Name: a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

يود المؤلف أن يعرب عن تقديره لوحدات إيواء الحيوانات في جامعة لوند ، كاميلا بيوركلوف وأغنيسكا تشوبيك ، لدعمهم ، وريتشارد ويليامز ، معهد كينيدي لأمراض الروماتيزم ، جامعة أكسفورد ، المملكة المتحدة ، للنقد البناء والدعم اللغوي لإنتاج هذه المخطوطة.

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لممارسات المجلس السويدي للبحوث الحيوانية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان ، لوند مالمو ، السويد (رقم التصريح: M126-16).
ملاحظة: يتم وصف التدفق التخطيطي للطريقة في الشكل 1.
1. إعداد المواد</st...

<ol>
	<li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide:+Insights+from+the+Atlas+of+MS,+third+edition.">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li><li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+and+T+cells+driving+multiple+sclerosis:+identity,+mechanisms+and+potential+triggers.">B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers.</a> Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).</li><li>Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One,+No+One,+and+One+Hundred+Thousand:+T+Regulatory+Cells'+Multiple+Identities+in+Neuroimmunity.">One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).</li><li>Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+multiple+sclerosis--potentials+and+limitations.">Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations.</a> Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).</li><li>Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+in+Mice.">Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).</li><li>Topping, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+antigen-emulsion+preparations+for+the+induction+of+autoimmune+disease+models.">Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models.</a> Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).</li><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+vortex+method+for+preparing+antigen/adjuvant+emulsions+for+immunization.">A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).</li><li>M&#228;&#228;tt&#228;, J. A., Er&#228;linna, J. P., R&#246;ytt&#228;, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+state+of+the+neuroantigen+in+adjuvant+emulsions+determines+encephalitogenic+status+in+the+BALB/c+mouse.">Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).</li><li>Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+the+preparation+of+antigen+emulsions+for+immunization.">Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).</li><li>Waksman, B. H., Adams, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+neuritis:+an+experimental+disease+of+rabbits+induced+by+the+injection+of+peripheral+nervous+tissue+and+adjuvants.">Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants.</a> The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).</li><li>Vladutiu, A. O., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+murine+thyroiditis+relation+to+histocompatibility+(H-2)+type.">Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type.</a> Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).</li><li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+the+rat+and+mouse.">Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Tuzun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+standard+preclinical+experiments+in+the+mouse+model+of+myasthenia+gravis+induced+by+acetylcholine+receptor+immunization.">Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization.</a> Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).</li><li>Brinckerhoff, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+inhibit+proteolytic+degradation+of+an+immunogenic+MART-1(27-35)+peptide:+implications+for+peptide+vaccines.">Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines.</a> International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).</li><li>Kool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells.">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).</li><li>Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+induction+of+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice+for+the+longitudinal+study+of+pathology+and+repair.">Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair.</a> Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).</li><li>Freund, J., Lipton, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+after+the+excision+of+the+injection+site+of+antigen-adjuvant+emulsion.">Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion.</a> The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).</li><li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li><li>Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+unresponsiveness+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+resistant+mouse+strains+by+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge.">Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).</li><li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+to+assess+the+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+vivax+CS+synthetic+vaccine.">Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine.</a> Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+association+factors+for+developing+effective+peptide-based+cancer+vaccines.">Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).</li><li>Neninger Vinageras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+randomized+controlled+trial+of+an+epidermal+growth+factor+vaccine+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).</li></ol>

تم استخدام مستحلبات الماء في الزيت ، مثل مستضد / مساعد فرويند ، لأكثر من نصف قرن للحث على EAE17. لا توجد حاليا طريقة موحدة لإعداد مستحلبات المستضد مستقلة عن التأثير البشري. يعد الخلط اليدوي باستخدام المحاقن أمرا قياسيا لمعظم المختبرات ، ولكن هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا ، وغالب?...

يمكن أن يؤدي انهيار التسامح المناعي إلى توليد اضطرابات المناعة الذاتية ، مثل التصلب المتعدد (MS). تشير التقديرات إلى أن 2.8 مليون شخص يعيشون مع مرض التصلب العصبي المتعدد في جميع أنحاء العالم1. على الرغم من أن السبب الدقيق لمرض التصلب العصبي المتعدد لا يزال غير معروف إلى حد كبير ، إلا أن عدم تنظيم الخلايا التائية والبائية ذاتية التفاعل ، بالإضافة إلى العيوب في وظيفة Treg ، تلعب أدوارا مهمة في التسبب في المرض 2,3.
النماذج الحيوانية لأمراض المناعة الذاتية هي أدوات أساسية للتحقيق في الطرائق العلاجية المحتملة. تم استخدام نموذج التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) منذ ما يقرب من قرن من قبل الباحثين المهتمين ب MS4. في التجارب المبكرة ، كان معدل الإصابة بالمرض منخفضا نسبيا. مكن إدخال مساعد فرويند الكامل (CFA) ، الذي يحتوي على المتفطرة وسم السعال الديكي ، من الحث المستمر ل EAE في الفئران4. الأهم من ذلك ، من الضروري خلط CFA مع مستضد خاص بالجهاز العصبي المركزي (CNS) لتوليد مستحلب متجانس من الماء في الزيت لتحفيز EAE. تعتمد نماذج EAE الأكثر شيوعا المتاحة حاليا على التحصين النشط للفئران بالببتيدات الدماغية. تلعب الخلفية الوراثية للفئران دورا مهما في القابلية للإصابة بالأمراض ، مع بروتين سكري المايلين قليل التغصن (MOG35-55) وبروتين المايلين البروتيني (PLP139-151) الببتيدات المستخدمة للحث على EAE في الفئران C57BL / 6J و SJL ، على التوالي5. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام سلالات الفئران الأخرى والببتيدات المشتقة من الجهاز العصبي المركزي.
تعد جودة مستحلب CFA / الببتيد عاملا حاسما يحدد اختراق المرض في نموذج EAEللتحصين النشط 6. يجب تحضير مستحلب متجانس من الماء في الزيت عن طريق خلط الببتيدات الدماغية المذابة في محلول مائي مع CFA ، وإلا فلن تصاب الحيوانات بالمرض. تم نشر العديد من البروتوكولات حول تحضير مستحلبات CFA / الببتيد. ومن الأمثلة على ذلك استخدام دوامة7 ، صوتنة8 ، محاقن وموصل Tثلاثي الاتجاهات 9 ، أو حقنة واحدة فقط5. ومع ذلك ، يصعب توحيد كل هذه الطرق وغالبا ما ترتبط ببروتوكولات طويلة ومعقدة.
بالمقارنة مع جميع الطرق المذكورة أعلاه ، فإن الطريقة البسيطة الموضحة هنا لإعداد المستحلب توفر مزايا عدم وجود اختلافات من شخص لآخر وكونها سريعة نسبيا. يتم إنشاء المستحلب بواسطة خالط يهز الكواشف بسرعة ووقت ودرجة حرارة محددة ، مما يضمن نتائج سريعة ومتسقة. بالإضافة إلى تحريض المرض في نموذج EAE ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لدراسة نماذج أمراض المناعة الذاتية الأخرى مثل التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين (CIA) والتهاب المفاصل الناجم عن المستضد (AIA)6. لذلك ، من المتوقع أن يتم استخدام هذه الطريقة للحث باستمرار على المرض في النماذج الحيوانية الأخرى التي تعتمد على مستحلبات الماء في الزيت مع المستضدات الذاتية ، مثل التهاب العصب المناعي الذاتي التجريبي (EAN)10 ، والتهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي التجريبي (EAT)11 ، والتهاب القزحية المناعي الذاتي (EAU)12 ، والوهن العضلي الوبيل (MG)13. تحفز هذه الطريقة أيضا استجابات مناعية عامة مثل فرط الحساسية من النوع المتأخر (DTH) باستمرار6 ، وبالتالي يمكن استخدامها لتوصيل لقاحات السرطان والملاريا (انظر المناقشة).
وبالتالي ، تم تطوير طريقة سريعة (إجمالي وقت التحضير ~ 30 دقيقة) ، بسيطة (يمكن تحضير جميع الكواشف مسبقا وتخزينها) ، وموحدة (يتم إنجاز المستحلب باستخدام خالط الاهتزاز) ويتم تقديمها هنا. مستحلبات CFA / المستضد المحضرة باستخدام هذا البروتوكول تحفز باستمرار المرض في نماذج المناعة الذاتية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>9166017V&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 ml empty tubes with caps</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000944LYSK0A.0</td>
			<td>7 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bordetella pertussis toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2980</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersant, light mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsion kit</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>D34200.10 ea</td>
			<td>Containing a tube, cap, and plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#39;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F5506</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis, H37RA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF3114-33-8</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastersizer 2000&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Particle size analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys-Personal homogenizer</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Shaking homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG 35-55 Peptide&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Innovagen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montanide ISA 51 VG</td>
			<td>Seppic</td>
			<td>36362Z</td>
			<td>FDA-approved oil adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17124381</td>
			<td>Sterlie filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-Constrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0445832</td>
			<td>Autoclave and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648463</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis

يشترك التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) في ميزات مناعية وسريرية مماثلة مع التصلب المتعدد (MS) ، وبالتالي يستخدم على نطاق واسع كنموذج لتحديد أهداف دوائية جديدة لعلاج أفضل للمرضى. يتميز مرض التصلب العصبي المتعدد بعدة دورات مرضية مختلفة: التصلب العصبي المتعدد الانتكاسي (RRMS) ، والتصلب المتعدد التقدمي الأولي (PPMS) ، والتصلب المتعدد التدريجي الثانوي (SPMS) ، وشكل نادر من الانتكاس التدريجي (PRMS). على الرغم من أن النماذج الحيوانية لا تحاكي بدقة كل هذه الأنماط الظاهرية المتناقضة للأمراض البشرية ، إلا أن هناك نماذج EAE تعكس بعض المظاهر السريرية المختلفة لمرض التصلب العصبي المتعدد. على سبيل المثال ، يحاكي البروتين السكري قليل التغصن الميالين (MOG) الذي يسببه EAE في الفئران C57BL / 6J PPMS البشري ، بينما يشبه بروتين المايلين البروتيني (PLP) الذي يسببه EAE في الفئران SJL / J RRMS. كما تستخدم المستضدات الذاتية الأخرى ، مثل بروتين المايلين الأساسي (MBP) ، وعدد من سلالات الفئران المختلفة لدراسة EAE. للحث على المرض في نماذج EAE للتحصين الذاتي ، يتم تحضير مستحلب الماء في الزيت وحقنه تحت الجلد. تتطلب غالبية نماذج EAE أيضا حقن سم السعال الديكي حتى يتطور المرض. من أجل تحريض EAE المتسق والقابل للتكرار ، من الضروري وجود بروتوكول مفصل لإعداد الكواشف لإنتاج مستحلب مستضد / مساعد. تستفيد الطريقة الموضحة هنا من طريقة موحدة لتوليد مستحلبات الماء في الزيت. إنه بسيط وسريع ويستخدم مجانس اهتزاز بدلا من المحاقن لإعداد مستحلبات يتم التحكم في جودتها.

يوضح الشكل 1 البروتوكول السريع والبسيط والموحد لإعداد مستحلبات CFA / MOG. تم وصف هذه الطريقة مؤخرا في مكان آخر6. يمكن أيضا تحضير مستحلبات CFA / MOG بطرق أخرى ، مثل طريقة المحاقن التقليدية أو عن طريق الدوامة. تمت مقارنة هذه الطرق هنا من خلال تقييم جودة المستحلبات. أنتجت ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

للحث على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي ، وهو نموذج حيواني للتصلب المتعدد ، يتم تحصين الفئران بمستحلب ماء في زيت يحتوي على مستضد ذاتي ومساعد فرويند كامل. في حين توجد عدة بروتوكولات لإعداد هذه المستحلبات ، يتم تقديم بروتوكول تجانس سريع وبسيط وموحد لإعداد المستحلب هنا.

طريقة تجانس سريعة وبسيطة وموحدة لإعداد مستحلبات المستضد / المستحلبات المساعدة لإحداث التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي أو EAE هو نموذج حيواني يستخدم لتطوير علاجات جديدة ومحسنة لمريض التصلب المتعدد. يتطلب إحداث المرض في EAE مستحلب زيت وماء مثالي لتحقيق نتائج متسقة. طريقة تحضير المستحلب المعروضة هنا خالية من التأثير البشري ، مما يحد من التناقضات من تجربة إلى أخرى.على الرغم من أن الطريقة قد تم تحسينها ل EAE ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لنموذج أمراض المناعة الذاتية الأخرى وأيضا لاختبار لقاحات السرطان. لتحضير ملاط CFA عند 100 ملليغرام من M tuberculosis H37 RA المجفف بالتجميد وخمسة حبات فولاذية 3.2 ملم إلى أنبوب سعة سبعة ملليلتر. هز الأنبوب في الخالط لمدة 60 ثانية بأعلى إعداد للسرعة.أضف خمسة ملليلتر من مادة IFA المساعدة إلى الأنبوب ورجها مرة أخرى لمدة 60 ثانية بأعلى سرعة. ثم انقل الملاط إلى أنبوب جديد مع ماصة مع ترك الخرز خلفه وتخزينه عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام. لتحضير مستحلب CFA / Peptide ، قم بتنزيل الملف التكميلي الأول لحساب الكمية المطلوبة لكل كاشف.ثم ضع الأنبوب اللولبي المغطى والكواشف لاستخدامها على الجليد. بعد ذلك ، أضف مكونات المستحلب. أولا PBS ، ثم الببتيد ، ملاط CFA.وأخيرا ، IFA. أغلق الأنبوب بالغطاء بإحكام عن طريق شده وتخفيفه عدة مرات. هز الأنبوب بقوة لمدة 5 إلى 10 ثوان باليد لخلط الكواشف مسبقا.ضع الأنبوب في الخالط المهتز وقم بتثبيته بالقضيب. اضبط السرعة على أعلى إعداد والوقت على 60 ثانية. بمجرد الانتهاء من الجري ، ضع الأنبوب على الثلج لمدة ثلاث دقائق وكرر الجري مرة أو مرتين بنفس الإعدادات.قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 جم من دقيقة واحدة لإزالة الهواء المحبوس وضغط المستحلب. قم بإزالة الغطاء من الأنبوب. أدخل المكبس في الأنبوب ، وادفعه لأسفل ببطء حتى يصل إلى قمة المستحلب.قم بإزالة العلبة المفاجئة في الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق لفها. بعد ذلك ، قم بإزالة المكبس من جميع محاقن الحقن وأضف إبرة إلى محاقن الحقن. ثم قم بتوصيل الجزء الخلفي من حقنة الحقن بالقفل المخصص في الجزء السفلي من الأنبوب وقفله بلف قصير.انقل المستحلب من الأنبوب إلى حقنة الحقن عن طريق دفع المكبس برفق. توقف عندما يصل المستحلب إلى تخريج 0.15 ملليلتر من حقنة الحقن. افصل حقنة الحقن عن الأنبوب وأدخل المكبس بعناية مع الحرص على عدم دخول الهواء إلى هذه المحقنة.ادفع المكبس حتى يخرج المستحلب من الإبرة وكرر العملية لبقية المستحلب الموجود في الأنبوب. لتحليل حجم الماء وجزيئات الزيت ، أضف قطرة صغيرة من المستحلب إلى شريحة مجهرية ، وقم بتشويهها بزلة غطاء ، ثم ادفع بقوة بحركة دائرية لتسطيح المستحلب. افحص المستحلب الملطخ تحت مجهر تباين الطور بتكبير 400 مرة وركز على حقل به طبقة أحادية من المستحلب.تأكد من ظهور جزيئات صغيرة أو موحدة أو رمادية أو بيضاء. عرضت المستحلبات الناتجة عن طريقة التجانس جزيئات رمادية أو بيضاء على شكل حبة تمثل قطرات صغيرة من الماء ومستحلبات الزيت. في المقابل ، كانت قطرات المستحلب الناتجة باستخدام طريقة المحاقن أكبر وأوسع.في طريقة الدوامة ، لوحظت جزيئات رمادية أو سوداء كبيرة تتوافق مع فقاعات الهواء المحاصرة في المستحلب. لم تظهر التغييرات في توزيع حجم الجسيمات بمرور الوقت المقاسة باستخدام محلل حجم جسيمات الانكسار بالليزر لمستحلبات الماء والزيت أي تغيير في حجم الجسيمات على مدى ستة أسابيع. تسببت المستحلبات الطازجة البالغة من العمر 3 أسابيع و 15 أسبوعا في حدوث أمراض EAE مماثلة في جميع الحيوانات التي تم اختبارها طوال التجربة.طورت الفئران نمطا مرضيا مشابها في جميع التجارب التي كشفت أن طريقة التجانس المعروضة هنا أنتجت مستحلبات تحفز EAE بطريقة متسقة وقابلة للتكرار. قبل عمل المستحلب للتجربة ، قم بتنزيل الملف التكميلي رقم واحد لحساب كمية كل مكون مطلوب لتقليل النفايات. يمكن استخدام الطريقة المقدمة هنا لتوحيد إعداد المستحلب ليس فقط للبحوث قبل السريرية ، ولكن أيضا في المستقبل لإعداد لقاحات السرطان في العيادة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

إعداد مستمنع ماوس النخامية للتحريض التهاب النخامية الذاتية التجريبي

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

تحريض التهاب النخامية الذاتية التجريبية في الفئران SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

التغلب على عدم التجاوب في التجارب الذاتية التهاب الدماغ (EAE) سلالات الفئران المقاومة للنقل بواسطة بالتبني والتحدي الأنتيجين

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

المايلين دبقية قليلة التغصن جلايكوبروتين (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) المستحثة التجريبية المناعة الذاتية التهاب الدماغ (EAE) في C57BL / 6 الفئران

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

تحريض التجريبية المناعة الذاتية التهاب الدماغ في الفئران وتقييم توزيع الأمراض التي تعتمد على خلايا المناعة في الأنسجة المختلفة

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

وتدفق Cytometric بسيط طريقة لقياس امتصاص الغلوكوز والجلوكوز التعبير الناقل للالقطعان الوحيدات في الدم الكامل

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

إنتاج بسيطة وفعالة وتنقية ماوس المايلين دبقية قليلة التغصن البروتين السكري لالتجريبية المناعة الذاتية الدراسات التهاب الدماغ

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

تصور ضعف الحواجز بطانية والدبقيه نيوروفاسكولار وحدة خلال النخاع الذاتية التجريبية في فيفو

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

تحليل تدفق Cytometric لتسلل الخلايا اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي أثناء التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...