Name: reconstituting cytoarchitecture and function of human epithelial tissues on an open-top organ-chip
Uploaded: 2023-02-17T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip at JoVE.com

Humane koloroder blev opnået fra tarmresektioner i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Biosafety Committee of the Cincinnati Children's Hospital (IBC 2017-2011).
1. Aktivering af Surface
<ol><li>Forberedelse af aktiveringsbuffer<ol><li>Tværbindingsmidlet og opløsningsmiddelbufferreagenserne anbringes under biosikkerhedsskabet (BSC), og lad dem ekvilibrere ved stuetemperatur (RT) i 10 minutter før brug.</li>
		<li>5 mg tværbinding rekonstitueres i 5 m...

<ol>
	<li>Van Norman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+animal+studies+for+predicting+toxicity+in+clinical+trials:+Is+it+time+to+rethink+our+current+approach.">Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).</li><li>Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+the+principles+of+the+3Rs+of+animal+testing+at+CDER:+Past,+present+and+future.">Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).</li><li>Mosig, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models:+New+opportunities+for+biomedical+research.">Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research.</a> Future Science OA. 3 (2), (2017).</li><li>Al&#233;p&#233;e, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+of+3D+cultures+(organs-on-a-chip)+in+safety+testing+and+pathophysiology.">State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology.</a> Altex. 31 (4), 441-477 (2014).</li><li>MacArron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research.">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).</li><li>Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+based+in+vitro+test+systems+for+anticancer+drug+screening.">Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).</li><li>Mao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+type+II+cells+in+primary+culture.">Human alveolar epithelial type II cells in primary culture.</a> Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).</li><li>Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+significantly+alters+gene+expression+profiles+and+reduces+differences+between+myometrial+and+fibroid+smooth+muscle+cells.">In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells.</a> Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).</li><li>Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+tissue+stiffness+and+bioadhesivity:+Advanced+biomaterials+to+model+tumor+microenvironments+and+drug+resistance.">Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance.</a> Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).</li><li>Nawroth, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+Lung-on-Chips:+The+best+of+both+worlds.">Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2d+to+3d+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Kapa&#322;czy&#324;ska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-component+radiation+survival+curve+using+an+in+vitro+tumour+model.">A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model.</a> International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).</li><li>Chandra, P., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+extracellular+microenvironment+for+modulating+stem+cell+behaviors.">Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors.</a> Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).</li><li>Nicolas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+extracellular+matrix+mimics:+Fundamental+concepts+and+role+of+materials+chemistry+to+influence+stem+cell+fate.">3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate.</a> Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).</li><li>Brassard, J. A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+self-organization+to+build+better+organoids.">Engineering stem cell self-organization to build better organoids.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Mantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+hydrogels+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Materials. 12 (20), 3323 (2019).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning.">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+cues+as+master+regulators+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).</li><li>Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+chips+and+microphysiological+systems+for+disease+modeling+and+drug+testing.">Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing.</a> Micromachines. 12 (2), 139 (2021).</li><li>Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-chip:+A+new+paradigm+for+drug+development.">Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).</li><li>Varone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organ-chip+system+emulates+three-dimensional+architecture+of+the+human+epithelia+and+the+mechanical+forces+acting+on+it.">A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it.</a> Biomaterials. 275, 120957 (2021).</li><li>Hassell, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organ+chip+models+recapitulate+orthotopic+lung+cancer+growth,+therapeutic+responses,+and+tumor+dormancy+in+vitro.">Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro.</a> Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking. 1897, 253-268 (2019).</li><li>Grant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+drug+concentrations+in+PDMS+microfluidic+organ+chips.">Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips.</a> Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).</li><li>Barrile, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+recapitulates+thrombosis+Induced+by+an+anti-CD154+monoclonal+antibody:+Translational+potential+of+advanced+microengineered+systems.">Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+human+lung+alveolus-on-a-chip+model+of+intravascular+thrombosis+for+assessment+of+therapeutics.">Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).</li><li>Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+polydimethylsiloxane:+Alternative+materials+for+fabrication+of+organ-on-a-chip+devices+and+microphysiological+systems.">Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).</li><li>Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+human+physiology+on-chip:+Historical+perspectives+and+future+directions.">Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions.</a> Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).</li></ol>

Open-Top Chip repræsenterer en muliggørende platform til at undersøge det komplekse cellulære samspil, der forekommer mellem endotel, stroma, og epitel i et kontrolleret mikromiljø i realtid. Denne teknologi giver kritiske fordele i forhold til konventionelle organotypiske og organoide kulturer, såsom integration af fysiske og biokemiske signaler, der er relevante for at rekonstituere det humane vævs mikromiljø, herunder fluidforskydning (flow), cyklisk strækning og rekonstruktion af epiteloverfladetopografien o...

Historisk set har forskere været afhængige af prækliniske dyreforsøg til lægemiddelopdagelse, men et stigende antal af disse metoder er blevet stillet spørgsmålstegn ved på grund af dårlig korrelation med humant resultat1. Implementeringen af "3R"-principperne om at erstatte, reducere og forfine dyreforsøg opfordrer forskere til at finde nye in vitro-alternative metoder til støtte for præklinisk lægemiddel- og kemisk toksikologisk risikovurdering2. Imidlertid mangler mange in vitro-modeller, der er udviklet til dato, den biologiske arkitektur, cellulære kompleksitet og det mekaniske miljø, der er nødvendigt for at rekapitulere den dynamiske natur af menneskelige levende organer 3,4.
Konventionelle in vitro prækliniske systemer anvender typisk 2D-monokulturer af humane celler dyrket på en stiv plastoverflade. Disse metoder giver et værktøj til at gennemføre enkle mekanistiske undersøgelser og muliggør hurtig screening af lægemiddelkandidater. På grund af deres relativt lave omkostninger og høje robusthed parres 2D-modeller ofte med automatiske high-throughput-systemer og anvendes til hurtig identifikation af potentielle lægemiddelkandidater i den tidlige fase af lægemiddeludviklingsprocessen 5,6. Sådanne 2D-modeller giver imidlertid ikke en translationel tilgang til modellering af vævsniveau, organniveau eller systemiske reaktioner på terapeutiske kandidater, hvilket er nødvendigt for nøjagtige forudsigelser af lægemiddelsikkerhed og effektivitet i det prækliniske stadium af deres udvikling. Fladcellekulturer rekapitulerer ikke det oprindelige vævsmikromiljø, herunder det komplekse flercellede samspil, biomekaniske egenskaber og tredimensionelle (3D) arkitektur af humant væv7. Celler, der vokser på en plan overflade, erhverver ofte ikke en moden fænotype og kan derfor ikke reagere på farmakologiske stimuli, som de ville i det oprindelige væv. For eksempel udviser primære humane alveolære epitelceller dyrket in vitro en pladefænotype og mister vigtige fænotypiske markører, herunder overfladeaktive proteiner C og B (SP-C og SP-B)8. Ud over utilstrækkelig differentiering bliver primære celler ofte ufølsomme over for biologiske stressfaktorer in vitro, da visse biokemiske veje forbundet med vævsbetændelse bliver ikke-funktionelle9. Et sådant tab af cellefunktion synes primært at være forbundet med brugen af stive substrater samt manglen på opløselige faktorer, der naturligt frigives af vævsspecifikke stromale celler såsom lungefibroblaster og glatte muskelceller10,11.
At forstå, at manglen på kemo-fysisk og biologisk kompleksitet begrænser cellernes fysiologiske adfærd in vitro, har fremmet udviklingen af mere sofistikerede flercellede modeller, som har vist sig bedre at fange kompleksiteten af humant væv uden for kroppen12,13. Siden oprettelsen af de første samkulturmodeller i begyndelsen af 1970'erne14 har introduktionen af syntetiske og naturlige hydrogeler signifikant forbedret evnen til at efterligne indfødte vævsmikromiljøer og er blevet et uvurderligt værktøj til at drive cellulær differentiering, styre cellernes selvorganisering i vævslignende strukturer og genoprette indfødte vævsfunktioner15,16. For eksempel, når de dyrkes i det passende 3D-stillads, kan menneskelige celler selv arrangere sig i funktionelle strukturer såsom sfæroider eller organoider, der udtrykker stamcellemarkører, og er i stand til selvfornyelse17. I modsætning hertil ældes humane celler (inklusive stamceller), når de dyrkes på traditionelle 2D-substrater, hurtigt og gennemgår ældning efter et par passager18. Derudover kan hydrogeler "skræddersys" til at matche specifikke vævsegenskaber såsom porøsitet, porestørrelse, fibertykkelse, viskoelasticitet, topografi og stivhed eller yderligere konstrueres med vævsafledte cellulære komponenter og / eller bioaktive molekyler, der muliggør emulering af de fysiologiske eller patologiske tilstande19,20. På trods af deres enorme potentiale for lægemiddeltest rekapitulerer 3D-hydrogelbaserede modeller, der anvendes i farmaceutisk forskning, ikke fuldt ud den komplekse cytoarkitektur af in vivo-vævene og mangler vigtige hæmodynamiske og mekaniske stimuli, der normalt er til stede i menneskekroppen, herunder hydrostatisk tryk, cyklisk strækning og væskeforskydning21.
Mikrofysiologiske systemer (MPS'er) såsom Organs-on-chips (OOC'er) er for nylig opstået som værktøjer, der er i stand til at fange komplekse fysiologiske reaktioner in vitro22,23. Disse modeller anvender ofte brugen af mikrofluidiske platforme, som muliggør modellering af levende organers dynamiske mikromiljø.
Vi har kombineret principperne for 3D-vævsbioteknologi og mekanobiologi for at skabe en Open-Top Chip-model af komplekst humant epitelvæv. Dette gjorde det muligt for os nøje at rekapitulere det multicellulære og dynamiske mikromiljø af epitelvæv. Dette omfatter vævsspecifikke biokemiske og biomekaniske signaler, der forekommer naturligt i levende organer, men som ofte overses af traditionelle in vitro-modeller 24. Open-Top Chip indeholder to rum: et vaskulært rum (figur 1A) og et stromaltum (figur 1B) adskilt af en porøs membran, hvilket muliggør diffusion af næringsstoffer mellem de to kamre (figur 1C). Det vaskulære rum udsættes for kontinuerlig væskestrøm for at rekapitulere fysiologisk forskydningsspænding, mens stromalkammerets strækbare design muliggør modellering af den mekaniske belastning forbundet med vejrtrækningsbevægelser eller intestinal peristaltik. Det stromale rum huser det justerbare 3D-hydrogelstillads designet til at understøtte den fysiologiske vækst af vævsspecifikke fibroblaster. Det har et aftageligt låg, der letter etableringen af en luft-væske-grænseflade, en tilstand, der muliggør større emulering af human fysiologi af slimhindevæv samt direkte adgang til vævet til administration af lægemidler direkte på epitellaget. Supplerende figur 1 viser nogle af nøglekomponenterne i Open-Top Chip-designet, herunder dimensioner og biologiske rum (supplerende figur 1A-D) samt de vigtigste tekniske trin, der er beskrevet i denne protokol (supplerende figur 1E).
Perfusion af Open-Top Chip opnås med en programmerbar peristaltisk pumpe (figur 1D). Den peristaltiske pumpeopsætning gør det muligt at perfusere 12 Open-Top chips samtidigt. De fleste inkubatorer kan huse to opsætninger, der muliggør dyrkning af op til 24 chips pr. Inkubator. Mekanisk strækning opnås ved hjælp af en specialfremstillet programmerbar vakuumtrykregulator (figur 1E). Den består af en elektropneumatisk vakuumregulator, der styres elektronisk af en digital-til-analog konverter. Med andre ord genererer den elektropneumatiske vakuumregulator en sinusformet vakuumprofil med en amplitude og frekvens, der bestemmes af brugeren. Cyklisk belastning fra 0% til 15% genereres ved at anvende negativt tryk på vakuumkanalen i Open-Top Chip ved en amplitude fra 0 til -90 kPa og en frekvens på 0, 2 Hz. Det er et skræddersyet system svarende til den kommercielt tilgængelige Flexcell Strain Unit, der tidligere er vedtaget og beskrevet i andre papirer25. For at efterligne den mekaniske vævsdeformation, der for eksempel er forbundet med lungens vejrtrækningsbevægelse eller tarmens peristaltik, anvender den pneumatiske aktuator sinusformede vakuum-/belastningsbølger, hvis størrelse og amplitude kan justeres for at matche det fysiologiske belastningsniveau og frekvens, som menneskelige celler oplever i deres oprindelige væv.
Her beskriver vi en effektiv og reproducerbar metode til konstruktion og dyrkning af organotypiske epitelækvivalenter på en prototype Open-Top Chip-platform. Det tillader generering af komplekse organmodeller såsom hud, alveolus, luftveje og tyktarm, samtidig med at der integreres en vaskulær væskestrøm og mekanisk strækning. Vi vil skitsere vigtige tekniske aspekter, der skal overvejes, når vi implementerer principper for vævsteknik til generering af komplekse epitelmodeller. Vi vil diskutere fordele og mulige begrænsninger ved det nuværende design.
En oversigt over de vigtigste trin, der anvendes til at opnå modning af væv og organer, herunder flow- og strækparametre, er rapporteret i: figur 2 for huden, figur 3 for alveolen, figur 4 for luftvejene og figur 5 for tarmen. Yderligere oplysninger om mediesammensætning og reagenser, der anvendes til dyrkning af de forskellige organmodeller, findes i de supplerende tabeller (supplerende tabel 1 for huden; Supplerende tabel 2 for alveolen; Supplerende tabel 3 for luftvejene og supplerende tabel 4 for tarmen).

reconstituting cytoarchitecture and function of human epithelial tissues on an open-top organ-chip

Næsten alle menneskelige organer er foret med epitelvæv, der omfatter et eller flere lag tæt forbundne celler organiseret i tredimensionelle (3D) strukturer. En af epitelens hovedfunktioner er dannelsen af barrierer, der beskytter understregningsvævene mod fysiske og kemiske fornærmelser og infektiøse stoffer. Derudover medierer epitel transporten af næringsstoffer, hormoner og andre signalmolekyler, hvilket ofte skaber biokemiske gradienter, der styrer cellepositionering og opdeling i organet. På grund af deres centrale rolle i bestemmelsen af organstruktur og funktion er epitel vigtige terapeutiske mål for mange menneskelige sygdomme, der ikke altid fanges af dyremodeller. Ud over de åbenlyse forskelle mellem arter forværres gennemførelsen af forskningsundersøgelser af epitelens barrierefunktion og transportegenskaber hos dyr yderligere af vanskeligheden ved at få adgang til disse væv i et levende system. Mens todimensionelle (2D) humane cellekulturer er nyttige til at besvare grundlæggende videnskabelige spørgsmål, giver de ofte dårlige in vivo-forudsigelser . For at overvinde disse begrænsninger har der i det sidste årti vist sig en overflod af mikrokonstruerede biomimetiske platforme, kendt som organer-på-en-chip, som et lovende alternativ til traditionelle in vitro - og dyreforsøg. Her beskriver vi en Open-Top Organ-Chip (eller Open-Top Chip), en platform designet til modellering af organspecifikke epitelvæv, herunder hud, lunger og tarme. Denne chip giver nye muligheder for at rekonstituere den multicellulære arkitektur og funktion af epitelvæv, herunder evnen til at genskabe en 3D-stromalkomponent ved at inkorporere vævsspecifikke fibroblaster og endotelceller i et mekanisk aktivt system. Denne Open-Top Chip giver et hidtil uset værktøj til at studere epitel / mesenkymale og vaskulære interaktioner på flere opløsningsskalaer, fra enkeltceller til flerlags vævskonstruktioner, hvilket muliggør molekylær dissektion af den intercellulære krydstale af epiteliserede organer i sundhed og sygdom.

Mikromønster på overfladen Mikromønster af den ekstracellulære matrix (ECM) kan bruges til at replikere den rumlige konfiguration af tarmkryptgrænsefladen. Open-Top Chip-konfigurationen kan ændres til at integrere mikromønstrede frimærker, der er specielt designet til at efterligne den naturlige topografi af grænsefladen mellem kolon og epitel (figur 6A, B) og tarmkrypterne i mikrometerskala (figur 6C-E</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip at JoVE.com

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Denne protokol beskriver Open-Top Organ-Chips kapaciteter og væsentlige kulturmetoder til vellykket etablering og modning af fuldtykkelse organ-on-chip-kulturer af primære væv (hud, alveolus, luftveje og tarm), hvilket giver mulighed for at undersøge forskellige funktionelle aspekter af den humane epitel/mesenkymale og vaskulære nichegrænseflade in vitro.

Rekonstituering af cytoarkitektur og funktion af humant epitelvæv på en åben organchip

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

Traditionelle diffusale kulturmetoder undlader ofte at rekapitulere det komplekse miljø i levende organer, hvilket fører til tab af vævsspecifikke markører og funktioner. Vi har udviklet en open-top chip, der kombinerer diffusal kultur og mikrofluidisk princip for at efterligne mikromiljøet i epitelvæv tæt. Ved at inkludere biokemiske og biomekaniske signaler, der er naturligt til stede i levende organer, men ofte overses af traditionelle in vitro-modeller, repræsenterer open-top-chippen et bedre alternativ mellem lukkede systemer.Demonstrerer proceduren vil være Adya Panchal i dag, en forskerstuderende i mit laboratorium. Til at begynde med skal du bringe de nødvendige reagenser under biosikkerhedsskabet på is. Kultur vævsspecifikke mesenkymale celler for at opnå 80% til 90% sammenløb og derefter dissociere cellerne ved hjælp af trypsin eller andre metoder i henhold til producentens anbefalinger.Pellet cellerne ved 250 g i fem minutter ved 24 grader Celsius. Resuspender cellepillen i 225 mikroliter hver af iskold 10X EMEM og rekonstruktionsbuffer. Bland cellerne ved pipettering og tilsæt 1.800 mikroliter iskold kollagen 1-opløsning.Bland derefter pre-gelopløsningen på is ved at pipettere op og ned fem til seks gange. Neutraliser forgelopløsningen med 18 mikroliter af et normalt natriumhydroxid, bland forsigtigt ved pipettering, og pipette derefter 150 mikroliter cellebelastet hydrogel ind i det centrale kammer i den åbne chip, samtidig med at bobler undgås. Gruppér chipsene i separate petriskåle, herunder en centrifugerørhætte fyldt med to milliliter sterilt dobbeltdestilleret vand i hver petriskål, og inkuber petriskålene ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.For at udføre overflademikromønster af stromalhydrogelen pipetteres 20 mikroliter af den neutraliserede Collagen 1-forgelopløsning på den mønstrede overflade af et sterilt 3D-trykt stempel og indsætter stemplet inde i det åbne kammer, mens stromalhydrogelen stadig er i flydende form. Fjern eventuelle hydrogelrester, der kan spildes fra toppen af det åbne kammer ved hjælp af en aspirator. Gruppér alle chips i separate petriskåle med en konisk rørhætte fyldt med vand som vist tidligere.Og inkuber alle petriskåle ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 90 minutter. Ved afslutningen af inkubationen bringes chipsene tilbage under biosikkerhedsskabet og fjernes forsigtigt stemplerne ved hjælp af præcisionspincet for at reducere risikoen for at beskadige hydrogelen. Når de dyrkede celler opnår 80% til 90% sammenløb, adskilles cellerne ved hjælp af proteolytiske enzymprocedurer som anbefalet af celleudbyderen.Efter dissociation pelleteres cellerne ved centrifugering, og epitelcellerne resuspenderes til den passende cellefragmenttæthed som beskrevet i manuskriptet. For at frø epitelcellen overføres chipsene fra inkubatoren til biosikkerhedsskabet og skylles stromaloverfladen tre gange med 100 mikroliter frisk epitelcellekulturmedium for at fjerne overskydende belægningsopløsning. Når skyllemediet er aspireret, frø hydrogeloverfladen med 50 mikroliter af epitelcellesuspensionen ved hjælp af passende celletæthed, og overfør derefter chipsene tilbage i inkubatoren i to timer.For at fjerne cellulært affald skylles hydrogeloverfladen forsigtigt med cellekulturmediet to gange, opdateres mediet ved autoklavering i forseglede autoklaverbare beholdere og tilsluttes chipsene til den peristaltiske pumpe. Sæt den peristaltiske pumpe på pause, frakobl forsigtigt chipsene fra pumpen, og træk chiphusholderen ud. Efter overførsel af chips fra inkubatoren til biosikkerhedsskabet fjernes volumenet af mediet tilbage i topreservoiret.Derefter suges alt mediet forsigtigt fra den øverste mikrofluidiske kanal, og klemmer det korte mikrofluidiske rør, der er forbundet til de øverste indløb, ved hjælp af bindeclips for at reducere mediefordampning og vedligeholdelse af luft-væske-interface eller ALI. Placer den åbne chip på husbæreren tilbage i inkubatoren. Tilslut chipsene til den peristaltiske pumpe igen, og genoptag flowet ved at starte den peristaltiske pumpe.Skyl vaskulærkammeret med endotelcellekulturmedium og frø derefter 25 mikroliter endotelcellesuspension. Vend chipsene på hovedet for at tillade endotelceller at fastgøre til den øvre overflade af det mikrofluidiske kammer. Gruppér chipsene i petriskåle.Placer dem tilbage i inkubatoren som vist tidligere, og lad endotelcellerne vedhæfte i en time. Ved afslutningen af inkubationen overføres chipsene fra inkubatoren til biosikkerhedsskabet og skylles vaskulærkanalen med endotelcellekulturmedium to gange for at fjerne cellulært affald. Læg chipsene fladt for at lette vedhæftningen af endotelcellerne til bunden af vaskulærkanalen.Fyld beholderen til vaskulære medier med det afgassede vaskulære cellekulturmedium under biosikkerhedsskabet. Placer chipsene tilbage inde i chiphusbæreren, og tilslut chipsene igen til mediumreservoirerne i den ene ende og til den peristaltiske pumpe i den anden. Undersøg de mikrofluidiske forbindelser for at sikre, at alle chips er korrekt tilsluttet, og at der ikke drypper synlige dråber af medium.Genoptag derefter væskestrømmen ved at starte den peristaltiske pumpe. Den mikromønstrede geloverflade med og uden celler visualiseres. Histologisk analyse afslørede moden flerlags stratificeret epidermis differentieret på chip.Det øverste billede af hudchippen viste tilstedeværelsen af fibroblasterne inde i dermallaget. PECAM-1, VE-cadherin og von Willebrand viste differentieringen af humane mikrovaskulære endotelceller dyrket sammen i den åbne hudchip. MUC5AC, alfa- og beta-tubulin, klorcelleprotein 16, p63 og ZO-1 fluorescerende farvning viste modent luftvejsepitel.De slående cilia og differentieret modent pseudostratificeret epitel blev observeret på open-top luftvejschip. Type I, Type II og E-cadherin fluorescerende farvning viste tilstedeværelsen af modne pneumocytter på chip. Elektronmikroskopi afslørede tilstedeværelsen af mikrovilli og lysosomale vesikler, tegn på moden alveolær fænotype.Den histologiske analyse viste tilstedeværelsen af flade pladeceller i overensstemmelse med type I-fænotypen og kuboide brostenslignende celler i overensstemmelse med type II-fænotypen og fibroblaster inde i dermallaget. Tilstedeværelsen af enterocytter og den modne bæger blev bekræftet af mucin 2 og E-cadherin farvning. Fibroblasterne inde i det dermale lag bekræftede tilstedeværelsen af et simpelt søjleepitel.Alle reagenser skal være kolde, og gelens overflader skal skylles tilstrækkeligt for at opnå en jævn overflade. Det er vigtigt at fjerne eventuelle ikke-klæbende celler og snavs for at opnå jævn cellevedhæftning og et kompakt dårligt monolag og vaskulær væg. En lignende tilgang kan anvendes til at generere andre typer epitelorganmodeller, såsom tarm og lunge, for at vurdere, hvordan specifikke lægemidler eller miljøfaktorer kan påvirke homeostase af humant væv med særlig vægt på epitel- og vaskulær barrierefunktion.Med nem adgang til stromarummets effektivitetsfase kan forskning nu generere specifikke ansigtsmønstre og reproducere funktionel vævsarkitektur, såsom cryptviveoli, hvilket er vanskeligt at opnå med andre enheder.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Mass Cytometry: Protokol for Daily Tuning og Running celleprøver på en CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-orgel Chip - En Mikrofluid platform for langsigtet Multi-væv cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolering af primære humane Colon tumorceller fra Kirurgiske Væv og Dyrkning dem direkte på Soft Elastic Substrater for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion af Defineret Humane Engineered hjertevæv at studere Mekanismer for Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Forbedring 2D og 3D Skin<em&gt; In vitro</em&gt; Modeller Brug Macromolecular Fortrængning

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Engineering Tredimensionale epitelvæv indlejret i ekstracellulær matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Biomekanisk karakterisering af menneskelige bløddele Brug Indrykning og trækprøvning

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Højdimensionalitetsflowcytometri til immunfunktionsanalyse af dissekeret implantatvæv

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Generering af en forenklet tredimensionel skin-on-a-chip-model i en mikromaskiner med mikrofluidisk platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Quantification of Mouse Heart Left Ventricular Function, Myocardial Strain, and Hemodynamic Forces by Cardiovascular Magnetic Resonance Imaging

Kvantificering af mus hjerte venstre ventrikulær funktion, myokardiestamme, og hæmodynamiske kræfter ved hjerte-kar-magnetisk resonans imaging

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations ...