Name: reconstituting cytoarchitecture and function of human epithelial tissues on an open-top organ-chip
Uploaded: 2023-02-17T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip at JoVE.com

קולונואידים אנושיים התקבלו מכריתות מעיים בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית של בית החולים לילדים בסינסינטי (IBC 2017-2011).
1. הפעלת פני השטח
<ol><li>הכנת מאגר הפעלה<ol><li>הניחו את הקרוסלינקר ואת ריאגנטי החיץ הממס מתחת לארון הבטיחות הביולוגית (BSC) ותנו להם להתאזן ב...

<ol>
	<li>Van Norman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+animal+studies+for+predicting+toxicity+in+clinical+trials:+Is+it+time+to+rethink+our+current+approach.">Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).</li><li>Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+the+principles+of+the+3Rs+of+animal+testing+at+CDER:+Past,+present+and+future.">Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).</li><li>Mosig, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+models:+New+opportunities+for+biomedical+research.">Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research.</a> Future Science OA. 3 (2), (2017).</li><li>Al&#233;p&#233;e, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-of-the-art+of+3D+cultures+(organs-on-a-chip)+in+safety+testing+and+pathophysiology.">State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology.</a> Altex. 31 (4), 441-477 (2014).</li><li>MacArron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research.">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).</li><li>Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+early+drug+discovery.">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li><li>Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+based+in+vitro+test+systems+for+anticancer+drug+screening.">Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).</li><li>Mao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+alveolar+epithelial+type+II+cells+in+primary+culture.">Human alveolar epithelial type II cells in primary culture.</a> Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).</li><li>Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+significantly+alters+gene+expression+profiles+and+reduces+differences+between+myometrial+and+fibroid+smooth+muscle+cells.">In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells.</a> Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).</li><li>Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+tissue+stiffness+and+bioadhesivity:+Advanced+biomaterials+to+model+tumor+microenvironments+and+drug+resistance.">Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance.</a> Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).</li><li>Nawroth, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+Lung-on-Chips:+The+best+of+both+worlds.">Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2d+to+3d+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Kapa&#322;czy&#324;ska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures.">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li><li>Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-component+radiation+survival+curve+using+an+in+vitro+tumour+model.">A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model.</a> International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).</li><li>Chandra, P., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+extracellular+microenvironment+for+modulating+stem+cell+behaviors.">Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors.</a> Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).</li><li>Nicolas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+extracellular+matrix+mimics:+Fundamental+concepts+and+role+of+materials+chemistry+to+influence+stem+cell+fate.">3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate.</a> Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).</li><li>Brassard, J. A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+self-organization+to+build+better+organoids.">Engineering stem cell self-organization to build better organoids.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Mantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+hydrogels+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Materials. 12 (20), 3323 (2019).</li><li>Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+in+drug+discovery+and+drug+repositioning.">Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+cues+as+master+regulators+of+hematopoietic+stem+cell+fate.">Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).</li><li>Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+chips+and+microphysiological+systems+for+disease+modeling+and+drug+testing.">Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing.</a> Micromachines. 12 (2), 139 (2021).</li><li>Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-chip:+A+new+paradigm+for+drug+development.">Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).</li><li>Varone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+organ-chip+system+emulates+three-dimensional+architecture+of+the+human+epithelia+and+the+mechanical+forces+acting+on+it.">A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it.</a> Biomaterials. 275, 120957 (2021).</li><li>Hassell, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organ+chip+models+recapitulate+orthotopic+lung+cancer+growth,+therapeutic+responses,+and+tumor+dormancy+in+vitro.">Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro.</a> Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).</li><li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+formalin-fixed,+paraffin+embedded+blocks.">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Biobanking. 1897, 253-268 (2019).</li><li>Grant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+drug+concentrations+in+PDMS+microfluidic+organ+chips.">Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips.</a> Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).</li><li>Barrile, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-chip+recapitulates+thrombosis+Induced+by+an+anti-CD154+monoclonal+antibody:+Translational+potential+of+advanced+microengineered+systems.">Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+human+lung+alveolus-on-a-chip+model+of+intravascular+thrombosis+for+assessment+of+therapeutics.">Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).</li><li>Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+polydimethylsiloxane:+Alternative+materials+for+fabrication+of+organ-on-a-chip+devices+and+microphysiological+systems.">Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).</li><li>Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+human+physiology+on-chip:+Historical+perspectives+and+future+directions.">Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions.</a> Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).</li></ol>

השבב הפתוח מהווה פלטפורמה המאפשרת לחקור את יחסי הגומלין התאיים המורכבים המתרחשים בין אנדותל, סטרומה ואפיתל במיקרו-סביבה מבוקרת, בזמן אמת. טכנולוגיה זו מציעה יתרונות קריטיים על פני תרביות אורגנוטיפיות ואורגנואידים קונבנציונליות, כגון שילוב של רמזים פיזיקליים וביוכימיים הרלוונטיים לשחז?...

מבחינה היסטורית, מדענים הסתמכו על ניסויים פרה-קליניים בבעלי חיים לצורך גילוי תרופות, אך מספר גדל והולך של שיטות אלה הוטלו בספק בגלל מתאם גרוע עם תוצאות אנושיות1. יישום עקרונות "3Rs" להחלפה, הפחתה ושכלול של ניסויים בבעלי חיים דוחק במדענים למצוא שיטות חלופיות חדשות במבחנה לתמיכה בהערכת סיכונים פרה-קליניים של תרופות וטוקסיקולוגיה כימית2. עם זאת, מודלים רבים במבחנה שפותחו עד כה חסרים את הארכיטקטורה הביולוגית, המורכבות התאית והסביבה המכנית הנחוצות כדי לשחזר את הטבע הדינמי של איברים חיים אנושיים 3,4.
מערכות פרה-קליניות קונבנציונליות במבחנה משתמשות בדרך כלל במונוקולטורה דו-ממדית של תאים אנושיים הגדלים על משטח פלסטיק קשיח. שיטות אלה מספקות כלי לביצוע מחקרים מכניסטיים פשוטים ומאפשרות סינון מהיר של מועמדים לתרופה. בשל עלותם הנמוכה יחסית וחוסנם הגבוה, מודלים דו-ממדיים משויכים לעתים קרובות למערכות אוטומטיות בעלות תפוקה גבוהה ומשמשים לזיהוי מהיר של מועמדים פוטנציאליים לתרופות בשלב המוקדם של תהליך פיתוח התרופה 5,6. עם זאת, מודלים דו-ממדיים כאלה אינם מספקים גישה תרגומית למידול תגובות ברמת הרקמה, ברמת האיבר או ברמת המערכת למועמדים טיפוליים, הדרושה לחיזוי מדויק של בטיחות ויעילות התרופות בשלב הפרה-קליני של פיתוחן. תרביות תאים שטוחות אינן משחזרות את המיקרו-סביבה הטבעית של הרקמה, כולל יחסי הגומלין הרב-תאיים המורכבים, התכונות הביומכניות והארכיטקטורה התלת-ממדית (תלת-ממדית) של רקמות אנושיות7. תאים הגדלים על משטח שטוח לעתים קרובות אינם רוכשים פנוטיפ בוגר, ולכן אינם יכולים להגיב לגירויים פרמקולוגיים כפי שהיו מגיבים ברקמה הטבעית. לדוגמה, תאי אפיתל מכתשית אנושיים ראשוניים הגדלים במבחנה מציגים פנוטיפ קשקשי ומאבדים סמנים פנוטיפיים מרכזיים, כולל חלבונים פעילי שטח C ו- B (SP-C ו- SP-B)8. בנוסף להתמיינות לא מספקת, תאים ראשוניים הופכים לעתים קרובות לבלתי רגישים לגורמי עקה ביולוגיים במבחנה, כאשר מסלולים ביוכימיים מסוימים הקשורים לדלקת רקמות הופכים ללא פונקציונליים9. נראה כי אובדן כזה של תפקוד התא קשור בעיקר לשימוש במצעים נוקשים, כמו גם להיעדר גורמים מסיסים המשוחררים באופן טבעי על ידי תאי סטרומה ספציפיים לרקמות כגון פיברובלסטים של ריאות ותאי שריר חלק10,11.
ההבנה כי היעדר מורכבות כימו-פיזיקלית וביולוגית מגבילה את ההתנהגות הפיזיולוגית של תאים במבחנה עודדה פיתוח מודלים רב-תאיים מתוחכמים יותר, שהוכחו כלוכדים טוב יותר את המורכבות של רקמות אנושיות מחוץ לגוף12,13. מאז יצירת המודלים הראשונים של תרביות משותפות בתחילת שנות השבעים14, הכנסת הידרוג'לים סינתטיים וטבעיים שיפרה באופן משמעותי את היכולת לחקות מיקרו-סביבות רקמה טבעיות והפכה לכלי רב ערך להנעת התמיינות תאית, הנחיית הארגון העצמי של תאים למבנים דמויי רקמות, ושיקום תפקודי רקמה מקומיים15,16. לדוגמה, כאשר הם גדלים בפיגום התלת-ממדי המתאים, תאים אנושיים יכולים להתארגן בעצמם למבנים פונקציונליים כגון ספרואידים או אורגנואידים, המבטאים סמנים של תאי גזע, והם מסוגלים להתחדשות עצמית17. לעומת זאת, תאים אנושיים (כולל תאי גזע), כאשר הם גדלים על מצעים דו-ממדיים מסורתיים, מזדקנים במהירות ועוברים הזדקנות לאחר כמה מעברים18. בנוסף, ניתן "לתפור" הידרוג'לים כך שיתאימו לתכונות רקמה ספציפיות כגון נקבוביות, גודל נקבוביות, עובי סיבים, צמיגות, טופוגרפיה ונוקשות, או להנדס אותם עם רכיבים תאיים שמקורם ברקמה ו/או מולקולות ביו-אקטיביות המאפשרות חיקוי של מצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים19,20. למרות הפוטנציאל העצום שלהם לבדיקות תרופות, מודלים מבוססי הידרוג'ל תלת-ממדיים המשמשים במחקר פרמצבטי אינם משחזרים באופן מלא את הציטוארכיטקטורה המורכבת של רקמות in vivo וחסרים גירויים המודינמיים ומכניים חשובים הקיימים בדרך כלל בגוף האדם, כולל לחץ הידרוסטטי, מתיחה מחזורית וגזירת נוזלים21.
מערכות מיקרופיזיולוגיות (MPS) כגון איברים על שבבים (OOCs) התפתחו לאחרונה ככלים המסוגלים ללכוד תגובות פיזיולוגיות מורכבות במבחנה22,23. מודלים אלה משתמשים לעתים קרובות בפלטפורמות מיקרופלואידיות, המאפשרות מידול של מיקרו-סביבה דינמית של איברים חיים.
שילבנו את העקרונות של ביו-הנדסה תלת-ממדית של רקמות ומכנוביולוגיה כדי ליצור מודל של שבב פתוח של רקמת אפיתל אנושית מורכבת. זה איפשר לנו לשחזר מקרוב את המיקרו-סביבה הרב-תאית והדינמית של רקמות אפיתל. זה כולל רמזים ביוכימיים וביומכניים ספציפיים לרקמות הקיימים באופן טבעי באיברים חיים, אך לעתים קרובות מוזנחים על ידי מודלים מסורתיים במבחנה 24. השבב הפתוח משלב שני תאים: תא כלי דם (איור 1A) ותא סטרומה (איור 1B) המופרדים על-ידי קרום נקבובי, מה שמאפשר פיזור חומרי מזון בין שני החדרים (איור 1C). תא כלי הדם חשוף לזרימת נוזלים רציפה כדי לשחזר לחץ גזירה פיזיולוגי, בעוד העיצוב הנמתח של תא הסטרומה מאפשר מידול של המתח המכני הקשור לתנועות נשימה או פריסטליס מעיים. תא הסטרומה מכיל את פיגום ההידרוג'ל התלת-ממדי הניתן להתאמה שנועד לתמוך בצמיחה פיזיולוגית של פיברובלסטים ספציפיים לרקמות. יש לו מכסה נשלף המאפשר הקמת ממשק אוויר-נוזל, מצב המאפשר חיקוי גדול יותר של הפיזיולוגיה האנושית של רקמות הרירית, כמו גם גישה ישירה לרקמה לניהול תרופות ישירות על שכבת האפיתל. איור משלים 1 לוכד כמה ממרכיבי המפתח של תכנון השבב הפתוח, כולל ממדים ותאים ביולוגיים (איור משלים 1A-D), כמו גם את השלבים הטכניים העיקריים המתוארים בפרוטוקול זה (איור משלים 1E).
זילוח של השבב הפתוח מושג באמצעות משאבה פריסטלטית ניתנת לתכנות (איור 1D). מערך המשאבה הפריסטלטית מאפשר לחורר 12 שבבים פתוחים בו זמנית. רוב החממות יכולות לאכלס שני מערכים המאפשרים תרבות של עד 24 שבבים לכל אינקובטור. מתיחה מכנית מושגת באמצעות וסת לחץ ואקום הניתן לתכנות בהתאמה אישית (איור 1E). הוא מורכב מווסת ואקום אלקטרו-פנאומטי הנשלט אלקטרונית על ידי ממיר דיגיטלי לאנלוגי. במילים אחרות, וסת הוואקום האלקטרו-פנאומטי מייצר פרופיל ואקום סינוסואידלי עם משרעת ותדירות שנקבעת על ידי המשתמש. זן מחזורי הנע בין 0% ל -15% נוצר על ידי הפעלת לחץ שלילי על ערוץ הריק של השבב הפתוח באמפליטודה הנעה בין 0 ל -90 kPa ותדר של 0.2 הרץ. זוהי מערכת מותאמת אישית המקבילה ליחידת המתח Flexcell הזמינה מסחרית שאומצה בעבר ותוארה במאמרים אחרים25. כדי לחקות את עיוות הרקמה המכנית הקשורים, למשל, לתנועת הנשימה של הריאה או לפריסטלטיקה של המעי, המפעיל הפנאומטי מפעיל גלי ואקום/מתח סינוסואידים שניתן להתאים את גודלם ואת המשרעת שלהם לרמה הפיזיולוגית של מאמץ ותדירות שתאים אנושיים חווים ברקמה הטבעית שלהם.
כאן, אנו מתארים שיטה יעילה וניתנת לשחזור להנדסה וטיפוח של אפיתל אורגנוטיפי שווה ערך על פלטפורמת אב טיפוס של שבב פתוח. הוא מאפשר יצירת מודלים מורכבים של איברים כגון עור, נאדיות, דרכי נשימה ומעי גס תוך שילוב זרימת נוזל כלי דם ומתיחה מכנית. נתאר היבטים טכניים מרכזיים שיש לקחת בחשבון תוך יישום עקרונות של הנדסת רקמות ליצירת מודלים אפיתליאליים מורכבים. נדון ביתרונות ובמגבלות האפשריות של העיצוב הנוכחי.
סקירה כללית של השלבים העיקריים המשמשים להשגת הבשלת רקמות ואיברים, כולל פרמטרים של זרימה ומתיחה, מדווחת ב: איור 2 עבור העור, איור 3 עבור הנאדיות, איור 4 עבור דרכי הנשימה ואיור 5 עבור המעי. מידע נוסף על הרכב המדיה וריאגנטים המשמשים לגידול דגמי האיברים השונים כלולים בטבלאות המשלימות (טבלה משלימה 1 לעור; טבלה משלימה 2 עבור alveolus; טבלה משלימה 3 לדרכי הנשימה, וטבלה משלימה 4 למעי).

reconstituting cytoarchitecture and function of human epithelial tissues on an open-top organ-chip

כמעט כל האיברים האנושיים מרופדים ברקמות אפיתל, המורכבות משכבה אחת או יותר של תאים מחוברים היטב המאורגנים במבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים). אחד התפקידים העיקריים של אפיתליה הוא היווצרות של מחסומים המגנים על רקמות קו תחתון מפני עלבונות פיזיים וכימיים וסוכנים זיהומיים. בנוסף, אפיתליה מתווכת את ההובלה של חומרים מזינים, הורמונים ומולקולות איתות אחרות, ולעתים קרובות יוצרת שיפועים ביוכימיים המנחים את מיקום התאים ומידור בתוך האיבר. בשל תפקידם המרכזי בקביעת מבנה האיברים ותפקודם, אפיתליה היא מטרה טיפולית חשובה למחלות אנושיות רבות שלא תמיד נלכדות על ידי מודלים של בעלי חיים. מלבד ההבדלים הברורים בין מינים למינים, ביצוע מחקרים על תפקוד מחסום ותכונות הובלה של אפיתליה בבעלי חיים מחמיר עוד יותר על ידי הקושי לגשת לרקמות אלה במערכת חיה. בעוד תרביות תאים אנושיים דו-ממדיות (דו-ממדיות) שימושיות למענה על שאלות מדעיות בסיסיות, לעתים קרובות הן מניבות תחזיות גרועות in vivo . כדי להתגבר על מגבלות אלה, בעשור האחרון, שפע של פלטפורמות ביומימטיות מיקרו-מהונדסות, הידועות בשם איברים על שבב, התגלו כחלופה מבטיחה לניסויים מסורתיים במבחנה ובבעלי חיים. במאמר זה אנו מתארים שבב איברים פתוח (או Open-Top Chip), פלטפורמה המיועדת למידול רקמות אפיתל ספציפיות לאיברים, כולל העור, הריאות והמעיים. שבב זה מציע הזדמנויות חדשות לבנייה מחדש של הארכיטקטורה והתפקוד הרב-תאיים של רקמות אפיתל, כולל היכולת ליצור מחדש רכיב סטרומה תלת-ממדי על ידי שילוב פיברובלסטים ספציפיים לרקמות ותאי אנדותל בתוך מערכת פעילה מכנית. שבב פתוח זה מספק כלי חסר תקדים לחקר אינטראקציות אפיתל/מזנכימליות וכלי דם בסקאלות רזולוציה מרובות, מתאים בודדים ועד מבנים רקמתיים רב-שכבתיים, ובכך מאפשר דיסקציה מולקולרית של הדיבור הבין-תאי של איברים אפיתליאליים בבריאות ובחולי.

מיקרו-תבניות משטח ניתן להשתמש במיקרו-תבניות של המטריצה החוץ תאית (ECM) כדי לשכפל את התצורה המרחבית של ממשק הקריפטה של המעי. ניתן לשנות את תצורת השבב הפתוח כדי לשלב חותמות מיקרו-תבניות שתוכננו במיוחד כדי לחקות את הטופוגרפיה הטבעית של ממשק אפיתל-סטרומה של המעי הגס (איור 6A,B) ...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip at JoVE.com

Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היכולות ואת אופני התרבית החיוניים של שבב האיברים הפתוח להקמה והבשלה מוצלחת של תרביות איבר-על-שבב בעובי מלא של רקמות ראשוניות (עור, נאדיות, דרכי נשימה ומעי), ומספק הזדמנות לחקור היבטים תפקודיים שונים של ממשק נישה אפיתל/מזנכימלי וכלי דם אנושי במבחנה.

שחזור ציטוארכיטקטורה ותפקוד של רקמות אפיתל אנושיות על שבב-איבר פתוח

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

שיטות תרבית דיפוזיות מסורתיות לעתים קרובות נכשלות לשחזר את הסביבה המורכבת של איברים חיים, מה שמוביל לאובדן סמנים ותפקודים ספציפיים לרקמות. פיתחנו שבב פתוח המשלב תרבית דיפוזית ועקרון מיקרופלואיד כדי לחקות מקרוב את המיקרו-סביבה של רקמות אפיתל. על ידי הכללת רמזים ביוכימיים וביומכניים הנמצאים באופן טבעי באיברים חיים אך לעתים קרובות מוזנחים על ידי מודלים מסורתיים במבחנה, השבב הפתוח מייצג חלופה טובה יותר בין מערכות סגורות.מי שתדגים את ההליך תהיה עדיה פנצ'ל היום, תלמידת מחקר במעבדה שלי. כדי להתחיל, להביא את הריאגנטים הדרושים מתחת לארון בטיחות ביולוגית על קרח. תרבית תאים מזנכימליים ספציפיים לרקמה כדי להשיג מפגש של 80% עד 90% ולאחר מכן לנתק את התאים באמצעות טריפסין או שיטות אחרות בהתאם להמלצות היצרן.מטילים את התאים ב-250 גרם למשך חמש דקות ב-24 מעלות צלזיוס. להשהות מחדש את גלולת התא ב 225 מיקרוליטר כל אחד של קר כקרח 10X EMEM ומאגר שחזור. מערבבים את התאים על ידי pipetting ולהוסיף 1, 800 מיקרוליטר של קולגן קר כקרח 1 פתרון.לאחר מכן, ערבבו את תמיסת הפרה-ג'ל על קרח על ידי פיפטינג למעלה ולמטה חמש עד שש פעמים. נטרלו את תמיסת הפרה-ג'ל עם 18 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסידי רגיל אחד, ערבבו בעדינות על ידי פיפטינג ולאחר מכן פיפטה 150 מיקרוליטר של הידרוג'ל עמוס תאים לתוך התא המרכזי של השבב הפתוח תוך הימנעות מבועות. קבצו את הצ'יפס לצלחות פטרי נפרדות, כולל מכסה צינור צנטריפוגה מלא בשני מיליליטרים של מים סטריליים בזיקוק כפול בכל צלחת פטרי, ודגרו על צלחות הפטרי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.כדי לבצע מיקרו-תבניות משטח של הידרוג'ל סטרומה, פיפטה 20 מיקרוליטר של תמיסת הפרה-ג'ל המנוטרלת קולגן 1 על פני השטח המעוצבים של חותמת סטרילית מודפסת בתלת-ממד ולהכניס את החותמת בתוך התא הפתוח בזמן שההידרוג'ל הסטרומה עדיין בצורה נוזלית. יש להסיר שאריות הידרוג'ל שעלולות להישפך מראש התא הפתוח באמצעות אספירטור. קבצו את כל השבבים לצלחות פטרי נפרדות עם מכסה צינור חרוטי מלא במים כפי שהודגם קודם לכן.ולדגור על כל צלחות הפטרי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 90 דקות. בסוף הדגירה, החזירו את השבבים מתחת לארון הבטיחות הביולוגית והסירו בעדינות את החותמות באמצעות פינצטה מדויקת כדי להפחית את הסיכון לפגיעה בהידרוג'ל. ברגע שהתאים בתרבית מגיעים למפגש של 80% עד 90%, נתקו את התאים באמצעות הליכי אנזים מפרקי חלבון לפי המלצת ספק התאים.לאחר הדיסוציאציה, משחררים את התאים בצנטריפוגה ומשעימים מחדש את תאי האפיתל לצפיפות מקטע התא המתאימה כמתואר בכתב היד. כדי לזרוע את תא האפיתל, העבירו את השבבים מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגית ושטפו את משטח הסטרומה שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של תרבית תאי אפיתל טריים כדי להסיר עודפים של תמיסת ציפוי. לאחר שואפת מדיום השטיפה, זרעו את משטח ההידרוג'ל עם 50 מיקרוליטר של תרחיף תאי האפיתל באמצעות צפיפות תאים מתאימה, ולאחר מכן העבירו את השבבים בחזרה לאינקובטור למשך שעתיים.כדי להסיר פסולת תאית, שטפו בעדינות את משטח ההידרוג'ל עם מדיום תרבית התא פעמיים, רעננו את המדיום על ידי אוטוקלאבינג במיכלים אטומים הניתנים להרכבה, וחברו את השבבים למשאבה הפריסטלטית. השהה את המשאבה הפריסטלטית, נתק בזהירות את השבבים מהמשאבה וחלץ את מוביל בית השבב. לאחר העברת השבבים מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגית, הסר את נפח המדיום שנותר למאגר העליון.לאחר מכן, שאפו בעדינות את כל המדיום מהתעלה המיקרופלואידית העליונה ומהדקים את הצינור המיקרופלואידי הקצר המחובר לפתחים העליונים באמצעות תפסי קלסרים כדי להפחית את אידוי המדיה ותחזוקה של ממשק אוויר-נוזל, או ALI. הניחו את השבב הפתוח על מוביל הדיור בחזרה לאינקובטור. חבר מחדש את השבבים למשאבה הפריסטלטית וחדש את הזרימה על ידי הפעלת המשאבה הפריסטלטית.יש לשטוף את תא כלי הדם בתרבית תאי אנדותל ולאחר מכן לזרוע 25 מיקרוליטר של השעיית תאי אנדותל. הפוך את השבבים כדי לאפשר לתאי אנדותל להיצמד לפני השטח העליונים של התא המיקרופלואידי. קבצו את הצ'יפס לצלחות פטרי.החזירו אותם לאינקובטור כפי שהודגם קודם לכן ותנו לתאי האנדותל להתחבר למשך שעה. בתום הדגירה מעבירים את השבבים מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגית ושוטפים פעמיים את תעלת כלי הדם במדיום תרבית תאי אנדותל כדי להסיר פסולת תאית. הניחו את השבבים שטוחים כדי להקל על הידבקות תאי האנדותל למשטח התחתון של תעלת כלי הדם.מלאו את מאגר התווך הווסקולרי במדיום תרבית תאי כלי הדם המנוטרל מהגז מתחת לארון הבטיחות הביולוגית. החזירו את השבבים למנשא בית השבבים וחברו מחדש את השבבים למאגרים הבינוניים בקצה אחד ולמשאבה הפריסטלטית בקצה השני. בדוק את החיבורים המיקרופלואידים כדי לוודא שכל השבבים מחוברים כראוי ואין טיפות נראות לעין של טפטוף בינוני.לאחר מכן, חדש את זרימת הנוזלים על ידי הפעלת המשאבה הפריסטלטית. משטח הג'ל micropatterned עם ובלי תאים הוא דמיין. ניתוח היסטולוגי גילה אפידרמיס מרובד רב-שכבתי בוגר מובחן על שבב.התמונה העליונה של שבב העור הראתה נוכחות של פיברובלסטים בתוך שכבת העור. PECAM-1, VE-cadherin ו-von Willebrand הראו התמיינות של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים שעברו תרבית משותפת בשבב העור הפתוח. MUC5AC, אלפא ובטא טובולין, חלבון תאי כלורו 16, p63 וצביעה פלואורסצנטית ZO-1 הראו אפיתל בוגר של דרכי הנשימה.ריסונים פועמים ואפיתל בוגר מרובד פסאודו-מרובד נצפו על שבב דרכי אוויר פתוח. צביעה פלואורסצנטית מסוג I, Type II ו- E-cadherin הראתה נוכחות של פנאומוציטים בוגרים על שבב. מיקרוסקופ אלקטרונים חשף נוכחות של microvilli ו lysosomal vesicles, עדות לפנוטיפ נאדיות בוגר.הניתוח ההיסטולוגי הראה נוכחות של תאי קשקש שטוחים התואמים את הפנוטיפ מסוג I, ותאים דמויי אבן קובואידית הקוהרנטית עם הפנוטיפ מסוג II, ופיברובלסטים בתוך שכבת העור. נוכחותם של אנטרוציטים והגביע הבוגר אושרה על ידי מוצין 2 ומכתים E-cadherin. הפיברובלסטים בתוך שכבת העור אישרו את נוכחותו של אפיתל עמודתי פשוט.כל ריאגנטים חייבים להיות קרים ואת פני השטח של הג'ל צריך להיות שטוף כראוי כדי לקבל משטח אחיד. חשוב להסיר תאים ופסולת שאינם נדבקים כדי לקבל הידבקות תאים אחידה ודופן חד-שכבתית ווסקולרית קומפקטית ומצחינה. גישה דומה יכולה לשמש ליצירת סוגים אחרים של מודלים של איברי אפיתל, כגון המעי והריאה, כדי להעריך כיצד תרופות ספציפיות או גורמים סביבתיים עשויים להשפיע על הומאוסטזיס של רקמות אנושיות, עם דגש מיוחד על תפקוד מחסום אפיתל וכלי דם.עם גישה קלה לשלב היעילות של תא הסטרומה, המחקר יכול כעת ליצור דפוסי פנים ספציפיים ולשחזר ארכיטקטורת רקמות פונקציונלית, כגון cryptviveoli, אשר קשה להשיג עם מכשירים אחרים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

בידוד של תאי גידול במעי גס אנושיים ראשוניים מרקמות כירורגי וCulturing אותם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לגרירה Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

אפיון ביומכנית של רקמות רכות אדם באמצעות זחה ו מתיחת בדיקה

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Quantification of Mouse Heart Left Ventricular Function, Myocardial Strain, and Hemodynamic Forces by Cardiovascular Magnetic Resonance Imaging

כימות של תפקוד החדר השמאלי של לב העכבר, זן שריר הלב וכוחות המודינמיים על ידי הדמיית תהודה מגנטית לב וכלי דם

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations ...