Name: a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

L’auteur tient à remercier les unités de logement des animaux de l’Université de Lund, Camilla Björklöv et Agnieszka Czopek, pour leur soutien, ainsi que Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, Université d’Oxford, Royaume-Uni, pour la critique constructive et le soutien linguistique qui ont produit ce manuscrit.

Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux pratiques du Conseil suédois de la recherche animale et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale, Lund-Malmö, Suède (numéro de permis: M126-16).
Remarque : Un flux schématique de la méthode est décrit à la figure 1.
1. Préparation du matériel
NOTE: Préparer tous les réactifs de manière a...

<ol>
	<li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide:+Insights+from+the+Atlas+of+MS,+third+edition.">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li><li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+and+T+cells+driving+multiple+sclerosis:+identity,+mechanisms+and+potential+triggers.">B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers.</a> Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).</li><li>Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One,+No+One,+and+One+Hundred+Thousand:+T+Regulatory+Cells'+Multiple+Identities+in+Neuroimmunity.">One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).</li><li>Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+multiple+sclerosis--potentials+and+limitations.">Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations.</a> Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).</li><li>Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+in+Mice.">Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).</li><li>Topping, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+antigen-emulsion+preparations+for+the+induction+of+autoimmune+disease+models.">Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models.</a> Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).</li><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+vortex+method+for+preparing+antigen/adjuvant+emulsions+for+immunization.">A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).</li><li>M&#228;&#228;tt&#228;, J. A., Er&#228;linna, J. P., R&#246;ytt&#228;, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+state+of+the+neuroantigen+in+adjuvant+emulsions+determines+encephalitogenic+status+in+the+BALB/c+mouse.">Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).</li><li>Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+the+preparation+of+antigen+emulsions+for+immunization.">Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).</li><li>Waksman, B. H., Adams, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+neuritis:+an+experimental+disease+of+rabbits+induced+by+the+injection+of+peripheral+nervous+tissue+and+adjuvants.">Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants.</a> The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).</li><li>Vladutiu, A. O., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+murine+thyroiditis+relation+to+histocompatibility+(H-2)+type.">Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type.</a> Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).</li><li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+the+rat+and+mouse.">Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Tuzun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+standard+preclinical+experiments+in+the+mouse+model+of+myasthenia+gravis+induced+by+acetylcholine+receptor+immunization.">Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization.</a> Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).</li><li>Brinckerhoff, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+inhibit+proteolytic+degradation+of+an+immunogenic+MART-1(27-35)+peptide:+implications+for+peptide+vaccines.">Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines.</a> International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).</li><li>Kool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells.">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).</li><li>Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+induction+of+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice+for+the+longitudinal+study+of+pathology+and+repair.">Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair.</a> Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).</li><li>Freund, J., Lipton, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+after+the+excision+of+the+injection+site+of+antigen-adjuvant+emulsion.">Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion.</a> The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).</li><li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li><li>Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+unresponsiveness+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+resistant+mouse+strains+by+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge.">Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).</li><li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+to+assess+the+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+vivax+CS+synthetic+vaccine.">Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine.</a> Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+association+factors+for+developing+effective+peptide-based+cancer+vaccines.">Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).</li><li>Neninger Vinageras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+randomized+controlled+trial+of+an+epidermal+growth+factor+vaccine+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).</li></ol>

Les émulsions eau-dans-huile, telles que l’antigène/adjuvant de Freund, sont utilisées depuis plus d’un demi-siècle pour induire EAE17. Il n’existe actuellement aucune méthode normalisée pour préparer des émulsions d’antigènes indépendante de l’influence humaine. Le mélange manuel à l’aide de seringues est standard pour la plupart des laboratoires, mais cette méthode prend du temps, entraîne souvent une perte excessive de matériel et la qualité diffère selon le scienti...

Une rupture de la tolérance immunologique peut entraîner la génération de maladies auto-immunes, telles que la sclérose en plaques (SEP). On estime que 2,8 millions de personnes vivent avec la SEP dans le monde1. Bien que la cause exacte de la SEP soit encore largement inconnue, la dérégulation des cellules T et B autoréactives, ainsi que les défauts de la fonction Treg, jouent un rôle important dans la pathogenèse de la maladie 2,3.
Les modèles animaux de maladies auto-immunes sont des outils essentiels pour étudier les modalités thérapeutiques potentielles. Le modèle expérimental d’encéphalomyélite auto-immune (EAE) est utilisé depuis près d’un siècle par les chercheurs qui s’intéressent à la SEP4. Dans les premières expériences, l’incidence de la maladie était relativement faible. L’introduction de l’adjuvant de Freund complet (CFA), contenant Mycobacterium et la toxine de la coqueluche, a permis l’induction constante de l’EAE chez la souris4. Plus important encore, il est nécessaire de mélanger le CFA avec un antigène spécifique du système nerveux central (SNC) pour générer une émulsion homogène eau dans huile pour induire EAE. Les modèles EAE les plus courants actuellement disponibles sont basés sur l’immunisation active de souris avec des peptides encéphalitogènes. Le fond génétique des souris joue un rôle important dans la susceptibilité à la maladie, avec les peptides de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG35-55) et de la protéine protéolipide de myéline (PLP139-151) utilisés pour induire EAE chez les souris C57BL / 6J et SJL, respectivement5. Cependant, d’autres souches de souris et des peptides dérivés du SNC peuvent également être utilisés.
La qualité de l’émulsion CFA/peptide est un facteur critique qui détermine la pénétrance de la maladie dans l’immunisation active EAE modèle6. Une émulsion homogène eau dans huile doit être préparée en mélangeant les peptides encéphalitogènes dissous dans un tampon aqueux avec du CFA, sinon les animaux ne développeront pas la maladie. De nombreux protocoles ont été publiés sur la préparation des émulsions CFA/peptides. Les exemples incluent l’utilisation d’un vortex7, de la sonication8, de seringues et d’un connecteur T à trois voies9, ou d’une seringue seulement5. Cependant, toutes ces méthodes sont difficiles à normaliser et sont souvent associées à des protocoles longs et compliqués.
Par rapport à toutes les méthodes ci-dessus, la méthode simple décrite ici pour la préparation de l’émulsion offre les avantages de ne pas avoir de différences de personne à personne et d’être relativement rapide. L’émulsion est générée par un homogénéisateur secouant les réactifs avec une vitesse, un temps et une température définis, assurant des résultats rapides et cohérents. En plus d’induire la maladie dans le modèle EAE, cette méthode peut également être utilisée pour étudier d’autres modèles de maladies auto-immunes telles que l’arthrite induite par le collagène (ICA) et l’arthrite induite par l’antigène (AIA)6. Par conséquent, on s’attend à ce que cette méthode puisse être utilisée pour induire systématiquement la maladie dans d’autres modèles animaux qui dépendent d’émulsions eau-dans-huile avec des autoantigènes, tels que la névrite auto-immune expérimentale (EAN)10, la thyroïdite auto-immune expérimentale (EAT)11, l’uvéite auto-immune (EAU)12 et la myasthénie grave (MG)13. Cette méthode induit également des réponses immunitaires générales telles que l’hypersensibilité de type retardé (DTH) de manière constante6, et pourrait donc être utilisée pour administrer des vaccins anticancéreux et antipaludiques (voir discussion).
Ainsi, une méthode rapide (temps de préparation total ~30 min), simple (tous les réactifs peuvent être préparés à l’avance et stockés) et standardisée (l’émulsion est réalisée à l’aide d’un homogénéisateur agité) a été développée et est présentée ici. Les émulsions CFA/antigène préparées à l’aide de ce protocole induisent systématiquement la maladie dans des modèles animaux auto-immuns.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>9166017V&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 ml empty tubes with caps</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000944LYSK0A.0</td>
			<td>7 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bordetella pertussis toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2980</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersant, light mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsion kit</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>D34200.10 ea</td>
			<td>Containing a tube, cap, and plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#39;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F5506</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis, H37RA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF3114-33-8</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastersizer 2000&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Particle size analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys-Personal homogenizer</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Shaking homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG 35-55 Peptide&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Innovagen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montanide ISA 51 VG</td>
			<td>Seppic</td>
			<td>36362Z</td>
			<td>FDA-approved oil adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17124381</td>
			<td>Sterlie filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-Constrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0445832</td>
			<td>Autoclave and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648463</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) partage des caractéristiques immunologiques et cliniques similaires à celles de la sclérose en plaques (SEP) et est donc largement utilisée comme modèle pour identifier de nouvelles cibles médicamenteuses pour un meilleur traitement des patients. La SEP se caractérise par plusieurs évolutions différentes de la maladie : la SEP cyclique (SEP-RR), la SEP progressive primaire (SPPP), la SEP progressive secondaire (SEP-SP) et une forme rare de SEP progressive-récurrente (SEP-PR). Bien que les modèles animaux n’imitent pas avec précision tous ces phénotypes de maladies humaines contrastées, il existe des modèles EAE qui reflètent certaines des différentes manifestations cliniques de la SEP. Par exemple, l’EAE induite par la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG) chez les souris C57BL/6J imite la SPPP humaine, tandis que l’EAE induite par la protéine protéolipide de myéline (PLP) chez les souris SJL/J ressemble à la SEP-RR. D’autres autoantigènes, tels que la protéine basique de myéline (MBP), et un certain nombre de souches de souris différentes sont également utilisés pour étudier EAE. Pour induire la maladie dans ces modèles EAE d’auto-immunisation antigène, une émulsion eau dans huile est préparée et injectée par voie sous-cutanée. La majorité des modèles EAE nécessitent également une injection de toxine de la coqueluche pour que la maladie se développe. Pour une induction EAE cohérente et reproductible, un protocole détaillé pour préparer les réactifs à produire des émulsions antigènes/adjuvants est nécessaire. La méthode décrite ici tire parti d’une méthode standardisée pour générer des émulsions eau dans huile. Il est simple et rapide et utilise un homogénéisateur à agitation au lieu de seringues pour préparer des émulsions de qualité contrôlée.

Le protocole rapide, simple et normalisé pour la préparation des émulsions CFA/MOG est illustré à la figure 1. Cette méthode a récemment été décrite ailleurs6. Les émulsions CFA/MOG peuvent également être préparées avec d’autres méthodes, telles que la méthode traditionnelle de seringue ou par vortex. Ces méthodes ont été comparées ici en évaluant la qualité des émulsions. Toutes les méthodes ont produit des émulsions eau dans huile; L’ho...

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A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal de sclérose en plaques, les souris sont immunisées avec une émulsion eau dans huile contenant un autoantigène et un adjuvant de Freund complet. Bien qu’il existe plusieurs protocoles pour la préparation de ces émulsions, un protocole d’homogénéisation rapide, simple et standardisé pour la préparation de l’émulsion est présenté ici.

Procédé d’homogénéisation rapide, simple et normalisé pour préparer des émulsions antigènes/adjuvants pour induire une encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale ou EAE est un modèle animal utilisé pour développer des traitements nouveaux et améliorés pour les patients atteints de sclérose en plaques. L’induction de maladies dans EAE nécessite une émulsion d’huile et d’eau parfaite pour obtenir des résultats cohérents. La méthode de préparation de l’émulsion présentée ici est exempte d’influence humaine, limitant ainsi les incohérences d’une expérience à l’autre.Même si la méthode a été optimisée pour EAE, elle peut également être utilisée pour d’autres modèles de maladies auto-immunes et également pour tester des vaccins contre le cancer. Pour préparer la boue CFA à 100 milligrammes de M tuberculosis H37 RA lyophilisée et cinq billes d’acier de 3,2 millimètres dans un tube de sept millilitres. Secouez le tube dans l’homogénéisateur pendant 60 secondes à la vitesse la plus élevée.Ajouter cinq millilitres d’adjuvant IFA dans le tube et agiter à nouveau pendant 60 secondes à la vitesse la plus élevée. Ensuite, transférer la boue dans un tube frais avec une pipette en laissant les perles derrière et stocker à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour préparer une émulsion CFA/peptide, téléchargez le fichier supplémentaire un pour calculer la quantité nécessaire pour chaque réactif.Placez ensuite le tube à vis et les réactifs à utiliser sur la glace. Ensuite, ajoutez les composants d’émulsion. D’abord le PBS, puis le peptide, la boue CFA.Et enfin, l’IFA. Fermez fermement le tube avec le capuchon en le serrant et en le desserrant plusieurs fois. Secouez vigoureusement le tube pendant 5 à 10 secondes à la main pour prémélanger les réactifs.Placez le tube dans l’homogénéisateur secouant et fixez-le avec la tige. Réglez la vitesse sur le paramètre le plus élevé et la durée sur 60 secondes. Une fois la course terminée, placez le tube sur la glace pendant trois minutes et répétez la course une ou deux fois de plus avec les mêmes réglages.Centrifuger le tube à 300 G en une minute pour éliminer l’air emprisonné et compacter l’émulsion. Retirez le capuchon du tube. Insérez le piston dans le tube et poussez-le lentement jusqu’à ce qu’il atteigne le sommet de l’émulsion.Retirez le boîtier à encliqueter au fond du tube en le tordant. Ensuite, retirez le piston de toutes les seringues d’injection et ajoutez une aiguille aux seringues d’injection. Ensuite, fixez l’arrière de la seringue d’injection à la serrure dédiée au bas du tube et verrouillez-la avec une courte torsion.Transférer l’émulsion du tube à la seringue d’injection en poussant doucement le piston. Arrêtez lorsque l’émulsion atteint la graduation de 0,15 millilitre de la seringue d’injection. Séparez la seringue d’injection du tube et insérez soigneusement le piston en veillant à ce qu’aucun air ne pénètre dans cette seringue.Poussez le piston jusqu’à ce que l’émulsion sorte de l’aiguille et répétez le processus pour le reste de l’émulsion présente dans le tube. Pour analyser la taille des particules d’eau et d’huile, ajoutez une minuscule goutte de l’émulsion à une lame de microscope, enduisez-la d’un couvercle, puis poussez fort dans un mouvement circulaire pour aplatir l’émulsion. Examinez l’émulsion étalée sous un microscope à contraste de phase avec un grossissement de 400 fois et concentrez-vous sur un champ avec une monocouche de l’émulsion.Assurez-vous que les petites particules uniformes, grises ou blanches sont visibles. Les émulsions produites par la méthode d’homogénéisation présentaient des particules grises ou blanches en forme de haricot représentant de minuscules gouttelettes d’émulsions d’eau et d’huile. En revanche, les gouttelettes d’émulsion produites à l’aide de la méthode de la seringue étaient plus grosses et plus larges.Dans la méthode du vortex, de grosses particules grises ou noires ont été observées correspondant à des bulles d’air piégées dans l’émulsion. Les changements dans la distribution granulométrique au fil du temps mesurés à l’aide d’un analyseur granulométrique à défraction laser pour les émulsions d’eau et d’huile n’ont montré aucun changement de la taille des particules sur une période de six semaines. Les émulsions fraîches âgées de 3 semaines et de 15 semaines ont toutes induit des maladies EAE similaires chez tous les animaux testés tout au long de l’expérience.Les souris ont développé un schéma pathologique similaire dans toutes les expériences, révélant que la méthode d’homogénéisation présentée ici produisait des émulsions qui induisaient l’EAE de manière cohérente et reproductible. Avant de créer l’émulsion pour une expérience, téléchargez le fichier supplémentaire numéro un pour calculer la quantité de chaque composant nécessaire pour minimiser les déchets. La méthode présentée ici pourrait être utilisée pour normaliser la préparation de l’émulsion non seulement pour la recherche préclinique, mais aussi à l’avenir pour préparer des vaccins contre le cancer en clinique.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Préparation de la souris Immunogène hypophysaires pour l&#39;induction de hypophysite auto-immune expérimentale

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Recherche

Immunologie et infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

L&#39;induction de hypophysite auto-immune expérimentale chez la souris SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Surmonter Absence de réaction dans encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) souches de souris résistantes par transfert adoptif et une stimulation antigénique

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myéline Oligodendrocyte glycoprotéine (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induit encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) dans C57BL / 6

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induction of Experimental encéphalomyélite allergique chez la souris et l&#39;évaluation de la distribution des maladies dépendant des cellules immunitaires dans divers tissus

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Une cytométrie en flux simple méthode pour mesurer l&#39;absorption du glucose et de glucose Expression Transporter pour monocytes dans les sous-populations de sang total

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Visualiser l’altération des barrières endothéliales et gliales de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Analyse cytométrique du flux de l’infiltration de lymphocytes dans le système nerveux central pendant l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...