Name: a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

Der Autor dankt den Tierhaltungseinheiten der Universität Lund, Camilla Björklöv und Agnieszka Czopek, für ihre Unterstützung und Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, UK, für konstruktive Kritik und linguistische Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.

Alle Tierverfahren wurden nach den Praktiken des schwedischen Tierversuchsamtes durchgeführt und von der Tierethikkommission, Lund-Malmö, Schweden genehmigt (Genehmigungsnummer: M126-16).
HINWEIS: Ein schematischer Ablauf der Methode ist in Abbildung 1 beschrieben.
1. Materialaufbereitung
HINWEIS: Bereiten Sie alle Reagenzien aseptisch in einer sterilen Haube vor, aliquot und lagern Sie sie b...

<ol>
	<li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide:+Insights+from+the+Atlas+of+MS,+third+edition.">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li><li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+and+T+cells+driving+multiple+sclerosis:+identity,+mechanisms+and+potential+triggers.">B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers.</a> Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).</li><li>Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One,+No+One,+and+One+Hundred+Thousand:+T+Regulatory+Cells'+Multiple+Identities+in+Neuroimmunity.">One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).</li><li>Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+multiple+sclerosis--potentials+and+limitations.">Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations.</a> Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).</li><li>Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+in+Mice.">Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).</li><li>Topping, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+antigen-emulsion+preparations+for+the+induction+of+autoimmune+disease+models.">Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models.</a> Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).</li><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+vortex+method+for+preparing+antigen/adjuvant+emulsions+for+immunization.">A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).</li><li>M&#228;&#228;tt&#228;, J. A., Er&#228;linna, J. P., R&#246;ytt&#228;, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+state+of+the+neuroantigen+in+adjuvant+emulsions+determines+encephalitogenic+status+in+the+BALB/c+mouse.">Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).</li><li>Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+the+preparation+of+antigen+emulsions+for+immunization.">Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).</li><li>Waksman, B. H., Adams, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+neuritis:+an+experimental+disease+of+rabbits+induced+by+the+injection+of+peripheral+nervous+tissue+and+adjuvants.">Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants.</a> The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).</li><li>Vladutiu, A. O., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+murine+thyroiditis+relation+to+histocompatibility+(H-2)+type.">Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type.</a> Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).</li><li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+the+rat+and+mouse.">Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Tuzun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+standard+preclinical+experiments+in+the+mouse+model+of+myasthenia+gravis+induced+by+acetylcholine+receptor+immunization.">Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization.</a> Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).</li><li>Brinckerhoff, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+inhibit+proteolytic+degradation+of+an+immunogenic+MART-1(27-35)+peptide:+implications+for+peptide+vaccines.">Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines.</a> International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).</li><li>Kool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells.">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).</li><li>Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+induction+of+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice+for+the+longitudinal+study+of+pathology+and+repair.">Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair.</a> Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).</li><li>Freund, J., Lipton, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+after+the+excision+of+the+injection+site+of+antigen-adjuvant+emulsion.">Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion.</a> The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).</li><li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li><li>Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+unresponsiveness+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+resistant+mouse+strains+by+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge.">Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).</li><li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+to+assess+the+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+vivax+CS+synthetic+vaccine.">Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine.</a> Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+association+factors+for+developing+effective+peptide-based+cancer+vaccines.">Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).</li><li>Neninger Vinageras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+randomized+controlled+trial+of+an+epidermal+growth+factor+vaccine+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).</li></ol>

Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie das Antigen/Freund-Adjuvans, werden seit mehr als einem halben Jahrhundert verwendet, um EAE17 zu induzieren. Derzeit gibt es keine standardisierte Methode zur Herstellung von Antigenemulsionen, die unabhängig vom menschlichen Einfluss ist. Das manuelle Mischen mit Spritzen ist in den meisten Laboratorien Standard, jedoch ist diese Methode zeitaufwendig, führt oft zu einem übermäßigen Materialverlust und die Qualität unterscheidet sich je nach Wissenschaftler, d...

Ein Zusammenbruch der immunologischen Toleranz kann zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose (MS) führen. Es wird geschätzt, dass weltweit 2,8 Millionen Menschen mit MS leben1. Obwohl die genaue Ursache der MS noch weitgehend unbekannt ist, spielen Dysregulation autoreaktiver T- und B-Zellen sowie Defekte in der Treg-Funktion eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der Erkrankung 2,3.
Tiermodelle von Autoimmunerkrankungen sind wesentliche Werkzeuge, um mögliche therapeutische Modalitäten zu untersuchen. Das experimentelle Modell der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) wird seit fast einem Jahrhundert von Forschern verwendet, die sich für MS4 interessieren. In frühen Experimenten war die Inzidenz der Krankheit relativ gering. Die Einführung eines vollständigen Freund-Adjuvans (CFA), das Mycobacterium und Pertussis-Toxin enthält, ermöglichte die konsistente Induktion von EAE bei Mäusen4. Am wichtigsten ist, dass CFA mit einem ZNS-spezifischen Antigen gemischt werden muss, um eine homogene Wasser-in-Öl-Emulsion zur Induktion von EAE zu erzeugen. Die derzeit gebräuchlichsten EAE-Modelle basieren auf der aktiven Immunisierung von Mäusen mit enzephalitogenen Peptiden. Der genetische Hintergrund der Mäuse spielt eine wichtige Rolle bei der Krankheitsanfälligkeit, wobei Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG35-55) und Myelin-Proteolipidprotein (PLP139-151) Peptide verwendet werden, um EAE in C57BL / 6J- bzw. SJL-Mäusen zu induzieren5. Es können jedoch auch andere Mausstämme und ZNS-abgeleitete Peptide verwendet werden.
Die Qualität der CFA/Peptid-Emulsion ist ein kritischer Faktor, der die Krankheitspenetranz im aktiven ImmunisierungsmodellEAE 6 bestimmt. Eine homogene Wasser-in-Öl-Emulsion muss hergestellt werden, indem die in wässrigem Puffer gelösten enzephalitogenen Peptide mit CFA gemischt werden, da sonst Tiere die Krankheit nicht entwickeln. Zur Herstellung von CFA/Peptid-Emulsionen wurden zahlreiche Protokolle veröffentlicht. Beispiele umfassen die Verwendung eines Wirbels7, Ultraschall8, Spritzen und eines Drei-Wege-T-Steckers9 oder einer Spritze nur5. Alle diese Methoden sind jedoch schwer zu standardisieren und oft mit langwierigen und komplizierten Protokollen verbunden.
Im Vergleich zu allen oben genannten Methoden bietet die hier beschriebene einfache Methode zur Emulsionsherstellung den Vorteil, dass sie keine Unterschiede von Mensch zu Mensch aufweist und relativ schnell ist. Die Emulsion wird durch einen Homogenisator erzeugt, der die Reagenzien mit einer eingestellten Geschwindigkeit, Zeit und Temperatur schüttelt, um schnelle und konsistente Ergebnisse zu gewährleisten. Neben der Induktion von Krankheiten im EAE-Modell kann diese Methode auch verwendet werden, um andere Autoimmunerkrankungsmodelle wie Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) und Antigen-induzierte Arthritis (AIA) zu untersuchen6. Daher wird erwartet, dass diese Methode verwendet werden kann, um Krankheiten in anderen Tiermodellen konsistent zu induzieren, die auf Wasser-in-Öl-Emulsionen mit Autoantigenen angewiesen sind, wie experimentelle Autoimmunneuritis (EAN)10, experimentelle Autoimmunthyreoiditis (EAT)11, autoimmune Uveitis (EAU)12 und Myasthenia gravis (MG)13. Diese Methode induziert auch allgemeine Immunantworten wie verzögerte Typ-Überempfindlichkeit (DTH) konsistent6 und könnte daher für die Verabreichung von Krebs- und Malariaimpfstoffen verwendet werden (siehe Diskussion).
So wurde eine schnelle (Gesamtherstellungszeit ~30 min), einfache (alle Reagenzien können im Voraus hergestellt und gelagert werden) und standardisierte (die Emulsion wird mit einem Schüttelhomogenisator erreicht) Methode entwickelt und hier vorgestellt. Die nach diesem Protokoll hergestellten CFA/Antigen-Emulsionen induzieren in Autoimmuntiermodellen durchweg Krankheiten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>9166017V&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 ml empty tubes with caps</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000944LYSK0A.0</td>
			<td>7 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bordetella pertussis toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2980</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersant, light mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsion kit</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>D34200.10 ea</td>
			<td>Containing a tube, cap, and plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#39;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F5506</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis, H37RA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF3114-33-8</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastersizer 2000&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Particle size analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys-Personal homogenizer</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Shaking homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG 35-55 Peptide&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Innovagen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montanide ISA 51 VG</td>
			<td>Seppic</td>
			<td>36362Z</td>
			<td>FDA-approved oil adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17124381</td>
			<td>Sterlie filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-Constrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0445832</td>
			<td>Autoclave and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648463</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) weist ähnliche immunologische und klinische Merkmale wie Multiple Sklerose (MS) auf und wird daher häufig als Modell verwendet, um neue Wirkstoffziele für eine bessere Patientenbehandlung zu identifizieren. MS ist durch verschiedene Krankheitsverläufe gekennzeichnet: schubförmig-remittierende MS (RRMS), primär progrediente MS (PPMS), sekundär progrediente MS (SPMS) und eine seltene progressiv-schubförmige Form der MS (PRMS). Obwohl Tiermodelle nicht alle diese kontrastierenden Phänotypen menschlicher Krankheiten genau nachahmen, gibt es EAE-Modelle, die einige der verschiedenen klinischen Manifestationen von MS widerspiegeln. Zum Beispiel ahmt Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)-induzierte EAE in C57BL / 6J-Mäusen menschliches PPMS nach, während Myelin-Proteolipidprotein (PLP)-induzierte EAE in SJL / J-Mäusen RRMS ähnelt. Andere Autoantigene, wie Myelin Basic Protein (MBP), und eine Reihe verschiedener Mausstämme werden ebenfalls verwendet, um EAE zu untersuchen. Um eine Erkrankung in diesen Autoantigen-Immunisierungs-EAE-Modellen zu induzieren, wird eine Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt und subkutan injiziert. Die meisten EAE-Modelle erfordern auch eine Injektion von Pertussis-Toxin, damit sich die Krankheit entwickeln kann. Für eine konsistente und reproduzierbare EAE-Induktion ist ein detailliertes Protokoll zur Herstellung der Reagenzien zur Herstellung von Antigen-/Adjuvansemulsionen erforderlich. Das hier beschriebene Verfahren nutzt ein standardisiertes Verfahren zur Erzeugung von Wasser-in-Öl-Emulsionen. Es ist einfach und schnell und verwendet einen Schüttelhomogenisator anstelle von Spritzen, um qualitätskontrollierte Emulsionen herzustellen.

Das schnelle, einfache und standardisierte Protokoll für die Herstellung von CFA/MOG-Emulsionen ist in Abbildung 1 dargestellt. Diese Methode wurde kürzlich an anderer Stelle beschrieben6. Die CFA/MOG-Emulsionen können auch mit anderen Methoden hergestellt werden, wie z.B. dem traditionellen Spritzenverfahren oder durch Vortexen. Diese Methoden wurden hier verglichen, indem die Qualität der Emulsionen bewertet wurde. Alle Methoden erzeugten Wasser-in-Öl-Emulsione...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, ein Tiermodell für Multiple Sklerose, zu induzieren, werden Mäuse mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion immunisiert, die ein Autoantigen und ein komplettes Freund-Adjuvans enthält. Während für die Herstellung dieser Emulsionen mehrere Protokolle existieren, wird hier ein schnelles, einfaches und standardisiertes Homogenisierungsprotokoll für die Emulsionsherstellung vorgestellt.

Eine schnelle, einfache und standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen zur Induktion experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis oder EAE ist ein Tiermodell, das zur Entwicklung neuer und verbesserter Behandlungen für Patienten mit multipler Sklerose verwendet wird. Die Induktion von Krankheiten bei EAE erfordert eine perfekte Öl- und Wasseremulsion, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Die hier vorgestellte Methode der Emulsionsherstellung ist frei von menschlichen Einflüssen, wodurch Inkonsistenzen von einem Versuch zum anderen begrenzt werden.Obwohl die Methode für EAE optimiert wurde, kann sie auch für andere Autoimmunerkrankungsmodelle und auch zum Testen von Krebsimpfstoffen verwendet werden. Zur Herstellung der CFA-Aufschlämmung werden 100 Milligramm gefriergetrocknete M-Tuberkulose H37 RA und fünf 3,2 Millimeter Stahlperlen zu einem Sieben-Milliliter-Rohr hergestellt. Schütteln Sie das Röhrchen im Homogenisator 60 Sekunden lang bei höchster Geschwindigkeitseinstellung.Fünf Milliliter IFA-Adjuvans in die Tube geben und erneut 60 Sekunden bei höchster Geschwindigkeit schütteln. Dann die Aufschlämmung mit einer Pipette in ein frisches Röhrchen geben, die Perlen zurücklassen und bei vier Grad Celsius bis zum Gebrauch lagern. Um eine CFA/Peptid-Emulsion herzustellen, laden Sie die erste Zusatzdatei herunter, um die für jedes Reagenz benötigte Menge zu berechnen.Legen Sie dann das verschraubte Rohr und die zu verwendenden Reagenzien auf Eis. Als nächstes fügen Sie die Emulsionskomponenten hinzu. Zuerst PBS, dann das Peptid, die CFA-Aufschlämmung.Und schließlich die IFA. Verschließen Sie den Schlauch mit der Kappe fest, indem Sie ihn mehrmals festziehen und lösen. Schütteln Sie das Röhrchen 5 bis 10 Sekunden lang kräftig von Hand, um die Reagenzien vorzumischen.Legen Sie das Röhrchen in den Schüttelhomogenisator und sichern Sie es mit dem Stab. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf die höchste Einstellung und die Zeit auf 60 Sekunden ein. Sobald der Lauf beendet ist, legen Sie die Röhre für drei Minuten auf Eis und wiederholen Sie den Lauf noch ein oder zwei Mal mit den gleichen Einstellungen.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 G aus einer Minute, um eingeschlossene Luft zu entfernen und die Emulsion zu verdichten. Entfernen Sie die Kappe aus dem Röhrchen. Führen Sie den Kolben in das Röhrchen ein und drücken Sie ihn langsam nach unten, bis er die Oberseite der Emulsion erreicht.Entfernen Sie das Schnappgehäuse an der Unterseite des Röhrchens, indem Sie es drehen. Als nächstes entfernen Sie den Kolben von allen Injektionsspritzen und fügen Sie den Injektionsspritzen eine Nadel hinzu. Befestigen Sie dann die Rückseite der Injektionsspritze an dem dafür vorgesehenen Schloss am Boden des Röhrchens und verriegeln Sie es mit einer kurzen Drehung.Übertragen Sie die Emulsion aus dem Röhrchen in die Injektionsspritze, indem Sie den Kolben vorsichtig drücken. Stoppen Sie, wenn die Emulsion die 0,15-Milliliter-Graduierung der Injektionsspritze erreicht hat. Trennen Sie die Injektionsspritze vom Schlauch und führen Sie den Kolben vorsichtig ein, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luft in diese Spritze gelangt.Drücken Sie den Kolben, bis die Emulsion aus der Nadel kommt, und wiederholen Sie den Vorgang für den Rest der im Röhrchen vorhandenen Emulsion. Um die Größe der Wasser- und Ölpartikel zu analysieren, fügen Sie einen winzigen Tropfen der Emulsion zu einem Objektträger hinzu, schmieren Sie ihn mit einem Abdeckschlicker aus und drücken Sie dann hart in einer kreisförmigen Bewegung, um die Emulsion abzuflachen. Untersuchen Sie die verschmierte Emulsion unter einem Phasenkontrastmikroskop mit 400-facher Vergrößerung und fokussieren Sie auf ein Feld mit einer Monoschicht der Emulsion.Stellen Sie sicher, dass kleine, gleichmäßige, graue oder weiße Partikel sichtbar sind. Emulsionen, die durch die Homogenisierungsmethode hergestellt wurden, zeigten graue oder weiße bohnenförmige Partikel, die winzige Tröpfchen von Wasser- und Ölemulsionen darstellten. Im Gegensatz dazu waren die mit der Spritzenmethode hergestellten Emulsionströpfchen größer und breiter.Bei der Wirbelmethode wurden große graue oder schwarze Partikel beobachtet, die Luftblasen entsprechen, die in der Emulsion eingeschlossen sind. Änderungen in der Partikelgrößenverteilung im Laufe der Zeit, die mit einem Laserdefraktions-Partikelgrößenanalysator für Wasser- und Ölemulsionen gemessen wurden, zeigten keine Änderung der Partikelgröße über einen Zeitraum von sechs Wochen. Die frischen 3 Wochen alten und 15 Wochen alten Emulsionen induzierten alle ähnliche EAE-Erkrankungen bei allen Tieren, die während des gesamten Experiments getestet wurden.Mäuse entwickelten in allen Experimenten ein ähnliches Krankheitsbild und zeigten, dass die hier vorgestellte Homogenisierungsmethode Emulsionen erzeugte, die EAE konsistent und reproduzierbar induzierten. Bevor Sie die Emulsion für ein Experiment herstellen, laden Sie die Zusatzdatei Nummer eins herunter, um die Menge jeder Komponente zu berechnen, die zur Minimierung des Abfalls benötigt wird. Mit der hier vorgestellten Methode könnte die Emulsionspräparation nicht nur für die präklinische Forschung, sondern zukünftig auch für die Herstellung von Krebsimpfstoffen in der Klinik standardisiert werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Vorbereitung der Maus Pituitary Immunogen für die Induktion der experimentellen autoimmunen Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Induktion der experimentellen autoimmunen Hypophysitis in SJL Mäuse

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Die Überwindung der nicht mehr reagiert, in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) Beständig Mausstämmen durch adoptiven Transfer-und Antigen-Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 Mäuse

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...