Name: reconstituting cytoarchitecture and function of human epithelial tissues on an open-top organ-chip
Uploaded: 2023-02-17T12:40:00
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Los colonoides humanos se obtuvieron de resecciones intestinales de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Bioseguridad del Hospital de Niños de Cincinnati (IBC 2017-2011).
1. Activación de superficie
<ol><li>Preparación del búfer de activación<ol><li>Coloque el reticulante y los reactivos tampón del disolvente debajo del gabinete de bioseguridad (BSC) y déjelos equilibrarse a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos antes de su uso.</li>
		<li>R...

<ol>
	<li>Van Norman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+animal+studies+for+predicting+toxicity+in+clinical+trials:+Is+it+time+to+rethink+our+current+approach.">Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach.</a> JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).</li><li>Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+the+principles+of+the+3Rs+of+animal+testing+at+CDER:+Past,+present+and+future.">Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).</li><li>Mosig, A. 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El chip Open-Top representa una plataforma habilitadora para investigar la compleja interacción celular que ocurre entre el endotelio, el estroma y el epitelio en un microambiente controlado, en tiempo real. Esta tecnología ofrece ventajas críticas sobre los cultivos organotípicos y organoides convencionales, como la integración de señales físicas y bioquímicas que son relevantes para reconstituir el microambiente del tejido humano, incluido el cizallamiento fluídico (flujo), el estiramiento cíclico y la recons...

Históricamente, los científicos han confiado en las pruebas preclínicas en animales para el descubrimiento de fármacos, pero un número creciente de estos métodos han sido cuestionados debido a la mala correlación con el resultado humano1. La implementación de los principios de las "3R" para reemplazar, reducir y refinar la experimentación animal insta a los científicos a encontrar nuevos métodos alternativos in vitro para apoyar la evaluación preclínica de riesgos de toxicología química y de medicamentos2. Sin embargo, muchos modelos in vitro desarrollados hasta la fecha carecen de la arquitectura biológica, la complejidad celular y el entorno mecánico necesarios para recapitular la naturaleza dinámica de los órganos vivos humanos 3,4.
Los sistemas preclínicos in vitro convencionales suelen emplear monocultivos 2D de células humanas cultivadas sobre una superficie plástica rígida. Estos métodos proporcionan una herramienta para realizar estudios mecanicistas simples y permiten una rápida selección de candidatos a fármacos. Debido a su costo relativamente bajo y alta robustez, los modelos 2D a menudo se combinan con sistemas automáticos de alto rendimiento y se utilizan para la identificación rápida de posibles candidatos a fármacos durante la etapa inicial del proceso de desarrollo de fármacos 5,6. Sin embargo, tales modelos 2D no proporcionan un enfoque traslacional para modelar respuestas a nivel de tejido, órgano o sistémicas a candidatos terapéuticos, lo cual es necesario para predicciones precisas de la seguridad y eficacia de los medicamentos durante la etapa preclínica de su desarrollo. Los cultivos de células planas no recapitulan el microambiente tisular nativo, incluida la compleja interacción multicelular, las propiedades biomecánicas y la arquitectura tridimensional (3D) de los tejidos humanos7. Las células que crecen en una superficie plana a menudo no adquieren un fenotipo maduro y, por lo tanto, no pueden responder a los estímulos farmacológicos como lo harían en el tejido nativo. Por ejemplo, las células epiteliales alveolares humanas primarias cultivadas in vitro exhiben un fenotipo escamoso y pierden marcadores fenotípicos clave, incluidas las proteínas surfactantes C y B (SP-C y SP-B)8. Además de la diferenciación insuficiente, las células primarias con frecuencia se vuelven insensibles a los factores estresantes biológicos in vitro, ya que ciertas vías bioquímicas asociadas con la inflamación del tejido se vuelven no funcionales9. Tal pérdida de función celular parece estar asociada principalmente con el uso de sustratos rígidos, así como con la falta de factores solubles liberados naturalmente por las células estromales específicas del tejido, como los fibroblastos pulmonares y las células del músculo liso10,11.
La comprensión de que la falta de complejidad quimiofísica y biológica limita el comportamiento fisiológico de las células in vitro ha fomentado el desarrollo de modelos multicelulares más sofisticados, que han demostrado captar mejor la complejidad de los tejidos humanos fuera del cuerpo12,13. Desde la creación de los primeros modelos de cocultivo a principios de la década de 197014, la introducción de hidrogeles sintéticos y naturales ha mejorado significativamente la capacidad de imitar microambientes de tejidos nativos y se ha convertido en una herramienta invaluable para impulsar la diferenciación celular, guiar la autoorganización de las células en estructuras similares a los tejidos y la restauración de las funciones de los tejidos nativos15,16. Por ejemplo, cuando se cultivan en el andamio 3D apropiado, las células humanas pueden autoorganizarse en estructuras funcionales como esferoides u organoides, expresando marcadores de células madre, y son capaces de autorrenovarse17. En contraste, las células humanas (incluidas las células madre), cuando se cultivan en sustratos 2D tradicionales, envejecen rápidamente y sufren senescencia después de unos pocos pasajes18. Además, los hidrogeles pueden ser "adaptados" para que coincidan con propiedades específicas del tejido, como porosidad, tamaño de poro, grosor de fibra, viscoelasticidad, topografía y rigidez, o diseñados con componentes celulares derivados de tejidos y / o moléculas bioactivas que permiten la emulación de las condiciones fisiológicas o patológicas19,20. A pesar de su enorme potencial para las pruebas farmacológicas, los modelos 3D basados en hidrogel utilizados en la investigación farmacéutica no recapitulan completamente la compleja citoarquitectura de los tejidos in vivo y carecen de importantes estímulos hemodinámicos y mecánicos normalmente presentes en el cuerpo humano, incluyendo la presión hidrostática, el estiramiento cíclico y el cizallamiento del fluido21.
Los sistemas microfisiológicos (MPS) como los Organs-on-chips (OOCs) han surgido recientemente como herramientas capaces de capturar respuestas fisiológicas complejas in vitro22,23. Estos modelos a menudo emplean el uso de plataformas microfluídicas, que permiten el modelado del microambiente dinámico de los órganos vivos.
Hemos combinado los principios de la bioingeniería de tejidos 3D y la mecanobiología para crear un modelo de chip abierto de tejido epitelial humano complejo. Esto nos permitió recapitular de cerca el microambiente multicelular y dinámico de los tejidos epiteliales. Esto incluye señales bioquímicas y biomecánicas específicas del tejido naturalmente presentes en los órganos vivos, pero a menudo descuidadas por los modelos tradicionales in vitro 24. El chip Open-Top incorpora dos compartimentos: un compartimento vascular (Figura 1A) y un compartimento estromal (Figura 1B) separados por una membrana porosa, lo que permite la difusión de nutrientes entre las dos cámaras (Figura 1C). El compartimiento vascular está expuesto a un flujo continuo de fluido para recapitular el esfuerzo cortante fisiológico, mientras que el diseño estirable de la cámara estromal permite el modelado de la tensión mecánica asociada con los movimientos respiratorios o la peristalsis intestinal. El compartimento estromal alberga el andamio de hidrogel 3D sintonizable diseñado para apoyar el crecimiento fisiológico de fibroblastos específicos de tejido. Posee una tapa extraíble que facilita el establecimiento de una interfaz aire-líquido, una condición que permite una mayor emulación de la fisiología humana de los tejidos de la mucosa, así como el acceso directo al tejido para administrar medicamentos directamente sobre la capa epitelial. La Figura Suplementaria 1 captura algunos de los componentes clave del diseño del chip Open-Top, incluidas las dimensiones y los compartimentos biológicos (Figura Suplementaria 1A-D), así como los principales pasos técnicos descritos en este protocolo (Figura Suplementaria 1E).
La perfusión del chip Open-Top se logra con una bomba peristáltica programable (Figura 1D). La configuración de la bomba peristáltica permite que 12 chips descapotables se perfundan simultáneamente. La mayoría de las incubadoras pueden albergar dos configuraciones que permiten el cultivo de hasta 24 chips por incubadora. El estiramiento mecánico se logra utilizando un regulador de presión de vacío programable hecho a medida (Figura 1E). Consiste en un regulador de vacío electroneumático controlado electrónicamente por un convertidor de digital a analógico. En otras palabras, el regulador de vacío electroneumático genera un perfil de vacío sinusoidal con una amplitud y frecuencia que es determinada por el usuario. La deformación cíclica que oscila entre el 0% y el 15% se genera aplicando presión negativa al canal de vacío del chip abierto a una amplitud que varía de 0 a -90 kPa y una frecuencia de 0,2 Hz. Es un sistema hecho a medida equivalente a la unidad de deformación Flexcell disponible comercialmente previamente adoptada y descrita en otros documentos25. Para imitar la deformación mecánica del tejido asociada, por ejemplo, con el movimiento respiratorio del pulmón o el peristaltismo del intestino, el actuador neumático aplica ondas sinusoidales de vacío / deformación cuya magnitud y amplitud se pueden ajustar para que coincidan con el nivel fisiológico de tensión y frecuencia que experimentan las células humanas en su tejido nativo.
Aquí, describimos un método eficiente y reproducible para diseñar y cultivar equivalentes de epitelio organotípico en una plataforma prototipo de chip Open-Top. Permite la generación de modelos de órganos complejos como piel, alvéolos, vías respiratorias y colon al tiempo que integra un flujo de fluido vascular y estiramiento mecánico. Describiremos los aspectos técnicos clave que deben considerarse al implementar los principios de la ingeniería de tejidos para generar modelos epiteliales complejos. Discutiremos las ventajas y posibles limitaciones del diseño actual.
Una visión general de los principales pasos utilizados para lograr la maduración de tejidos y órganos, incluidos los parámetros de flujo y estiramiento, se informa en: Figura 2 para la piel, Figura 3 para el alvéolo, Figura 4 para las vías respiratorias y Figura 5 para el intestino. En las tablas suplementarias se incluye información adicional sobre la composición de los medios y los reactivos utilizados para el cultivo de los diferentes modelos de órganos (Tabla suplementaria 1 para la piel; Tabla complementaria 2 para el alvéolo; Tabla complementaria 3 para la vía aérea y Tabla complementaria 4 para el intestino).

reconstituting cytoarchitecture and function of human epithelial tissues on an open-top organ-chip

Casi todos los órganos humanos están revestidos con tejidos epiteliales, que comprenden una o varias capas de células estrechamente conectadas organizadas en estructuras tridimensionales (3D). Una de las principales funciones del epitelio es la formación de barreras que protegen los tejidos subyacentes contra insultos físicos y químicos y agentes infecciosos. Además, los epitelios median el transporte de nutrientes, hormonas y otras moléculas de señalización, a menudo creando gradientes bioquímicos que guían el posicionamiento celular y la compartimentación dentro del órgano. Debido a su papel central en la determinación de la estructura y función de los órganos, los epitelios son objetivos terapéuticos importantes para muchas enfermedades humanas que no siempre son capturadas por modelos animales. Además de las obvias diferencias de especie a especie, la realización de estudios de investigación sobre la función de barrera y las propiedades de transporte de los epitelios en animales se ve agravada por la dificultad de acceder a estos tejidos en un sistema vivo. Si bien los cultivos de células humanas bidimensionales (2D) son útiles para responder preguntas científicas básicas, a menudo producen predicciones in vivo deficientes. Para superar estas limitaciones, en la última década, una gran cantidad de plataformas biomiméticas de microingeniería, conocidas como órganos en un chip, han surgido como una alternativa prometedora a las pruebas tradicionales in vitro y en animales. Aquí, describimos un Open-Top Organ-Chip (o Open-Top Chip), una plataforma diseñada para modelar tejidos epiteliales específicos de órganos, incluyendo piel, pulmones e intestinos. Este chip ofrece nuevas oportunidades para reconstituir la arquitectura multicelular y la función de los tejidos epiteliales, incluida la capacidad de recrear un componente estromal 3D mediante la incorporación de fibroblastos específicos de tejido y células endoteliales dentro de un sistema mecánicamente activo. Este chip abierto proporciona una herramienta sin precedentes para estudiar las interacciones epiteliales / mesenquimales y vasculares a múltiples escalas de resolución, desde células individuales hasta construcciones de tejido multicapa, lo que permite la disección molecular de la diafonía intercelular de los órganos epitelializados en la salud y la enfermedad.

Micropatrones superficiales El micropatrón de la matriz extracelular (ECM) se puede utilizar para replicar la configuración espacial de la interfaz de la cripta intestinal. La configuración del chip abierto se puede modificar para integrar sellos micropatronados diseñados específicamente para imitar la topografía natural de la interfaz epitelio-estroma colónico (Figura 6A, B) y las criptas intestinales a escala micrométrica (F...

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Reconstituting Cytoarchitecture and Function of Human Epithelial Tissues on an Open-Top Organ-Chip

El presente protocolo describe las capacidades y las modalidades esenciales de cultivo del Open-Top Organ-Chip para el establecimiento exitoso y la maduración de cultivos de órgano en chip de espesor completo de tejidos primarios (piel, alvéolo, vías respiratorias e intestino), brindando la oportunidad de investigar diferentes aspectos funcionales de la interfaz epitelial/mesenquimal y nicho vascular humana in vitro.

Reconstitución de la citoarquitectura y la función de los tejidos epiteliales humanos en un chip de órgano abierto

Nearly all human organs are lined with epithelial tissues, comprising one or multiple layers of tightly connected cells organized into three-dimensional ...

Los métodos tradicionales de cultivo difusal a menudo no logran recapitular el complejo entorno de los órganos vivos, lo que lleva a la pérdida de marcadores y funciones específicos del tejido. Hemos desarrollado un chip abierto que combina el cultivo difusal y el principio microfluídico para imitar de cerca el microambiente de los tejidos epiteliales. Al incluir señales bioquímicas y biomecánicas que están naturalmente presentes en los órganos vivos, pero que a menudo son descuidadas por los modelos tradicionales in vitro, el chip abierto representa una mejor alternativa entre sistemas cerrados.Demostrando el procedimiento estará Adya Panchal hoy, una estudiante de investigación en mi laboratorio. Para comenzar, coloque los reactivos necesarios debajo del gabinete de bioseguridad en hielo. Cultive células mesenquimales específicas del tejido para obtener una confluencia del 80% al 90% y luego disocie las células usando tripsina u otros métodos según las recomendaciones del fabricante.Granular las células a 250 g durante cinco minutos a 24 grados centígrados. Resuspenda el pellet celular en 225 microlitros de EMEM 10X helado y tampón de reconstrucción. Mezclar las células por pipeteo y añadir 1.800 microlitros de solución helada de colágeno 1.A continuación, mezcle la solución de pre-gel en hielo pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a seis veces. Neutralice la solución de pregel con 18 microlitros de un hidróxido de sodio normal, mezcle suavemente con pipeteo y luego pipete 150 microlitros de hidrogel cargado de células en la cámara central del chip abierto evitando burbujas. Agrupe las fichas en placas de Petri separadas, incluida una tapa de tubo de centrífuga llena de dos mililitros de agua estéril de doble destilación en cada placa de Petri, e incube las placas de Petri a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Para realizar el micropatrón superficial del hidrogel estromario, pipetea 20 microlitros de la solución de pregel de colágeno 1 neutralizado en la superficie estampada de un sello estéril impreso en 3D e inserta el sello dentro de la cámara abierta mientras el hidrogel estromal todavía está en forma líquida. Retire cualquier residuo de hidrogel que pueda derramarse de la parte superior de la cámara superior abierta con un aspirador. Agrupe todas las fichas en placas de Petri separadas con una tapa de tubo cónica llena de agua como se demostró anteriormente.E incubar todas las placas de Petri a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 90 minutos. Al final de la incubación, vuelva a colocar las virutas debajo del gabinete de bioseguridad y retire suavemente los sellos con pinzas de precisión para reducir el riesgo de dañar el hidrogel. Una vez que las células cultivadas alcanzan una confluencia del 80% al 90%, disociar las células utilizando procedimientos de enzimas proteolíticas según lo recomendado por el proveedor celular.Después de la disociación, granular las células por centrifugación y resuspender las células epiteliales a la densidad de fragmentos celulares apropiada como se describe en el manuscrito. Para sembrar la célula epitelial, transfiera las virutas de la incubadora al gabinete de bioseguridad y enjuague la superficie estromal tres veces con 100 microlitros de medio de cultivo de células epiteliales frescas para eliminar cualquier exceso de solución de recubrimiento. Una vez que se aspire el medio de enjuague, siembre la superficie del hidrogel con 50 microlitros de la suspensión de células epiteliales utilizando la densidad celular adecuada y luego transfiera las virutas nuevamente a la incubadora durante dos horas.Para eliminar los residuos celulares, enjuague suavemente la superficie del hidrogel con el medio de cultivo celular dos veces, refresque el medio en autoclave en recipientes sellados en autoclave y conecte las virutas a la bomba peristáltica. Pause la bomba peristáltica, desconecte cuidadosamente los chips de la bomba y extraiga el portador de la carcasa del chip. Después de transferir los chips de la incubadora al gabinete de bioseguridad, retire el volumen del medio que queda en el depósito superior.Luego, aspire todo el medio desde el canal microfluídico superior suavemente y sujete el tubo microfluídico corto conectado a las entradas superiores usando clips aglutinantes para reducir la evaporación del medio y el mantenimiento de la interfaz aire-líquido, o ALI. Coloque el chip abierto en el soporte de la carcasa de nuevo en la incubadora. Vuelva a conectar los chips a la bomba peristáltica y reanude el flujo iniciando la bomba peristáltica.Enjuague la cámara vascular con medio de cultivo de células endoteliales y luego siembre 25 microlitros de suspensión de células endoteliales. Voltea los chips boca abajo para permitir que las células endoteliales se adhieran a la superficie superior de la cámara microfluídica. Agrupe las fichas en placas de Petri.Colóquelos de nuevo en la incubadora como se demostró anteriormente y deje que las células endoteliales se adhieran durante una hora. Al final de la incubación, transfiera las virutas de la incubadora al gabinete de bioseguridad y enjuague el canal vascular con medio de cultivo de células endoteliales dos veces para eliminar los desechos celulares. Coloque las virutas planas para facilitar la adhesión de las células endoteliales a la superficie inferior del canal vascular.Llene el reservorio del medio vascular con el medio de cultivo celular vascular desgasificado debajo del gabinete de bioseguridad. Vuelva a colocar los chips dentro del portador de la carcasa del chip y vuelva a conectar los chips a los depósitos medianos en un extremo y a la bomba peristáltica en el otro. Inspeccione las conexiones microfluídicas para asegurarse de que todos los chips estén conectados correctamente y que no haya gotas visibles de goteo medio.Luego, reanude el flujo de fluido iniciando la bomba peristáltica. Se visualiza la superficie de gel microestampada con y sin células. El análisis histológico reveló epidermis estratificada multicapa madura diferenciada en chip.La imagen de la vista superior del chip de piel mostró la presencia de los fibroblastos dentro de la capa dérmica. PECAM-1, VE-cadherina y von Willebrand mostraron la diferenciación de células endoteliales microvasculares humanas cocultivadas en el chip de piel abierta. MUC5AC, alfa y beta tubulina, proteína clorocelular 16, p63 y tinción fluorescente ZO-1 mostraron epitelio maduro de las vías respiratorias.Los cilios palpitantes y el epitelio pseudoestratificado maduro diferenciado se observaron en el chip de las vías respiratorias abiertas. La tinción fluorescente tipo I, tipo II y E-cadherina mostró la presencia de neumocitos maduros en chip. La microscopía electrónica reveló la presencia de microvellosidades y vesículas lisosomales, evidencia de fenotipo alveolar maduro.El análisis histológico mostró la presencia de células escamosas planas consistentes con el fenotipo Tipo I, y células cuboidales similares a adoquines coherentes con el fenotipo Tipo II, y fibroblastos dentro de la capa dérmica. La presencia de enterocitos y la copa madura fue confirmada por mucina 2 y tinción de E-cadherina. Los fibroblastos dentro de la capa dérmica confirmaron la presencia de un epitelio columnar simple.Todos los reactivos deben estar fríos y las superficies del gel deben enjuagarse adecuadamente para obtener una superficie uniforme. Es importante eliminar cualquier célula no adherente y residuos para obtener una adhesión celular uniforme y una monocapa y pared vascular compacta. Se puede emplear un enfoque similar para generar otros tipos de modelos de órganos epiteliales, como el intestino y el pulmón, para evaluar cómo medicamentos específicos o factores ambientales pueden afectar la homeostasis de los tejidos humanos, con un énfasis particular en la función de barrera epitelial y vascular.Con fácil acceso a la fase de eficacia del compartimiento del estroma, la investigación ahora puede generar patrones faciales específicos y reproducir la arquitectura funcional del tejido, como el cryptviveoli, que es difícil de lograr con otros dispositivos.

Research

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Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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