Name: reconstituting cytoarchitecture and function of human epithelial tissues on an open-top organ-chip
Uploaded: 2023-02-17T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip at JoVE.com

Les colonoïdes humains ont été obtenus à partir de résections intestinales conformément aux directives du Comité institutionnel de biosécurité de l’hôpital pour enfants de Cincinnati (IBC 2017-2011).
1. Activation de Surface
<ol><li>Préparation du tampon d’activation<ol><li>Placer les réactifs tampons de réticulation et de solvant sous l’enceinte de biosécurité (ESB) et les laisser s’équilibrer à température ambiante (RT) pendant 10 minutes avant ut...

<ol>
	<li>Van Norman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+animal+studies+for+predicting+toxicity+in+clinical+trials:+Is+it+time+to+rethink+our+current+approach.">Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).</li><li>Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+the+principles+of+the+3Rs+of+animal+testing+at+CDER:+Past,+present+and+future.">Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).</li><li>Mosig, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models:+New+opportunities+for+biomedical+research.">Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research.</a> Future Science OA. 3 (2), (2017).</li><li>Al&#233;p&#233;e, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+of+3D+cultures+(organs-on-a-chip)+in+safety+testing+and+pathophysiology.">State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology.</a> Altex. 31 (4), 441-477 (2014).</li><li>MacArron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research.">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).</li><li>Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+based+in+vitro+test+systems+for+anticancer+drug+screening.">Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).</li><li>Mao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+type+II+cells+in+primary+culture.">Human alveolar epithelial type II cells in primary culture.</a> Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).</li><li>Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+significantly+alters+gene+expression+profiles+and+reduces+differences+between+myometrial+and+fibroid+smooth+muscle+cells.">In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells.</a> Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).</li><li>Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+tissue+stiffness+and+bioadhesivity:+Advanced+biomaterials+to+model+tumor+microenvironments+and+drug+resistance.">Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance.</a> Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).</li><li>Nawroth, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+Lung-on-Chips:+The+best+of+both+worlds.">Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2d+to+3d+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Kapa&#322;czy&#324;ska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-component+radiation+survival+curve+using+an+in+vitro+tumour+model.">A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model.</a> International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).</li><li>Chandra, P., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+extracellular+microenvironment+for+modulating+stem+cell+behaviors.">Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors.</a> Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).</li><li>Nicolas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+extracellular+matrix+mimics:+Fundamental+concepts+and+role+of+materials+chemistry+to+influence+stem+cell+fate.">3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate.</a> Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).</li><li>Brassard, J. A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+self-organization+to+build+better+organoids.">Engineering stem cell self-organization to build better organoids.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Mantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+hydrogels+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Materials. 12 (20), 3323 (2019).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning.">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+cues+as+master+regulators+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).</li><li>Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+chips+and+microphysiological+systems+for+disease+modeling+and+drug+testing.">Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing.</a> Micromachines. 12 (2), 139 (2021).</li><li>Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-chip:+A+new+paradigm+for+drug+development.">Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).</li><li>Varone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organ-chip+system+emulates+three-dimensional+architecture+of+the+human+epithelia+and+the+mechanical+forces+acting+on+it.">A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it.</a> Biomaterials. 275, 120957 (2021).</li><li>Hassell, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organ+chip+models+recapitulate+orthotopic+lung+cancer+growth,+therapeutic+responses,+and+tumor+dormancy+in+vitro.">Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro.</a> Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking. 1897, 253-268 (2019).</li><li>Grant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+drug+concentrations+in+PDMS+microfluidic+organ+chips.">Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips.</a> Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).</li><li>Barrile, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+recapitulates+thrombosis+Induced+by+an+anti-CD154+monoclonal+antibody:+Translational+potential+of+advanced+microengineered+systems.">Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+human+lung+alveolus-on-a-chip+model+of+intravascular+thrombosis+for+assessment+of+therapeutics.">Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).</li><li>Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+polydimethylsiloxane:+Alternative+materials+for+fabrication+of+organ-on-a-chip+devices+and+microphysiological+systems.">Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).</li><li>Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+human+physiology+on-chip:+Historical+perspectives+and+future+directions.">Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions.</a> Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).</li></ol>

La puce Open-Top représente une plate-forme habilitante pour étudier l’interaction cellulaire complexe qui se produit entre l’endothélium, le stroma et l’épithélium dans un microenvironnement contrôlé, en temps réel. Cette technologie offre des avantages essentiels par rapport aux cultures organotypiques et organoïdes conventionnelles, tels que l’intégration de signaux physiques et biochimiques pertinents pour reconstituer le microenvironnement tissulaire humain, y compris le cisaillement fluidique (éc...

Historiquement, les scientifiques se sont appuyés sur des tests précliniques sur des animaux pour la découverte de médicaments, mais un nombre croissant de ces méthodes ont été remises en question en raison d’une faible corrélation avec les résultats humains1. La mise en œuvre des principes des « 3R » pour remplacer, réduire et affiner l’expérimentation animale incite les scientifiques à trouver de nouvelles méthodes alternatives in vitro pour soutenir l’évaluation préclinique des risques toxicologiques et chimiques2. Cependant, de nombreux modèles in vitro développés à ce jour n’ont pas l’architecture biologique, la complexité cellulaire et l’environnement mécanique nécessaires pour récapituler la nature dynamique des organes vivants humains 3,4.
Les systèmes précliniques in vitro conventionnels utilisent généralement des monocultures 2D de cellules humaines cultivées sur une surface en plastique rigide. Ces méthodes fournissent un outil pour mener des études mécanistiques simples et permettent un dépistage rapide des candidats médicaments. En raison de leur coût relativement faible et de leur grande robustesse, les modèles 2D sont souvent associés à des systèmes automatiques à haut débit et utilisés pour l’identification rapide de candidats médicaments potentiels au début du processus de développement de médicaments 5,6. Cependant, de tels modèles 2D ne fournissent pas d’approche translationnelle pour modéliser les réponses tissulaires, organiques ou systémiques aux candidats thérapeutiques, ce qui est nécessaire pour prédire avec précision l’innocuité et l’efficacité des médicaments au cours de la phase préclinique de leur développement. Les cultures de cellules plates ne récapitulent pas le microenvironnement tissulaire natif, y compris l’interaction multicellulaire complexe, les propriétés biomécaniques et l’architecture tridimensionnelle (3D) des tissus humains7. Les cellules qui se développent sur une surface plane n’acquièrent souvent pas de phénotype mature et, par conséquent, ne peuvent pas répondre aux stimuli pharmacologiques comme elles le feraient dans le tissu natif. Par exemple, les cellules épithéliales alvéolaires humaines primaires cultivées in vitro présentent un phénotype épidermoïde et perdent des marqueurs phénotypiques clés, y compris les protéines surfactantes C et B (SP-C et SP-B)8. En plus d’une différenciation insuffisante, les cellules primaires deviennent souvent insensibles aux facteurs de stress biologiques in vitro, car certaines voies biochimiques associées à l’inflammation tissulaire deviennent non fonctionnelles9. Une telle perte de fonction cellulaire semble être principalement associée à l’utilisation de substrats rigides ainsi qu’à l’absence de facteurs solubles naturellement libérés par les cellules stromales spécifiques aux tissus telles que les fibroblastes pulmonaires et les cellules musculaires lisses10,11.
Comprendre que l’absence de complexité chimio-physique et biologique limite le comportement physiologique des cellules in vitro a favorisé le développement de modèles multicellulaires plus sophistiqués, qui se sont avérés mieux saisir la complexité des tissus humains à l’extérieur du corps12,13. Depuis la création des premiers modèles de co-culture au début des années1970 14, l’introduction d’hydrogels synthétiques et naturels a considérablement amélioré la capacité d’imiter les microenvironnements tissulaires natifs et est devenue un outil inestimable pour stimuler la différenciation cellulaire, guider l’auto-organisation des cellules dans des structures tissulaires et restaurer les fonctions tissulaires natives15,16. Par exemple, lorsqu’elles sont cultivées dans l’échafaudage 3D approprié, les cellules humaines peuvent s’auto-organiser en structures fonctionnelles telles que des sphéroïdes ou des organoïdes, exprimant des marqueurs de cellules souches, et sont capables de s’auto-renouveler17. En revanche, les cellules humaines (y compris les cellules souches), lorsqu’elles sont cultivées sur des substrats 2D traditionnels, vieillissent rapidement et subissent une sénescence après quelques passages18. En outre, les hydrogels peuvent être « adaptés » pour correspondre à des propriétés tissulaires spécifiques telles que la porosité, la taille des pores, l’épaisseur des fibres, la viscoélasticité, la topographie et la rigidité, ou modifiés avec des composants cellulaires dérivés de tissus et/ou des molécules bioactives permettant l’émulation des conditions physiologiques ou pathologiques19,20. Malgré leur énorme potentiel pour les tests de médicaments, les modèles 3D à base d’hydrogel utilisés dans la recherche pharmaceutique ne récapitulent pas complètement la cytoarchitecture complexe des tissus in vivo et manquent de stimuli hémodynamiques et mécaniques importants normalement présents dans le corps humain, y compris la pression hydrostatique, l’étirement cyclique et le cisaillement des fluides21.
Les systèmes microphysiologiques (MPS) tels que les organes sur puce (OOC) sont récemment apparus comme des outils capables de capturer des réponses physiologiques complexes in vitro22,23. Ces modèles utilisent souvent l’utilisation de plates-formes microfluidiques, qui permettent de modéliser le microenvironnement dynamique des organes vivants.
Nous avons combiné les principes de la bio-ingénierie tissulaire 3D et de la mécanobiologie pour créer un modèle de puce à toit ouvert de tissu épithélial humain complexe. Cela nous a permis de récapituler de près le microenvironnement multicellulaire et dynamique des tissus épithéliaux. Cela inclut les indices biochimiques et biomécaniques spécifiques aux tissus naturellement présents dans les organes vivants, mais souvent négligés par les modèles in vitro traditionnels24. L’Open-Top Chip comprend deux compartiments : un compartiment vasculaire (Figure 1A) et un compartiment stromal (Figure 1B) séparés par une membrane poreuse, permettant la diffusion des nutriments entre les deux chambres (Figure 1C). Le compartiment vasculaire est exposé à un écoulement continu de fluide pour récapituler le stress physiologique de cisaillement, tandis que la conception extensible de la chambre stromale permet de modéliser la contrainte mécanique associée aux mouvements respiratoires ou au péristaltisme intestinal. Le compartiment stromal abrite l’échafaudage d’hydrogel 3D accordable conçu pour soutenir la croissance physiologique des fibroblastes spécifiques aux tissus. Il possède un couvercle amovible qui facilite l’établissement d’une interface air-liquide, une condition qui permet une plus grande émulation de la physiologie humaine des tissus muqueux ainsi qu’un accès direct au tissu pour administrer des médicaments directement sur la couche épithéliale. La figure supplémentaire 1 présente certains des éléments clés de la conception de la puce à toit ouvert, y compris les dimensions et les compartiments biologiques (figure supplémentaire 1A-D), ainsi que les principales étapes techniques décrites dans le présent protocole (figure supplémentaire 1E).
La perfusion de la puce Open-Top est réalisée à l’aide d’une pompe péristaltique programmable (Figure 1D). La configuration de la pompe péristaltique permet de perfuser simultanément 12 puces à toit ouvert. La plupart des incubateurs peuvent héberger deux configurations permettant la culture de jusqu’à 24 puces par incubateur. L’étirement mécanique est réalisé à l’aide d’un régulateur de pression à vide programmable sur mesure (Figure 1E). Il se compose d’un régulateur de vide électropneumatique contrôlé électroniquement par un convertisseur numérique-analogique. En d’autres termes, le régulateur de vide électropneumatique génère un profil de vide sinusoïdal avec une amplitude et une fréquence déterminées par l’utilisateur. Une déformation cyclique allant de 0% à 15% est générée en appliquant une pression négative au canal de vide de la puce Open-Top à une amplitude allant de 0 à -90 kPa et une fréquence de 0,2 Hz. Il s’agit d’un système sur mesure équivalent à l’unité de contrainte Flexcell disponible dans le commerce précédemment adoptée et décrite dans d’autres documents25. Pour imiter la déformation mécanique des tissus associée, par exemple, au mouvement respiratoire du poumon ou au péristaltisme de l’intestin, l’actionneur pneumatique applique des ondes sinusoïdales de vide/déformation dont l’amplitude et l’amplitude peuvent être ajustées pour correspondre au niveau physiologique de déformation et à la fréquence que les cellules humaines subissent dans leur tissu natif.
Ici, nous décrivons une méthode efficace et reproductible pour l’ingénierie et la culture d’équivalents d’épithélium organotypiques sur un prototype de plate-forme Open-Top Chip. Il permet la génération de modèles d’organes complexes tels que la peau, l’alvéole, les voies respiratoires et le côlon tout en intégrant un écoulement de fluide vasculaire et des étirements mécaniques. Nous décrirons les aspects techniques clés qui doivent être pris en compte lors de la mise en œuvre des principes de l’ingénierie tissulaire pour générer des modèles épithéliaux complexes. Nous discuterons des avantages et des limites possibles de la conception actuelle.
Un aperçu des principales étapes utilisées pour atteindre la maturation des tissus et des organes, y compris les paramètres d’écoulement et d’étirement, est présenté dans : Figure 2 pour la peau, Figure 3 pour l’alvéole, Figure 4 pour les voies respiratoires et Figure 5 pour l’intestin. Des informations supplémentaires concernant la composition des milieux et les réactifs utilisés pour la culture des différents modèles d’organes sont incluses dans les tableaux supplémentaires (tableau supplémentaire 1 pour la peau; Tableau supplémentaire 2 pour l’alvéole; Tableau supplémentaire 3 pour les voies respiratoires et Tableau supplémentaire 4 pour l’intestin).

reconstituting cytoarchitecture and function of human epithelial tissues on an open-top organ-chip

Presque tous les organes humains sont tapissés de tissus épithéliaux, comprenant une ou plusieurs couches de cellules étroitement connectées organisées en structures tridimensionnelles (3D). L’une des principales fonctions de l’épithélium est la formation de barrières qui protègent les tissus sous-jacents contre les agressions physiques et chimiques et les agents infectieux. En outre, l’épithélium intervient dans le transport des nutriments, des hormones et d’autres molécules de signalisation, créant souvent des gradients biochimiques qui guident le positionnement et la compartimentation des cellules dans l’organe. En raison de leur rôle central dans la détermination de la structure et de la fonction des organes, les épithéliums sont des cibles thérapeutiques importantes pour de nombreuses maladies humaines qui ne sont pas toujours capturées par les modèles animaux. Outre les différences évidentes d’une espèce à l’autre, la réalisation d’études de recherche sur la fonction barrière et les propriétés de transport de l’épithélium chez les animaux est encore aggravée par la difficulté d’accéder à ces tissus dans un système vivant. Bien que les cultures de cellules humaines bidimensionnelles (2D) soient utiles pour répondre à des questions scientifiques fondamentales, elles donnent souvent de mauvaises prédictions in vivo . Pour surmonter ces limitations, au cours de la dernière décennie, une pléthore de plates-formes biomimétiques micro-modifiées, connues sous le nom d’organes sur puce, ont émergé comme une alternative prometteuse aux tests in vitro et animaux traditionnels. Ici, nous décrivons une puce d’organe à sommet ouvert (ou puce à toit ouvert), une plate-forme conçue pour modéliser les tissus épithéliaux spécifiques aux organes, y compris la peau, les poumons et les intestins. Cette puce offre de nouvelles possibilités de reconstituer l’architecture multicellulaire et la fonction des tissus épithéliaux, y compris la capacité de recréer un composant stromal 3D en incorporant des fibroblastes et des cellules endothéliales spécifiques aux tissus dans un système mécaniquement actif. Cette puce Open-Top fournit un outil sans précédent pour étudier les interactions épithéliales/mésenchymateuses et vasculaires à plusieurs échelles de résolution, des cellules individuelles aux constructions tissulaires multicouches, permettant ainsi la dissection moléculaire de la diaphonie intercellulaire des organes épithélialisés dans la santé et la maladie.

Microstructuration de surface La microstructure de la matrice extracellulaire (ECM) peut être utilisée pour reproduire la configuration spatiale de l’interface de la crypte intestinale. La configuration de la puce Open-Top peut être modifiée pour intégrer des timbres à micromotifs spécialement conçus pour imiter la topographie naturelle de l’interface épithélium-stroma colique (Figure 6A,B) et des cryptes intestinales à l’échelle micrométrique (...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip at JoVE.com

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

Le présent protocole décrit les capacités et les modalités de culture essentielles de l’Open-Top Organ-Chip pour l’établissement et la maturation réussis de cultures d’organes sur puce de pleine épaisseur de tissus primaires (peau, alvéole, voies respiratoires et intestin), offrant la possibilité d’étudier différents aspects fonctionnels de l’interface épithéliale/mésenchymateuse et vasculaire humaine in vitro.

Reconstitution de la cytoarchitecture et de la fonction des tissus épithéliaux humains sur une puce organique à sommet ouvert

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

Les méthodes traditionnelles de culture diffuse échouent souvent à récapituler l’environnement complexe des organes vivants, ce qui entraîne la perte de marqueurs et de fonctions spécifiques aux tissus. Nous avons développé une puce à toit ouvert qui combine la culture diffuse et le principe microfluidique pour imiter étroitement le microenvironnement des tissus épithéliaux. En incluant des indices biochimiques et biomécaniques naturellement présents dans les organes vivants mais souvent négligés par les modèles in vitro traditionnels, la puce à toit ouvert représente une meilleure alternative entre les systèmes fermés.La démonstration de la procédure sera Adya Panchal aujourd’hui, un étudiant chercheur dans mon laboratoire. Pour commencer, apportez les réactifs requis sous l’enceinte de biosécurité sur la glace. Cultivez des cellules mésenchymateuses spécifiques aux tissus pour obtenir une confluence de 80% à 90%, puis dissociez les cellules à l’aide de trypsine ou d’autres méthodes selon les recommandations du fabricant.Enduire les cellules à 250 g pendant cinq minutes à 24 degrés Celsius. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 225 microlitres chacun de tampon EMEM et de reconstruction 10X glacé. Mélanger les cellules par pipetage et ajouter 1 800 microlitres de solution glacée de collagène 1.Ensuite, mélangez la solution de prégel sur de la glace en pipetant de haut en bas cinq à six fois. Neutraliser la solution de prégel avec 18 microlitres d’un hydroxyde de sodium normal, mélanger doucement par pipetage, puis pipeter 150 microlitres d’hydrogel chargé de cellules dans la chambre centrale de la puce à dessus ouvert tout en évitant les bulles. Regroupez les copeaux dans des boîtes de Petri séparées, y compris un bouchon de tube centrifuge rempli de deux millilitres d’eau stérile à double distillation dans chaque boîte de Pétri, et incuber les boîtes de Petri à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Pour effectuer un micromodelage de surface de l’hydrogel stromal, pipeter 20 microlitres de la solution de pré-gel de collagène 1 neutralisée sur la surface à motifs d’un tampon stérile imprimé en 3D et insérer le tampon à l’intérieur de la chambre ouverte pendant que l’hydrogel stromal est encore sous forme liquide. Enlevez tout résidu d’hydrogel qui pourrait se répandre du haut de la chambre à ciel ouvert à l’aide d’un aspirateur. Regroupez toutes les copeaux dans des boîtes de Petri séparées avec un bouchon tubulaire conique rempli d’eau, comme démontré précédemment.Et incuber toutes les boîtes de Petri à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 90 minutes. À la fin de l’incubation, ramenez les copeaux sous l’enceinte de biosécurité et retirez délicatement les tampons à l’aide d’une pince à épiler de précision pour réduire le risque d’endommager l’hydrogel. Une fois que les cellules cultivées atteignent 80% à 90% de confluence, dissocier les cellules en utilisant des procédures enzymatiques protéolytiques recommandées par le fournisseur de cellules.Après dissociation, enduire les cellules par centrifugation et remettre en suspension les cellules épithéliales à la densité de fragments cellulaires appropriée décrite dans le manuscrit. Pour ensemencer la cellule épithéliale, transférer les copeaux de l’incubateur dans l’armoire de biosécurité et rincer la surface stromale trois fois avec 100 microlitres de milieu de culture cellulaire épithéliale frais pour éliminer tout excès de solution d’enrobage. Une fois le milieu de rinçage aspiré, ensemencez la surface de l’hydrogel avec 50 microlitres de suspension de cellules épithéliales en utilisant une densité cellulaire appropriée, puis transférez les copeaux dans l’incubateur pendant deux heures.Pour éliminer les débris cellulaires, rincez doucement la surface d’hydrogel avec le milieu de culture cellulaire deux fois, rafraîchissez le milieu par autoclavage dans des récipients autoclavables scellés et connectez les copeaux à la pompe péristaltique. Mettez la pompe péristaltique en pause, débranchez soigneusement les copeaux de la pompe et extrayez le support du boîtier de la puce. Après avoir transféré les copeaux de l’incubateur à l’armoire de biosécurité, retirez le volume du milieu restant dans le réservoir supérieur.Ensuite, aspirez doucement tout le fluide du canal microfluidique supérieur et serrez le tube microfluidique court connecté aux entrées supérieures à l’aide de clips liants pour réduire l’évaporation du média et le maintien de l’interface air-liquide, ou ALI. Replacez la puce ouverte sur le support de boîtier dans l’incubateur. Reconnectez les copeaux à la pompe péristaltique et reprenez le débit en démarrant la pompe péristaltique.Rincer la chambre vasculaire avec le milieu de culture de cellules endothéliales, puis ensemencer 25 microlitres de suspension de cellules endothéliales. Retournez les copeaux à l’envers pour permettre aux cellules endothéliales de se fixer à la surface supérieure de la chambre microfluidique. Regroupez les chips dans des boîtes de Pétri.Replacez-les dans l’incubateur comme démontré précédemment et laissez les cellules endothéliales se fixer pendant une heure. À la fin de l’incubation, transférer les puces de l’incubateur à l’armoire de biosécurité et rincer le canal vasculaire avec un milieu de culture cellulaire endothéliale deux fois pour éliminer les débris cellulaires. Posez les copeaux à plat pour faciliter l’adhésion des cellules endothéliales à la surface inférieure du canal vasculaire.Remplir le réservoir du milieu vasculaire avec le milieu de culture cellulaire vasculaire dégazé sous l’armoire de biosécurité. Replacez les copeaux à l’intérieur du support de boîtier de puces et reconnectez les copeaux aux réservoirs de milieu à une extrémité et à la pompe péristaltique de l’autre. Inspectez les connexions microfluidiques pour vous assurer que toutes les puces sont correctement connectées et qu’aucune gouttelette visible de fluide ne coule.Ensuite, reprenez l’écoulement du fluide en démarrant la pompe péristaltique. La surface du gel micromodelé avec et sans cellules est visualisée. L’analyse histologique a révélé un épiderme stratifié multicouche mature différencié sur puce.L’image de dessus de la puce de la peau montrait la présence des fibroblastes à l’intérieur de la couche dermique. PECAM-1, VE-cadhérine et von Willebrand ont montré la différenciation des cellules endothéliales microvasculaires humaines co-cultivées dans la puce cutanée ouverte. La coloration fluorescente MUC5AC, alpha et bêta, la protéine chlorocellulaire 16, p63 et ZO-1 a montré un épithélium des voies respiratoires mature.Les cils battants et l’épithélium pseudo-stratifié mature différencié ont été observés sur une puce des voies respiratoires à sommet ouvert. La coloration fluorescente de type I, de type II et E-cadhérine a montré la présence de pneumocytes matures sur la puce. La microscopie électronique a révélé la présence de microvillosités et de vésicules lysosomales, preuve d’un phénotype alvéolaire mature.L’analyse histologique a montré la présence de cellules squameuses plates compatibles avec le phénotype de type I, de cellules cuboïdes ressemblant à des pavés cohérentes avec le phénotype de type II et de fibroblastes à l’intérieur de la couche dermique. La présence d’entérocytes et du gobelet mature a été confirmée par la coloration de la mucine 2 et de la E-cadhérine. Les fibroblastes à l’intérieur de la couche dermique ont confirmé la présence d’un épithélium cylindrique simple.Tous les réactifs doivent être froids et les surfaces du gel doivent être correctement rincées pour obtenir une surface uniforme. Il est important d’enlever toutes les cellules et les débris non adhérents pour obtenir une adhésion cellulaire uniforme et une monocouche et une paroi vasculaire compactes et nauséabondes. Une approche similaire peut être utilisée pour générer d’autres types de modèles d’organes épithéliaux, tels que l’intestin et le poumon, afin d’évaluer comment des médicaments spécifiques ou des facteurs environnementaux peuvent affecter l’homéostasie des tissus humains, avec un accent particulier sur la fonction de barrière épithéliale et vasculaire.Avec un accès facile à la phase d’efficacité du compartiment stroma, la recherche peut maintenant générer des motifs de visage spécifiques et reproduire une architecture tissulaire fonctionnelle, telle que les cryptviveoli, ce qui est difficile à réaliser avec d’autres dispositifs.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Cytométrie de masse: Protocole pour Tuning quotidien et échantillons cellulaires course sur un cytomètre de masse CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Recherche

Bio-ingénierie

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Le Multi-Chip organes - Une plate-forme microfluidique à long terme Coculture multi-tissus

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolation des droits de cellules primaires de tumeurs du côlon à partir de tissus chirurgicaux et les cultivant directement sur élastique souple substrats pour Traction cytométrie

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Améliorer 2D et 3D Skin<em&gt; In vitro</em&gt; Modèles utilisant macromoléculaire Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Caractérisation biomécanique des tissus mous humains à l&#39;aide d&#39;essais indentation et traction

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

Cytométrie en flux à haute dimensionnalité pour l’analyse de la fonction immunitaire de tissus implantaires disséqués

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Génération d’un modèle tridimensionnel simplifié de peau sur puce dans une plate-forme microfluidique micro-usinée

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Quantification of Mouse Heart Left Ventricular Function, Myocardial Strain, and Hemodynamic Forces by Cardiovascular Magnetic Resonance Imaging

Quantification de la fonction ventriculaire gauche du cœur de souris, de la tension myocardique et des forces hémodynamiques par imagerie par résonance magnétique cardiovasculaire

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations ...