Name: a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

המחבר מבקש להודות ליחידות הדיור לבעלי חיים באוניברסיטת לונד, קמילה ביורקלוב ואגניישקה צ'ופק, על תמיכתן, ולריצ'רד ויליאמס, מכון קנדי לראומטולוגיה, אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה, על ביקורת בונה ותמיכה לשונית בהפקת כתב יד זה.

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי נוהלי המועצה השוודית למחקר בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים, לונד-מאלמו, שבדיה (מספר היתר: M126-16).
הערה: זרימה סכמטית של השיטה מתוארת באיור 1.
1. הכנת חומרים
הערה: מכינים את ?...

<ol>
	<li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide:+Insights+from+the+Atlas+of+MS,+third+edition.">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li><li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+and+T+cells+driving+multiple+sclerosis:+identity,+mechanisms+and+potential+triggers.">B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers.</a> Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).</li><li>Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One,+No+One,+and+One+Hundred+Thousand:+T+Regulatory+Cells'+Multiple+Identities+in+Neuroimmunity.">One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).</li><li>Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+multiple+sclerosis--potentials+and+limitations.">Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations.</a> Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).</li><li>Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+in+Mice.">Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).</li><li>Topping, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+antigen-emulsion+preparations+for+the+induction+of+autoimmune+disease+models.">Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models.</a> Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).</li><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+vortex+method+for+preparing+antigen/adjuvant+emulsions+for+immunization.">A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).</li><li>M&#228;&#228;tt&#228;, J. A., Er&#228;linna, J. P., R&#246;ytt&#228;, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+state+of+the+neuroantigen+in+adjuvant+emulsions+determines+encephalitogenic+status+in+the+BALB/c+mouse.">Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).</li><li>Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+the+preparation+of+antigen+emulsions+for+immunization.">Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).</li><li>Waksman, B. H., Adams, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+neuritis:+an+experimental+disease+of+rabbits+induced+by+the+injection+of+peripheral+nervous+tissue+and+adjuvants.">Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants.</a> The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).</li><li>Vladutiu, A. O., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+murine+thyroiditis+relation+to+histocompatibility+(H-2)+type.">Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type.</a> Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).</li><li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+the+rat+and+mouse.">Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Tuzun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+standard+preclinical+experiments+in+the+mouse+model+of+myasthenia+gravis+induced+by+acetylcholine+receptor+immunization.">Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization.</a> Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).</li><li>Brinckerhoff, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+inhibit+proteolytic+degradation+of+an+immunogenic+MART-1(27-35)+peptide:+implications+for+peptide+vaccines.">Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines.</a> International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).</li><li>Kool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells.">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).</li><li>Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+induction+of+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice+for+the+longitudinal+study+of+pathology+and+repair.">Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair.</a> Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).</li><li>Freund, J., Lipton, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+after+the+excision+of+the+injection+site+of+antigen-adjuvant+emulsion.">Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion.</a> The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).</li><li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li><li>Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+unresponsiveness+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+resistant+mouse+strains+by+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge.">Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).</li><li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+to+assess+the+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+vivax+CS+synthetic+vaccine.">Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine.</a> Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+association+factors+for+developing+effective+peptide-based+cancer+vaccines.">Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).</li><li>Neninger Vinageras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+randomized+controlled+trial+of+an+epidermal+growth+factor+vaccine+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).</li></ol>

תחליבי מים בשמן, כגון אדג'ובנט של אנטיגן/פרוינד, שימשו במשך יותר מחצי מאה להשראת EAE17. אין כיום שיטה סטנדרטית להכנת תחליבי אנטיגן שאינם תלויים בהשפעת האדם. ערבוב ידני באמצעות מזרקים הוא סטנדרטי עבור רוב המעבדות, אולם שיטה זו היא זמן רב, לעתים קרובות גורם לאובדן מוגזם של חומר, ואת ...

התמוטטות של סובלנות חיסונית יכולה לגרום ליצירת הפרעות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה (MS). ההערכה היא כי 2.8 מיליון אנשים חיים עם טרשת נפוצה ברחבי העולם1. למרות שהסיבה המדויקת לטרשת נפוצה עדיין אינה ידועה במידה רבה, חוסר ויסות של תאי T ו- B תגובתיים אוטומטיים, כמו גם פגמים בתפקוד Treg, ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה של המחלה 2,3.
מודלים חייתיים של מחלות אוטואימוניות הם כלים חיוניים לחקר שיטות טיפוליות פוטנציאליות. המודל הניסיוני של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית (EAE) נמצא בשימוש כבר כמעט מאה שנה על ידי חוקרים המתעניינים בטרשת נפוצה4. בניסויים מוקדמים, שכיחות המחלה הייתה נמוכה יחסית. הכנסת האדג'ובנט השלם של פרוינד (CFA), המכיל מיקובקטריום ורעלן שעלת, אפשרה השראה עקבית של EAE בעכברים4. והכי חשוב, יש צורך לערבב CFA עם אנטיגן ספציפי למערכת העצבים המרכזית (CNS) כדי ליצור תחליב מים הומוגני בשמן לגרימת EAE. המודלים הנפוצים ביותר של EAE הזמינים כיום מבוססים על חיסון פעיל של עכברים עם פפטידים אנצפליטוגניים. הרקע הגנטי של העכברים ממלא תפקיד חשוב ברגישות למחלות, כאשר גליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG35-55) וחלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP139-151) משמשים להשראת EAE בעכברי C57BL/6J ו-SJL, בהתאמה5. עם זאת, ניתן להשתמש גם בזני עכברים אחרים ובפפטידים שמקורם במערכת העצבים המרכזית.
האיכות של תחליב CFA/פפטיד היא גורם קריטי שקובע את חדירות המחלה בחיסון הפעיל EAE מודל6. יש להכין תחליב מים הומוגני בשמן על ידי ערבוב הפפטידים האנצפליטוגניים המומסים בחיץ מימי עם CFA, אחרת בעלי חיים לא יפתחו את המחלה. פרוטוקולים רבים פורסמו על הכנת תחליבי CFA/פפטידים. דוגמאות כוללות שימוש במערבולת7, סוניקציה8, מזרקים ומחבר T תלת-כיווני9, או מזרק אחד בלבד5. עם זאת, כל השיטות הללו קשות לסטנדרטיזציה ולעתים קרובות קשורות לפרוטוקולים ארוכים ומסובכים.
בהשוואה לכל השיטות הנ"ל, השיטה הפשוטה המתוארת כאן להכנת תחליב מציעה את היתרונות של היעדר הבדלים בין אדם לאדם והיותה מהירה יחסית. האמולסיה נוצרת על ידי הומוגנייזר שמטלטל את הריאגנטים במהירות, זמן וטמפרטורה מוגדרים, מה שמבטיח תוצאות מהירות ועקביות. בנוסף לגרימת מחלות במודל EAE, שיטה זו יכולה לשמש גם לחקר מודלים אחרים של מחלות אוטואימוניות כגון דלקת מפרקים הנגרמת על ידי קולגן (CIA) ודלקת מפרקים הנגרמת על ידי אנטיגן (AIA)6. לכן, צפוי כי שיטה זו יכולה לשמש כדי לגרום באופן עקבי למחלות במודלים אחרים של בעלי חיים התלויים בתחליבי מים בשמן עם אנטיגנים עצמיים, כגון דלקת עצבים אוטואימונית ניסיונית (EAN)10, דלקת אוטואימונית ניסיונית של בלוטת התריס (EAT)11, אובאיטיס אוטואימונית (EAU)12, ומיאסטניה גרביס (MG)13. שיטה זו גם גורמת לתגובות חיסוניות כלליות כגון רגישות יתר מסוג מושהה (DTH) באופן עקבי6, ולכן יכולה לשמש להעברת חיסונים נגד סרטן ומלריה (ראו דיון).
לפיכך, פותחה שיטה מהירה (זמן הכנה כולל ~ 30 דקות), פשוטה (ניתן להכין את כל הריאגנטים מראש ולאחסן אותה), וסטנדרטית (התחליב מתבצע באמצעות הומוגנייזר מטלטל) ומוצגת כאן. תחליבי CFA/אנטיגן שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה גורמים באופן עקבי למחלות במודלים אוטואימוניים של בעלי חיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>9166017V&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 ml empty tubes with caps</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000944LYSK0A.0</td>
			<td>7 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bordetella pertussis toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2980</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersant, light mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsion kit</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>D34200.10 ea</td>
			<td>Containing a tube, cap, and plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#39;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F5506</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis, H37RA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF3114-33-8</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastersizer 2000&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Particle size analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys-Personal homogenizer</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Shaking homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG 35-55 Peptide&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Innovagen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montanide ISA 51 VG</td>
			<td>Seppic</td>
			<td>36362Z</td>
			<td>FDA-approved oil adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17124381</td>
			<td>Sterlie filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-Constrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0445832</td>
			<td>Autoclave and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648463</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) חולקת מאפיינים אימונולוגיים וקליניים דומים עם טרשת נפוצה (MS), ולכן נעשה בה שימוש נרחב כמודל לזיהוי מטרות תרופות חדשות לטיפול טוב יותר בחולים. טרשת נפוצה מאופיינת במספר מסלולי מחלה שונים: טרשת נפוצה חוזרת (RRMS), טרשת נפוצה פרוגרסיבית ראשונית (PPMS), טרשת נפוצה פרוגרסיבית משנית (SPMS), וצורה נדירה של טרשת נפוצה מתקדמת (PRMS). למרות שמודלים של בעלי חיים אינם מחקים במדויק את כל הפנוטיפים המנוגדים הללו של מחלות אנושיות, ישנם מודלים של EAE המשקפים חלק מהביטויים הקליניים השונים של טרשת נפוצה. לדוגמה, EAE המושרה על-ידי מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (MOG) בעכברי C57BL/6J מחקה PPMS אנושי, בעוד ש-EAE המושרה על-ידי חלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP) בעכברי SJL/J דומה ל-RRMS. נוגדי חמצון עצמיים אחרים, כגון חלבון בסיסי מיאלין (MBP), ומספר זנים שונים של עכברים משמשים גם הם לחקר EAE. כדי לגרום למחלה במודלים אלה של חיסון נגד אנטיגנים עצמיים, מכינים ומזריקים תחליב מים בשמן באופן תת-עורי. רוב המודלים של EAE דורשים גם הזרקה של רעלן שעלת כדי שהמחלה תתפתח. להשראת EAE עקבית וניתנת לשחזור, יש צורך בפרוטוקול מפורט להכנת הריאגנטים לייצור תחליבי אנטיגן/אדג'ובנטיים. השיטה המתוארת כאן מנצלת שיטה סטנדרטית ליצירת תחליבי מים בשמן. הוא פשוט ומהיר ומשתמש בהומוגנייזר מטלטל במקום במזרקים להכנת תחליבים מבוקרי איכות.

הפרוטוקול המהיר, הפשוט והסטנדרטי להכנת אמולסיות CFA/MOG מתואר באיור 1. שיטה זו תוארה לאחרונה במקום אחר6. ניתן להכין תחליבי CFA/MOG גם בשיטות אחרות, כגון שיטת המזרק המסורתית או על ידי מערבולת. שיטות אלה הושוו כאן על ידי הערכת איכות התחליבים. כל השיטות הפיקו תחליבי מים ב?...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, מודל חייתי של טרשת נפוצה, עכברים מחוסנים בתחליב מים בשמן המכיל אוטואנטיגן ואדג'ובנט שלם של פרוינד. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים להכנת אמולסיות אלה, מוצג כאן פרוטוקול הומוגניזציה מהיר, פשוט וסטנדרטי להכנת אמולסיה.

שיטת הומוגניזציה מהירה, פשוטה וסטנדרטית להכנת אמולסיות אנטיגן/אדג'ובנטיות לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית או EAE היא מודל חייתי המשמש לפיתוח טיפולים חדשים ומשופרים לחולי טרשת נפוצה. גרימת מחלות ב-EAE דורשת תחליב שמן ומים מושלם כדי להשיג תוצאות עקביות. שיטת הכנת האמולסיה המוצגת כאן נקייה מהשפעה אנושית, ובכך מגבילה את חוסר העקביות מניסוי אחד למשנהו.למרות שהשיטה הותאמה ל-EAE, ניתן להשתמש בה גם למודלים אחרים של מחלות אוטואימוניות וגם לבדיקת חיסונים לסרטן. כדי להכין את slurry CFA ב 100 מיליגרם של שחפת M מיובש בהקפאה H37 RA וחמישה, 3.2 מילימטרים חרוזי פלדה לצינור שבעה מיליליטר. לנער את הצינור בהומוגנייזר במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר.הוסף חמישה מיליליטר של אדג'ובנט IFA לצינור ונער שוב במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר. לאחר מכן מעבירים את החרוזים לצינור טרי עם פיפטה שמשאירה את החרוזים מאחור ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. כדי להכין תחליב CFA/פפטיד, הורד קובץ משלים אחד כדי לחשב את הכמות הדרושה עבור כל מגיב.לאחר מכן הניחו את הצינור המכוסה בבורג ואת הריאגנטים לשימוש על קרח. לאחר מכן, הוסף את רכיבי האמולסיה. תחילה PBS, אחר כך הפפטיד, ה- CFA slurry.ולבסוף, IFA. סגור את הצינור עם המכסה בחוזקה על ידי הידוק ושחרור אותו מספר פעמים. יש לנער את השפופרת במרץ במשך 5 עד 10 שניות ביד כדי לערבב מראש את הריאגנטים.מניחים את הצינור בהומוגנייזר הרועד ומהדקים אותו באמצעות המוט. הגדר את המהירות להגדרה הגבוהה ביותר ואת הזמן ל- 60 שניות. לאחר סיום הריצה, הניחו את הצינור על הקרח במשך שלוש דקות וחזרו על הריצה פעם או פעמיים נוספות עם אותן הגדרות.צנטריפוגה את הצינור ב 300 G מדקה אחת כדי להסיר אוויר לכוד לדחוס את האמולסיה. הסר את המכסה מהצינור. הכנס את הבוכנה לתוך הצינור, ודחף אותה למטה לאט עד שהיא מגיעה לחלק העליון של התחליב.הסר את מארז ההצמדה בתחתית הצינור על ידי סיבובו. לאחר מכן, הסר את הבוכנה מכל מזרקי ההזרקה והוסף מחט למזרקי ההזרקה. לאחר מכן חברו את גב מזרק ההזרקה למנעול הייעודי בתחתית הצינור ונעלו אותו עם טוויסט קצר.העבר את האמולסיה מהצינור למזרק ההזרקה על ידי דחיפת הבוכנה בעדינות. עצור כאשר תחליב מגיע 0.15 מיליליטר סיום של מזרק ההזרקה. הפרידו את מזרק ההזרקה מהצינור והכניסו את הבוכנה בזהירות תוך הקפדה על כך ששום אוויר לא ייכנס למזרק זה.דוחפים את הבוכנה עד שהתחליב יוצא מהמחט וחוזרים על התהליך למשך שארית התחליב הקיים בצינור. כדי לנתח את גודל חלקיקי המים והשמן הוסיפו טיפה זעירה של האמולסיה למגלשה במיקרוסקופ, מרחו אותה באמצעות כיסוי ולאחר מכן דחפו חזק בתנועה מעגלית כדי לשטח את התחליב. בחנו את האמולסיה המרוחה תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם הגדלה של פי 400 והתמקדו בשדה עם חד-שכבתי של התחליב.ודא שחלקיקים קטנים, אחידים, אפורים או לבנים נראים לעין. תחליבים שנוצרו בשיטת ההומוגניזציה הציגו חלקיקים אפורים או לבנים בצורת שעועית המייצגים טיפות זעירות של מים ותחליבי שמן. לעומת זאת, טיפות האמולסיה שיוצרו בשיטת המזרק היו גדולות ורחבות יותר.בשיטת המערבולת נצפו חלקיקים אפורים או שחורים גדולים המתאימים לבועות אוויר שנלכדו בתחליב. שינויים בפיזור גודל החלקיקים לאורך זמן שנמדדו באמצעות מנתח גודל חלקיקי שבירה בלייזר עבור תחליבי מים ושמן לא הראו כל שינוי בגודל החלקיקים במשך תקופה של שישה שבועות. התחליבים הטריים בני 3 שבועות ו-15 שבועות גרמו כולם למחלות EAE דומות בכל בעלי החיים שנוסו במהלך הניסוי.עכברים פיתחו דפוס מחלה דומה בכל הניסויים שגילו כי שיטת ההומוגניזציה המוצגת כאן ייצרה אמולסיות שגרמו ל-EAE באופן עקבי וניתן לשחזור. לפני הכנת האמולסיה לניסוי, הורד קובץ משלים מספר אחת כדי לחשב את הכמות של כל רכיב הדרושה כדי למזער את הפסולת. השיטה המוצגת כאן יכולה לשמש לסטנדרטיזציה של הכנת תחליב לא רק למחקר פרה-קליני, אלא גם בעתיד להכנת חיסונים לסרטן במרפאה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

הכנת Immunogen עכבר יותרת המוח עבור אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימונית ניסויית

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימוניות הניסויי עכברים SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

התגברות על חוסר התגובה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) זנים עמידים עכבר ידי העברת המאמצת אתגר אנטיגני

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

המיאלין oligodendrocyte גליקופרוטאין (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) מושרה ניסויי אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) בעכברים C57BL / 6

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

אינדוקציה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis עכברים וההערכה של הפצת מחלות התלויה של תאים חיסוניים ברקמות שונות

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Cytometric זרימה פשוט שיטה למדוד ספיגת הגלוקוז ואת ביטוי נשא גלוקוז עבור מונוציטים subpopulations ב דם מלא

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

ייצור טיהור פשוט ויעיל של עכבר המיאלין Oligodendrocyte גליקופרוטאין עבור ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis מחקרים

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

להמחיש ירידת ערך של המחסומים אנדותל, גליה של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

זרימה ניתוח ציטומטרי של חדירה לימפוציטים במערכת העצבים המרכזית במהלך אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...