Name: a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

De auteur wil graag de dierenverblijven van de Universiteit van Lund, Camilla Björklöv en Agnieszka Czopek, bedanken voor hun steun, en Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, VK, voor constructieve kritiek en taalkundige ondersteuning bij het produceren van dit manuscript.

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de praktijken van de Zweedse Raad voor Dieronderzoek en werden goedgekeurd door de Commissie Voor Dierenethiek, Lund-Malmö, Zweden (Vergunningsnummer: M126-16).
OPMERKING: Een schematische stroom van de methode wordt beschreven in figuur 1.
1. Materiaalvoorbereiding
OPMERKING: Bereid alle reagentia aseptisch in een steriele kap en bewaar ze bij de ...

<ol>
	<li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide:+Insights+from+the+Atlas+of+MS,+third+edition.">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li><li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+and+T+cells+driving+multiple+sclerosis:+identity,+mechanisms+and+potential+triggers.">B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers.</a> Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).</li><li>Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One,+No+One,+and+One+Hundred+Thousand:+T+Regulatory+Cells'+Multiple+Identities+in+Neuroimmunity.">One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).</li><li>Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+multiple+sclerosis--potentials+and+limitations.">Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations.</a> Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).</li><li>Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+in+Mice.">Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).</li><li>Topping, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+antigen-emulsion+preparations+for+the+induction+of+autoimmune+disease+models.">Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models.</a> Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).</li><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+vortex+method+for+preparing+antigen/adjuvant+emulsions+for+immunization.">A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).</li><li>M&#228;&#228;tt&#228;, J. A., Er&#228;linna, J. P., R&#246;ytt&#228;, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+state+of+the+neuroantigen+in+adjuvant+emulsions+determines+encephalitogenic+status+in+the+BALB/c+mouse.">Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).</li><li>Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+the+preparation+of+antigen+emulsions+for+immunization.">Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).</li><li>Waksman, B. H., Adams, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+neuritis:+an+experimental+disease+of+rabbits+induced+by+the+injection+of+peripheral+nervous+tissue+and+adjuvants.">Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants.</a> The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).</li><li>Vladutiu, A. O., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+murine+thyroiditis+relation+to+histocompatibility+(H-2)+type.">Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type.</a> Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).</li><li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+the+rat+and+mouse.">Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Tuzun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+standard+preclinical+experiments+in+the+mouse+model+of+myasthenia+gravis+induced+by+acetylcholine+receptor+immunization.">Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization.</a> Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).</li><li>Brinckerhoff, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+inhibit+proteolytic+degradation+of+an+immunogenic+MART-1(27-35)+peptide:+implications+for+peptide+vaccines.">Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines.</a> International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).</li><li>Kool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells.">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).</li><li>Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+induction+of+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice+for+the+longitudinal+study+of+pathology+and+repair.">Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair.</a> Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).</li><li>Freund, J., Lipton, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+after+the+excision+of+the+injection+site+of+antigen-adjuvant+emulsion.">Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion.</a> The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).</li><li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li><li>Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+unresponsiveness+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+resistant+mouse+strains+by+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge.">Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).</li><li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+to+assess+the+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+vivax+CS+synthetic+vaccine.">Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine.</a> Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+association+factors+for+developing+effective+peptide-based+cancer+vaccines.">Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).</li><li>Neninger Vinageras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+randomized+controlled+trial+of+an+epidermal+growth+factor+vaccine+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).</li></ol>

Water-in-olie-emulsies, zoals antigeen /Freund's adjuvans, worden al meer dan een halve eeuw gebruikt om EAE17 te induceren. Er is momenteel geen gestandaardiseerde methode om antigeenemulsies te bereiden die onafhankelijk is van menselijke invloed. Handmatig mengen met spuiten is standaard voor de meeste laboratoria, maar deze methode is tijdrovend, resulteert vaak in een overmatig verlies van materiaal en de kwaliteit verschilt afhankelijk van de wetenschapper die het bereidt.
<p class="jove...

Een afbraak van immunologische tolerantie kan leiden tot het ontstaan van auto-immuunziekten, zoals multiple sclerose (MS). Naar schatting leven wereldwijd 2,8 miljoen mensen met MS1. Hoewel de exacte oorzaak van MS nog grotendeels onbekend is, spelen ontregeling van autoreactieve T- en B-cellen, evenals defecten in de Treg-functie, een belangrijke rol in de pathogenese van de ziekte 2,3.
Diermodellen van auto-immuunziekten zijn essentiële hulpmiddelen om potentiële therapeutische modaliteiten te onderzoeken. Het experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) model wordt al bijna een eeuw gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in MS4. In vroege experimenten was de incidentie van de ziekte relatief laag. De introductie van complete Freund's adjuvans (CFA), dat Mycobacterium en kinkhoesttoxine bevat, maakte de consistente inductie van EAE bij muizen4 mogelijk. Het belangrijkste is dat het noodzakelijk is om CFA te mengen met een centraal zenuwstelsel (CZS) -specifiek antigeen om een homogene water-in-olie-emulsie te genereren voor het induceren van EAE. De meest voorkomende momenteel beschikbare EAE-modellen zijn gebaseerd op de actieve immunisatie van muizen met encefanietgene peptiden. De genetische achtergrond van de muizen speelt een belangrijke rol bij ziektegevoeligheid, met myeline oligodendrocytenglycoproteïne (MOG35-55) en myeline proteolipide-eiwit (PLP139-151) peptiden die worden gebruikt om EAE te induceren in respectievelijk C57BL / 6J- en SJL-muizen, respectievelijk5. Andere muizenstammen en van het CZS afgeleide peptiden kunnen echter ook worden gebruikt.
De kwaliteit van de CFA/peptide-emulsie is een kritische factor die de penetrantie van de ziekte bepaalt in het actieve immunisatie EAE-model6. Een homogene water-in-olie-emulsie moet worden bereid door de encefanietgene peptiden opgelost in waterige buffer te mengen met CFA, anders zullen dieren de ziekte niet ontwikkelen. Er zijn tal van protocollen gepubliceerd over de bereiding van CFA/peptide-emulsies. Voorbeelden zijn het gebruik van een vortex7, ultrasoonapparaat8, spuiten en een drieweg T-connector9, of slechts één spuit5. Al deze methoden zijn echter moeilijk te standaardiseren en worden vaak geassocieerd met langdurige en gecompliceerde protocollen.
In vergelijking met alle bovenstaande methoden biedt de eenvoudige methode die hier wordt beschreven voor emulsiebereiding de voordelen van het hebben van geen verschillen van persoon tot persoon en relatief snel zijn. De emulsie wordt gegenereerd door een homogenisator die de reagentia schudt met een ingestelde snelheid, tijd en temperatuur, wat zorgt voor snelle en consistente resultaten. Naast het induceren van ziekte in het EAE-model, kan deze methode ook worden gebruikt om andere auto-immuunziektemodellen te bestuderen, zoals collageen-geïnduceerde artritis (CIA) en antigeen geïnduceerde artritis (AIA)6. Daarom wordt verwacht dat deze methode kan worden gebruikt om consequent ziekte te induceren in andere diermodellen die afhankelijk zijn van water-in-olie-emulsies met autoantigenen, zoals experimentele auto-immuunneuritis (EAN) 10, experimentele auto-immune thyroiditis (EAT) 11, auto-immuun uveïtis (EAU) 12 en myasthenia gravis (MG) 13. Deze methode induceert ook algemene immuunresponsen zoals vertraagde overgevoeligheid (DTH) consistent6, en kan daarom worden gebruikt voor het leveren van kanker- en malariavaccins (zie discussie).
Zo is een snelle (totale bereidingstijd ~ 30 min), eenvoudige (alle reagentia kunnen van tevoren worden bereid en opgeslagen) en gestandaardiseerde (de emulsie wordt bereikt met behulp van een schudhomogenisator) methode ontwikkeld en hier gepresenteerd. De CFA/antigeen emulsies bereid met behulp van dit protocol induceren consequent ziekte in auto-immuun diermodellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>9166017V&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 ml empty tubes with caps</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000944LYSK0A.0</td>
			<td>7 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bordetella pertussis toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2980</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersant, light mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsion kit</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>D34200.10 ea</td>
			<td>Containing a tube, cap, and plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#39;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F5506</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis, H37RA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF3114-33-8</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastersizer 2000&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Particle size analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys-Personal homogenizer</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Shaking homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG 35-55 Peptide&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Innovagen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montanide ISA 51 VG</td>
			<td>Seppic</td>
			<td>36362Z</td>
			<td>FDA-approved oil adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17124381</td>
			<td>Sterlie filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-Constrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0445832</td>
			<td>Autoclave and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648463</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis

Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) deelt vergelijkbare immunologische en klinische kenmerken met multiple sclerose (MS) en wordt daarom veel gebruikt als model om nieuwe medicijndoelen te identificeren voor een betere behandeling van patiënten. MS wordt gekenmerkt door verschillende ziekteverloop: relapsing-remitting MS (RRMS), primaire progressieve MS (PPMS), secundair progressieve MS (SPMS) en een zeldzame progressief-recidiverende vorm van MS (PRMS). Hoewel diermodellen niet al deze contrasterende fenotypen van menselijke ziekten nauwkeurig nabootsen, zijn er EAE-modellen die enkele van de verschillende klinische manifestaties van MS weerspiegelen. Bijvoorbeeld, myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) -geïnduceerde EAE in C57BL / 6J-muizen bootst menselijke PPMS na, terwijl myeline proteolipide-eiwit (PLP) -geïnduceerde EAE in SJL / J-muizen lijkt op RRMS. Andere autoantigenen, zoals myeline basiseiwit (MBP), en een aantal verschillende muizenstammen worden ook gebruikt om EAE te bestuderen. Om ziekte te induceren in deze auto-antigeen-immunisatie EAE-modellen, wordt een water-in-olie-emulsie voorbereid en subcutaan geïnjecteerd. De meeste EAE-modellen vereisen ook een injectie van kinkhoesttoxine om de ziekte te ontwikkelen. Voor consistente en reproduceerbare EAE-inductie is een gedetailleerd protocol nodig om de reagentia voor te bereiden op de productie van antigeen/adjuvante emulsies. De hier beschreven methode maakt gebruik van een gestandaardiseerde methode om water-in-olie-emulsies te genereren. Het is eenvoudig en snel en gebruikt een schuddende homogenisator in plaats van spuiten om kwaliteitsgecontroleerde emulsies te bereiden.

Het snelle, eenvoudige en gestandaardiseerde protocol voor de bereiding van CFA/MOG-emulsies is weergegeven in figuur 1. Deze methode is onlangs elders beschreven6. De CFA/MOG emulsies kunnen ook worden bereid met andere methoden, zoals de traditionele spuitmethode of door vortexing. Deze methoden werden hier vergeleken door de kwaliteit van de emulsies te beoordelen. Alle methoden produceerden water-in-olie-emulsies; de homogeniteit en kwaliteit van deze emulsies wer...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Om experimentele auto-immune encefalomyelitis, een diermodel van multiple sclerose, te induceren, worden muizen geïmmuniseerd met een water-in-olie-emulsie die een autoantigeen bevat en het adjuvans van Freund compleet maakt. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor de bereiding van deze emulsies, wordt hier een snel, eenvoudig en gestandaardiseerd homogenisatieprotocol voor emulsievoorbereiding gepresenteerd.

Een snelle, eenvoudige en gestandaardiseerde homogenisatiemethode om antigeen / adjuvante emulsies voor te bereiden voor het induceren van experimentele auto-immune encefalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

Experimentele auto-immune encefalomyelitis of EAE is een diermodel dat wordt gebruikt om nieuwe en verbeterde behandelingen voor multiple sclerosepatiënten te ontwikkelen. Het induceren van ziekten in EAE vereist een perfecte olie- en wateremulsie om consistente resultaten te bereiken. De hier gepresenteerde methode van emulsiepreparaat is vrij van menselijke invloed, waardoor inconsistenties van het ene experiment naar het andere worden beperkt.Hoewel de methode is geoptimaliseerd voor EAE, kan deze ook worden gebruikt voor andere auto-immuunziektemodellen en ook om kankervaccins te testen. Om de CFA-slurry te bereiden op 100 milligram gevriesdroogde M tuberculosis H37 RA en vijf, 3,2 millimeter stalen kralen aan een buis van zeven milliliter. Schud de buis in de homogenisator gedurende 60 seconden op de hoogste snelheidsinstelling.Voeg vijf milliliter IFA-adjuvans toe aan de buis en schud opnieuw gedurende 60 seconden met de hoogste snelheid. Breng vervolgens de slurry over in een verse buis met een pipet die de kralen achterlaat en bewaar bij vier graden Celsius tot gebruik. Om een CFA/Peptide-emulsie voor te bereiden, downloadt u aanvullend bestand één om de hoeveelheid te berekenen die nodig is voor elk reagens.Plaats vervolgens de buis met schroefdeksel en de reagentia die moeten worden gebruikt op ijs. Voeg vervolgens de emulsiecomponenten toe. Eerst PBS, dan het peptide, de CFA-slurry.En tot slot IFA. Sluit de buis met de dop stevig af door deze meerdere keren aan te spannen en los te maken. Schud de tube krachtig gedurende 5 tot 10 seconden met de hand om de reagentia vooraf te mengen.Plaats de buis in de schudhomogenisator en zet deze vast met de staaf. Stel de snelheid in op de hoogste stand en de tijd op 60 seconden. Zodra de run is voltooid, plaatst u de buis drie minuten op ijs en herhaalt u de run nog een of twee keer met dezelfde instellingen.Centrifugeer de buis vanaf één minuut op 300 G om opgesloten lucht te verwijderen en de emulsie te verdichten. Verwijder de dop van de buis. Steek de zuiger in de buis en duw deze langzaam naar beneden totdat deze de bovenkant van de emulsie bereikt.Verwijder de snap-off behuizing aan de onderkant van de buis door deze te draaien. Verwijder vervolgens de zuiger uit alle injectiespuiten en voeg een naald toe aan de injectiespuiten. Bevestig vervolgens de achterkant van de injectiespuit aan het speciale slot aan de onderkant van de buis en vergrendel deze met een korte draai.Breng de emulsie van de buis over naar de injectiespuit door de zuiger voorzichtig in te drukken. Stop wanneer de emulsie de schaalverdeling van 0,15 milliliter van de injectiespuit bereikt. Scheid de injectiespuit van de buis en plaats de zuiger voorzichtig en zorg ervoor dat er geen lucht in deze spuit komt.Druk op de zuiger totdat de emulsie uit de naald komt en herhaal het proces voor de rest van de emulsie die in de buis aanwezig is. Om de grootte van het water en de oliedeeltjes te analyseren, voegt u een kleine druppel van de emulsie toe aan een microscoopglaasje, smeert u deze uit met een afdekslip en duwt u vervolgens hard in een cirkelvormige beweging om de emulsie af te vlakken. Onderzoek de uitgesmeerde emulsie onder een fasecontrastmicroscoop met 400 keer vergroting en focus op een veld met een monolaag van de emulsie.Zorg ervoor dat kleine, uniforme, grijze of witte deeltjes zichtbaar zijn. Emulsies geproduceerd door de homogenisatiemethode vertoonden grijze of witte boonvormige deeltjes die kleine druppeltjes water en olie-emulsies vertegenwoordigden. Daarentegen waren de emulsedruppels die met behulp van de spuitmethode werden geproduceerd groter en breder.In de vortexmethode werden grote grijze of zwarte deeltjes waargenomen die overeenkomen met luchtbellen die in de emulsie gevangen zitten. Veranderingen in de deeltjesgrootteverdeling in de loop van de tijd, gemeten met behulp van een laserdefractiondeeltjesgrootteanalysator voor water- en olie-emulsies, vertoonden geen verandering in deeltjesgrootte gedurende een periode van zes weken. De verse emulsies van 3 weken oud en 15 weken oud veroorzaakten allemaal vergelijkbare EAE-ziekten bij alle dieren die tijdens het experiment werden getest.Muizen ontwikkelden een vergelijkbaar ziektepatroon in alle experimenten waaruit bleek dat de hier gepresenteerde homogenisatiemethode emulsies produceerde die EAE op een consistente en reproduceerbare manier induceerden. Voordat u de emulsie voor een experiment maakt, downloadt u het aanvullende bestand nummer één om de hoeveelheid van elke component te berekenen die nodig is om verspilling te minimaliseren. De hier gepresenteerde methode kan worden gebruikt om emulsiepreparaat te standaardiseren, niet alleen voor preklinisch onderzoek, maar ook in de toekomst om kankervaccins in de kliniek te bereiden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Voorbereiding van de muis hypofyse Immunogeen voor de inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Inductie van experimentele auto-immune Hypophysitis in SJL Muizen

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myeline Oligodendrocyte glycoproteïne (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Geïnduceerde experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 muizen

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Inductie van experimentele auto-immune Encefalomyelitis in Muizen en evaluatie van de ziekte-afhankelijke Verdeling van immuuncellen in verschillende weefsels

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Een eenvoudige Flowcytometrische methode om te meten glucose opname en Glucose Transporter Expression voor monocyten subpopulaties in volbloed

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...