدوية المرشحة المحتملة خلال المرحلة المبكرة من عملية تطوير الأدوية 5,6. ومع ذلك ، فإن نماذج 2D هذه لا توفر نهجا متعديا لنمذجة الاستجابات على مستوى الأنسجة أو على مستوى الأعضاء أو النظامية للمرشحين العلاجيين ، وهو أمر ضروري للتنبؤات الدقيقة بسلامة الأدوية وفعاليتها خلال المرحلة قبل السريرية من تطورها. لا تلخص مزارع الخلايا المسطحة البيئة المكروية للأنسجة الأصلية ، بما في ذلك التفاعل المعقد متعدد الخلايا ، والخصائص الميكانيكية الحيوية ، والبنية ثلاثية الأبعاد (3D) للأنسجة البشرية7. غالبا لا تكتسب الخلايا التي تنمو على سطح مستو نمطا ظاهريا ناضجا؛ ومن ثم لا يمكنها الاستجابة للمثيرات الدوائية كما تفعل في الأنسجة الأصلية. على سبيل المثال ، تظهر الخلايا الظهارية السنخية البشرية الأولية التي تنمو في المختبر نمطا ظاهريا حرشفيا وتفقد علامات النمط الظاهري الرئيسية ، بما في ذلك البروتينات الخافضة للتوتر السطحي C و B (SP-C و SP-B)8. بالإضافة إلى التمايز غير الكافي ، غالبا ما تصبح الخلايا الأولية غير حساسة للضغوط البيولوجية في المختبر ، حيث تصبح بعض المسارات الكيميائية الحيوية المرتبطة بالتهاب الأنسجة غير وظيفية9. يبدو أن هذا الفقدان لوظيفة الخلية يرتبط في المقام الأول باستخدام ركائز صلبة بالإضافة إلى نقص العوامل القابلة للذوبان التي تطلقها بشكل طبيعي الخلايا اللحمية الخاصة بالأنسجة مثل الخلايا الليفية الرئوية وخلايا العضلات الملساء10,11.
إن فهم أن الافتقار إلى التعقيد الكيميائي الفيزيائي والبيولوجي يحد من السلوك الفسيولوجي للخلايا في المختبر قد عزز تطوير نماذج متعددة الخلايا أكثر تطورا ، والتي أثبتت أنها تلتقط بشكل أفضل تعقيد الأنسجة البشرية خارج الجسم12,13. منذ إنشاء أول نماذج الثقافة المشتركة في أوائل سبعينيات القرن العشرين14 ، أدى إدخال الهلاميات المائية الاصطناعية والطبيعية إلى تحسين القدرة على تقليد البيئات الدقيقة للأنسجة الأصلية بشكل كبير وأصبح أداة لا تقدر بثمن لدفع التمايز الخلوي ، وتوجيه التنظيم الذاتي للخلايا إلى هياكل تشبه الأنسجة ، واستعادة وظائف الأنسجة الأصلية15,16. على سبيل المثال ، عندما تزرع في سقالة 3D المناسبة ، يمكن للخلايا البشرية أن ترتب ذاتيا في هياكل وظيفية مثل الكرويات أو المواد العضوية ، معبرة عن علامات الخلايا الجذعية ، وتكون قادرة على التجديد الذاتي17. في المقابل ، فإن الخلايا البشرية (بما في ذلك الخلايا الجذعية) ، عندما تنمو على ركائز 2D التقليدية ، تتقدم في العمر بسرعة وتخضع للشيخوخة بعد بضع مقاطع18. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن "تخصيص" الهلاميات المائية لتتناسب مع خصائص الأنسجة المحددة مثل المسامية وحجم المسام وسمك الألياف ومرونة اللزوجة والتضاريس والصلابة أو هندستها بشكل أكبر مع المكونات الخلوية المشتقة من الأنسجة و / أو الجزيئات النشطة بيولوجيا التي تمكن من محاكاة الظروف الفسيولوجية أو المرضية19,20. على الرغم من إمكاناتها الهائلة لاختبار الأدوية ، فإن النماذج القائمة على الهيدروجيل 3D المستخدمة في الأبحاث الصيدلانية لا تلخص بشكل كامل البنية الخلوية المعقدة للأنسجة في الجسم الحي وتفتقر إلى محفزات الدورة الدموية والميكانيكية المهمة الموجودة عادة في جسم الإنسان ، بما في ذلك الضغط الهيدروستاتيكي والتمدد الدوري وقص السوائل21.
ظهرت الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة (MPSs) مثل الأعضاء على الرقائق (OOCs) مؤخرا كأدوات قادرة على التقاط الاستجابات الفسيولوجية المعقدة في المختبر22,23. غالبا ما تستخدم هذه النماذج استخدام منصات الموائع الدقيقة ، والتي تمكن من نمذجة البيئة المكروية الديناميكية للأعضاء الحية.
لقد جمعنا بين مبادئ الهندسة الحيوية للأنسجة 3D وعلم الأحياء الميكانيكي لإنشاء نموذج رقاقة مفتوح للأنسجة الظهارية البشرية المعقدة. سمح لنا ذلك بتلخيص البيئة المكروية متعددة الخلايا والديناميكية للأنسجة الظهارية عن كثب. وهذا يشمل الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية الحيوية الخاصة بالأنسجة الموجودة بشكل طبيعي في الأعضاء الحية ولكن غالبا ما يتم إهمالها من قبل النماذج التقليدية في المختبر 24. تشتمل الرقاقة المفتوحة على جزأتين: حجرة وعائية (الشكل 1 أ) وحجرة انسجة (الشكل 1 ب) مفصولة بغشاء مسامي ، مما يسمح بنشر العناصر الغذائية بين الغرفتين (الشكل 1 ج). تتعرض حجرة الأوعية الدموية لتدفق مستمر للسوائل لتلخيص إجهاد القص الفسيولوجي ، بينما يسمح التصميم القابل للتمدد للغرفة اللحمية بنمذجة الإجهاد الميكانيكي المرتبط بحركات التنفس أو التمعج المعوي. تحتوي المقصورة اللحمية على سقالة هيدروجيل 3D القابلة للضبط المصممة لدعم النمو الفسيولوجي للخلايا الليفية الخاصة بالأنسجة. إنه يمتلك غطاء قابلا للإزالة يسهل إنشاء واجهة هوائية سائلة ، وهي حالة تسمح بمحاكاة أكبر لفسيولوجيا الإنسان للأنسجة المخاطية بالإضافة إلى الوصول المباشر إلى الأنسجة لإدارة الأدوية مباشرة على الطبقة الظهارية. يلتقط الشكل التكميلي 1 بعض المكونات الرئيسية لتصميم الرقاقة المفتوحة بما في ذلك الأبعاد والمقصورات البيولوجية (الشكل التكميلي 1A-D) بالإضافة إلى الخطوات الفنية الرئيسية الموضحة في هذا البروتوكول (الشكل التكميلي 1E).
يتم تحقيق نضح الرقاقة المفتوحة باستخدام مضخة تمعجية قابلة للبرمجة (الشكل 1 د). يسمح إعداد المضخة التمعجية بإدخال 12 شريحة مفتوحة في وقت واحد. يمكن لمعظم الحاضنات استيعاب إعدادين مما يتيح ثقافة ما يصل إلى 24 شريحة لكل حاضنة. يتم تحقيق التمدد الميكانيكي باستخدام منظم ضغط فراغ قابل للبرمجة حسب الطلب (الشكل 1E). يتكون من منظم فراغ كهربائي هوائي يتم التحكم فيه إلكترونيا بواسطة محول رقمي إلى تناظري. بمعنى آخر ، يقوم منظم الفراغ الكهربائي الهوائي بإنشاء ملف تعريف فراغ جيبي بسعة وتردد يحددهما المستخدم. يتم إنشاء سلالة دورية تتراوح من 0٪ إلى 15٪ عن طريق تطبيق ضغط سلبي على قناة الفراغ للرقاقة المفتوحة بسعة تتراوح من 0 إلى -90 كيلو باسكال وتردد 0.2 هرتز. إنه نظام مصمم خصيصا يعادل وحدة إجهاد Flexcell المتاحة تجاريا والتي تم اعتمادها ووصفها سابقا في أوراق أخرى25. لتقليد تشوه الأنسجة الميكانيكية المرتبط ، على سبيل المثال ، بحركة التنفس في الرئة أو التمعج في الأمعاء ، يطبق المشغل الهوائي موجات الفراغ / الإجهاد الجيبية التي يمكن تعديل حجمها وسعتها لتتناسب مع المستوى الفسيولوجي للإجهاد والتردد الذي تختبره الخلايا البشرية في أنسجتها الأصلية.
هنا ، نصف طريقة فعالة وقابلة للتكرار لهندسة وزراعة مكافئات الظهارة العضوية على نموذج أولي لمنصة رقاقة Open-Top. يسمح بتوليد نماذج أعضاء معقدة مثل الجلد والحويصلات الهوائية ومجرى الهواء والقولون مع دمج تدفق السوائل الوعائية والتمدد الميكانيكي. سنحدد الجوانب الفنية الرئيسية التي يجب مراعاتها أثناء تنفيذ مبادئ هندسة الأنسجة لتوليد نماذج ظهارية معقدة. سنناقش المزايا والقيود المحتملة للتصميم الحالي.
تم الإبلاغ عن نظرة عامة على الخطوات الرئيسية المستخدمة لتحقيق نضج الأنسجة والأعضاء ، بما في ذلك معلمات التدفق والتمدد ، في: الشكل 2 للجلد ، الشكل 3 للحويصلات الهوائية ، الشكل 4 لمجرى الهواء ، والشكل 5 للأمعاء. وترد في الجداول التكميلية معلومات إضافية عن تكوين الوسائط والكواشف المستخدمة في استزراع نماذج الأعضاء المختلفة (الجدول التكميلي 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد). الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 3 لمجرى الهواء ، والجدول التكميلي 4 للأمعاء).

reconstituting cytoarchitecture and function of human epithelial tissues on an open-top organ-chip

تصطف جميع الأعضاء البشرية تقريبا مع الأنسجة الظهارية ، التي تضم طبقة واحدة أو عدة طبقات من الخلايا المتصلة بإحكام منظمة في هياكل ثلاثية الأبعاد (3D). واحدة من الوظائف الرئيسية للظهارة هي تشكيل الحواجز التي تحمي الأنسجة السفلية ضد الإهانات الفيزيائية والكيميائية والعوامل المعدية. بالإضافة إلى ذلك ، تتوسط الظهارة في نقل العناصر الغذائية والهرمونات وجزيئات الإشارات الأخرى ، وغالبا ما تخلق تدرجات كيميائية حيوية توجه وضع الخلايا وتقسيمها داخل العضو. نظرا لدورها المركزي في تحديد بنية الأعضاء ووظيفتها ، تعد الظهارة أهدافا علاجية مهمة للعديد من الأمراض البشرية التي لا يتم التقاطها دائما بواسطة النماذج الحيوانية. إلى جانب الاختلافات الواضحة بين الأنواع ، فإن إجراء دراسات بحثية حول وظيفة الحاجز وخصائص نقل الظهارة في الحيوانات يتفاقم بسبب صعوبة الوصول إلى هذه الأنسجة في نظام حي. في حين أن ثقافات الخلايا البشرية ثنائية الأبعاد (2D) مفيدة للإجابة على الأسئلة العلمية الأساسية ، إلا أنها غالبا ما تسفر عن تنبؤات ضعيفة في الجسم الحي . للتغلب على هذه القيود ، في العقد الماضي ، ظهر عدد كبير من منصات المحاكاة الحيوية المهندسة بدقة ، والمعروفة باسم الأعضاء على رقاقة ، كبديل واعد للاختبارات التقليدية في المختبر والحيوانات. هنا ، نصف رقاقة الجهاز المفتوحة (أو رقاقة مفتوحة العلوي) ، وهي منصة مصممة لنمذجة الأنسجة الظهارية الخاصة بالأعضاء ، بما في ذلك الجلد والرئتين والأمعاء. توفر هذه الشريحة فرصا جديدة لإعادة تشكيل البنية متعددة الخلايا ووظيفة الأنسجة الظهارية ، بما في ذلك القدرة على إعادة إنشاء مكون انسجة 3D من خلال دمج الخلايا الليفية الخاصة بالأنسجة والخلايا البطانية داخل نظام نشط ميكانيكيا. توفر هذه الشريحة المفتوحة أداة غير مسبوقة لدراسة التفاعلات الظهارية / الوسيطة والأوعية الدموية على مستويات متعددة من الدقة ، من الخلايا المفردة إلى تركيبات الأنسجة متعددة الطبقات ، مما يسمح بالتشريح الجزيئي للحديث المتبادل بين الخلايا للأعضاء الظهارية في الصحة والمرض.

النقش الدقيق السطحي يمكن استخدام التنميط الدقيق للمصفوفة خارج الخلية (ECM) لتكرار التكوين المكاني لواجهة القبو المعوي. يمكن تعديل تكوين رقاقة Open-Top لدمج الطوابع الدقيقة المصممة خصيصا لتقليد التضاريس الطبيعية لواجهة سدى ظهارة القولون (الشكل 6A ، B) والخباي...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip at JoVE.com

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

يصف هذا البروتوكول القدرات وطرائق الاستزراع الأساسية لرقاقة الجهاز المفتوح من أجل الإنشاء الناجح ونضج مزارع الأعضاء على الرقاقة كاملة السماكة للأنسجة الأولية (الجلد والحويصلات الهوائية ومجرى الهواء والأمعاء) ، مما يوفر الفرصة للتحقيق في الجوانب الوظيفية المختلفة للواجهة الظهارية / الوسيطة والأوعية الدموية البشرية في المختبر.

إعادة تشكيل العمارة الخلوية ووظيفة الأنسجة الظهارية البشرية على رقاقة عضو مفتوحة

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

غالبا ما تفشل طرق الاستزراع الانتشاري التقليدية في تلخيص البيئة المعقدة للأعضاء الحية ، مما يؤدي إلى فقدان العلامات والوظائف الخاصة بالأنسجة. لقد طورنا شريحة مفتوحة تجمع بين ثقافة الانتشار ومبدأ الموائع الدقيقة لتقليد البيئة المكروية للأنسجة الظهارية عن كثب. من خلال تضمين الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية الحيوية الموجودة بشكل طبيعي في الأعضاء الحية ولكن غالبا ما يتم إهمالها من قبل النماذج التقليدية في المختبر ، تمثل الرقاقة المفتوحة بديلا أفضل بين الأنظمة المغلقة.ستوضح العملية Adya Panchal اليوم ، وهي طالبة أبحاث في مختبري. للبدء ، أحضر الكواشف المطلوبة تحت خزانة السلامة البيولوجية على الجليد. زراعة خلايا اللحمة المتوسطة الخاصة بالأنسجة للحصول على التقاء 80٪ إلى 90٪ ثم فصل الخلايا باستخدام التربسين أو طرق أخرى وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.بيليه الخلايا في 250g لمدة خمس دقائق عند 24 درجة مئوية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 225 ميكرولتر لكل من الثلج البارد 10X EMEM والمخزن المؤقت لإعادة البناء. امزج الخلايا عن طريق السحب وأضف 1،800 ميكرولتر من محلول الكولاجين 1 المثلج.بعد ذلك ، امزج محلول ما قبل الهلام على الجليد عن طريق السحب لأعلى ولأسفل من خمس إلى ست مرات. قم بتحييد محلول ما قبل الهلام ب 18 ميكرولترا من هيدروكسيد الصوديوم العادي ، واخلطه برفق عن طريق السحب ، ثم ماصة 150 ميكرولترا من الهيدروجيل المحمل بالخلايا في الغرفة المركزية للشريحة المفتوحة مع تجنب الفقاعات. قم بتجميع الرقائق في أطباق بتري منفصلة ، بما في ذلك غطاء أنبوب طرد مركزي مملوء بملليلتر من الماء المقطر المزدوج المعقم في كل طبق بتري ، واحتضان أطباق بتري عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.لأداء النقش الدقيق السطحي للهيدروجيل اللحمي ، ماصة 20 ميكرولتر من محلول الكولاجين 1 المحايد قبل الهلام على السطح المزخرف لختم معقم مطبوع ثلاثي الأبعاد وأدخل الختم داخل الغرفة المفتوحة بينما لا يزال هيدروجيل اللحمية في شكل سائل. قم بإزالة أي بقايا هيدروجيل قد تتسرب من أعلى الحجرة المفتوحة باستخدام شفاط. قم بتجميع جميع رقائق البطاطس في أطباق بتري منفصلة مع غطاء أنبوب مخروطي مملوء بالماء كما هو موضح سابقا.واحتضان جميع أطباق بتري عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 90 دقيقة. في نهاية الحضانة ، أعد الرقائق مرة أخرى تحت خزانة السلامة الحيوية وقم بإزالة الطوابع برفق باستخدام ملاقط دقيقة لتقليل مخاطر إتلاف الهيدروجيل. بمجرد أن تصل الخلايا المستزرعة إلى التقاء 80٪ إلى 90٪ ، قم بفصل الخلايا باستخدام إجراءات الإنزيم المحللة للبروتين على النحو الموصى به من قبل مزود الخلية.بعد التفكك ، قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا الظهارية إلى كثافة شظايا الخلية المناسبة كما هو موضح في المخطوطة. لزرع الخلية الظهارية ، انقل الرقائق من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية وشطف السطح اللحمي ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الظهارية الطازجة لإزالة أي فائض من محلول الطلاء. بمجرد استنشاق وسط الشطف ، قم بزرع سطح الهيدروجيل ب 50 ميكرولترا من تعليق الخلية الظهارية باستخدام كثافة الخلية المناسبة ، ثم انقل الرقائق مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة ساعتين.لإزالة الحطام الخلوي ، اشطف سطح الهيدروجيل برفق باستخدام وسيط زراعة الخلايا مرتين ، وقم بتحديث الوسط عن طريق التعقيم في حاويات محكمة الغلق قابلة للتعقيم ، وقم بتوصيل الرقائق بالمضخة التمعجية. أوقف المضخة التمعجية مؤقتا ، وافصل الرقائق بعناية عن المضخة ، واستخرج حامل غلاف الرقاقة. بعد نقل الرقائق من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية ، قم بإزالة حجم الوسط الأيسر في الخزان العلوي.بعد ذلك ، قم بشفط كل الوسط من قناة الموائع الدقيقة العلوية برفق وقم بتثبيت أنبوب الموائع الدقيقة القصير المتصل بالمداخل العلوية باستخدام مشابك الموثق لتقليل تبخر الوسائط وصيانة واجهة الهواء والسائل ، أو ALI. ضع الشريحة المفتوحة على حامل الإسكان مرة أخرى في الحاضنة. أعد توصيل الرقائق بالمضخة التمعجية واستأنف التدفق عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية.شطف غرفة الأوعية الدموية مع وسط زراعة الخلايا البطانية ثم البذور 25 ميكرولتر من تعليق الخلايا البطانية. اقلب الرقائق رأسا على عقب للسماح للخلايا البطانية بالالتصاق بالسطح العلوي لغرفة الموائع الدقيقة. ضع الرقائق في أطباق بتري.ضعها مرة أخرى في الحاضنة كما هو موضح سابقا واترك الخلايا البطانية تلتصق لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة ، انقل الرقائق من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية وشطف قناة الأوعية الدموية بوسط زراعة الخلايا البطانية مرتين لإزالة الحطام الخلوي. ضع الرقائق بشكل مسطح لتسهيل التصاق الخلايا البطانية بالسطح السفلي للقناة الوعائية.املأ خزان وسط الأوعية الدموية بوسط زراعة الخلايا الوعائية المفرغة تحت خزانة السلامة الحيوية. ضع الرقائق مرة أخرى داخل حامل غلاف الرقائق وأعد توصيل الرقائق بالخزانات المتوسطة من أحد طرفيها وبالمضخة التمعجية من الطرف الآخر. افحص وصلات الموائع الدقيقة للتأكد من توصيل جميع الرقائق بشكل صحيح وعدم وجود قطرات مرئية من التنقيط المتوسط.بعد ذلك ، استأنف تدفق السوائل عن طريق بدء تشغيل المضخة التمعجية. يتم تصور سطح الهلام الدقيق مع الخلايا وبدونها. كشف التحليل النسيجي عن بشرة طبقية ناضجة متعددة الطبقات متباينة على الرقاقة.أظهرت صورة المنظر العلوي لرقاقة الجلد وجود الخلايا الليفية داخل طبقة الجلد. أظهر PECAM-1 و VE-cadherin و von Willebrand تمايز الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية المزروعة بشكل مشترك في رقاقة الجلد المفتوحة. أظهر MUC5AC ، ألفا وبيتا توبولين ، بروتين خلية الكلورو 16 ، p63 ، و ZO-1 تلطيخ الفلورسنت ظهارة مجرى الهواء الناضجة.لوحظت أهداب الضرب والظهارة الطبقية الزائفة الناضجة المتمايزة على رقاقة مجرى الهواء المفتوحة. أظهر تلطيخ الفلورسنت من النوع الأول والنوع الثاني و E-cadherin وجود خلايا رئوية ناضجة على الرقاقة. كشف المجهر الإلكتروني عن وجود الزغابات الدقيقة والحويصلات الليزوزومية ، وهو دليل على النمط الظاهري السنخي الناضج.أظهر التحليل النسيجي وجود خلايا حرشفية مسطحة تتفق مع النمط الظاهري من النوع الأول ، وخلايا شبيهة بالحصى مكعبة متماسكة مع النمط الظاهري من النوع الثاني ، والخلايا الليفية داخل الطبقة الجلدية. تم تأكيد وجود الخلايا المعوية والكأس الناضجة من خلال تلطيخ الميوسين 2 و E-cadherin. أكدت الخلايا الليفية داخل الطبقة الجلدية وجود ظهارة عمودية بسيطة.يجب أن تكون جميع الكواشف باردة ويجب شطف أسطح الجل بشكل كاف للحصول على سطح مستو. من المهم إزالة أي خلايا وحطام غير ملتصق للحصول على التصاق متساو للخلايا وطبقة أحادية اللون مدمجة وجدار وعائي. يمكن استخدام نهج مماثل لتوليد أنواع أخرى من نماذج الأعضاء الظهارية ، مثل الأمعاء والرئة ، لتقييم كيفية تأثير أدوية معينة أو عوامل بيئية على توازن الأنسجة البشرية ، مع التركيز بشكل خاص على وظيفة الحاجز الظهاري والأوعية الدموية.مع سهولة الوصول إلى مرحلة الفعالية في حجرة السدى ، يمكن للبحث الآن إنشاء أنماط وجه محددة وإعادة إنتاج بنية الأنسجة الوظيفية ، مثل cryptviveoli ، والتي يصعب تحقيقها مع الأجهزة الأخرى.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

الخلوي الجماعي: بروتوكول لضبط اليومية وعينات الخلايا تشغيل عداد الكريات الشامل على CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

رقاقة متعدد الجهاز - A منصة ميكروفلويديك لفترة طويلة Coculture متعدد الأنسجة

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

عزل خلايا ورم القولون الإنسان الأساسية من الأنسجة الجراحية وزراعة بشكل مباشر على لينة مرنة ركائز للالجر الخلوي

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

بناء المهندسة القلب الأنسجة تعريف الإنسان لدراسة آليات العلاج الخلوي القلب

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

تحسين 2D و 3D الجلد<em&gt; في المختبر</em&gt; نماذج عن طريق الجزيئات الازدحام

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

توصيف النشاط الحيوي للأنسجة لينة الإنسان عن طريق المسافة البادئة واختبار الشد

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد لتحليل الوظيفة المناعية لأنسجة الزرع المشرحة

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

جيل من نموذج مبسط ثلاثي الأبعاد للبشرة على رقاقة في منصة Micromachined Microfluidic

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Quantification of Mouse Heart Left Ventricular Function, Myocardial Strain, and Hemodynamic Forces by Cardiovascular Magnetic Resonance Imaging

القياس الكمي لوظيفة البطين الأيسر لقلب الفأر، وسلالة عضلة القلب، والقوى الديناميكية الدموية عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي القلبي الوعائي

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations ...