Name: a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

L'autore desidera ringraziare le unità abitative degli animali dell'Università di Lund, Camilla Björklöv e Agnieszka Czopek, per il loro sostegno, e Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, Università di Oxford, Regno Unito, per le critiche costruttive e il supporto linguistico che produce questo manoscritto.

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo le pratiche del Consiglio svedese per la ricerca sugli animali e sono state approvate dal Comitato etico degli animali, Lund-Malmö, Svezia (numero di permesso: M126-16).
NOTA: un flusso schematico del metodo è descritto nella Figura 1.
1. Preparazione del materiale
NOTA: Preparare tutti i reagenti in modo asettico in una cappa steri...

<ol>
	<li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide:+Insights+from+the+Atlas+of+MS,+third+edition.">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li><li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. 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M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li><li>Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+unresponsiveness+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+resistant+mouse+strains+by+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge.">Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge.</a> Journal of Visualized Experiments. 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Le emulsioni acqua-in-olio, come l'antigene/adiuvante di Freund, sono state utilizzate per più di mezzo secolo per indurre EAE17. Attualmente non esiste un metodo standardizzato per preparare emulsioni di antigene che sia indipendente dall'influenza umana. La miscelazione manuale con siringhe è standard per la maggior parte dei laboratori, tuttavia questo metodo richiede tempo, spesso comporta un'eccessiva perdita di materiale e la qualità varia a seconda dello scienziato che lo prepara.
<p...

Una rottura della tolleranza immunologica può provocare la generazione di malattie autoimmuni, come la sclerosi multipla (SM). Si stima che 2,8 milioni di persone convivono con SM in tutto il mondo1. Sebbene la causa esatta della SM sia ancora in gran parte sconosciuta, la disregolazione delle cellule T e B autoreattive, così come i difetti nella funzione Treg, svolgono un ruolo importante nella patogenesi della malattia 2,3.
I modelli animali di malattie autoimmuni sono strumenti essenziali per studiare potenziali modalità terapeutiche. Il modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE) è stato utilizzato per quasi un secolo dai ricercatori interessati alla SM4. Nei primi esperimenti, l'incidenza della malattia era relativamente bassa. L'introduzione dell'adiuvante completo di Freund (CFA), contenente Mycobacterium e tossina della pertosse, ha permesso l'induzione coerente di EAE nei topi4. Ancora più importante, è necessario mescolare CFA con un antigene specifico del sistema nervoso centrale (SNC) per generare un'emulsione acqua-in-olio omogenea per indurre EAE. I modelli EAE attualmente disponibili più comuni si basano sull'immunizzazione attiva di topi con peptidi encefalitogeni. Il background genetico dei topi gioca un ruolo importante nella suscettibilità alla malattia, con la glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG35-55) e la proteina proteolipidica mielinica (PLP139-151) peptidi utilizzati per indurre EAE nei topi C57BL / 6J e SJL, rispettivamente5. Tuttavia, possono essere utilizzati anche altri ceppi di topo e peptidi derivati dal SNC.
La qualità dell'emulsione CFA/peptide è un fattore critico che determina la penetranza della malattia nell'immunizzazione attiva EAE modello6. Un'emulsione omogenea acqua-in-olio deve essere preparata mescolando i peptidi encefalitogeni disciolti in tampone acquoso con CFA, altrimenti gli animali non svilupperanno la malattia. Sono stati pubblicati numerosi protocolli sulla preparazione di emulsioni CFA/peptidiche. Gli esempi includono l'uso di un vortice7, sonicazione8, siringhe e un connettore T a tre vie9, o una siringa solo5. Tuttavia, tutti questi metodi sono difficili da standardizzare e sono spesso associati a protocolli lunghi e complicati.
Rispetto a tutti i metodi di cui sopra, il semplice metodo qui descritto per la preparazione dell'emulsione offre il vantaggio di non avere differenze da persona a persona e di essere relativamente veloce. L'emulsione viene generata da un omogeneizzatore che agita i reagenti con una velocità, un tempo e una temperatura impostati, garantendo risultati rapidi e coerenti. Oltre a indurre la malattia nel modello EAE, questo metodo può anche essere utilizzato per studiare altri modelli di malattia autoimmune come l'artrite indotta dal collagene (CIA) e l'artrite indotta dall'antigene (AIA)6. Pertanto, si prevede che questo metodo possa essere utilizzato per indurre costantemente la malattia in altri modelli animali che dipendono da emulsioni acqua-in-olio con autoantigeni, come la neurite autoimmune sperimentale (EAN)10, la tiroidite autoimmune sperimentale (EAT)11, l'uveite autoimmune (EAU)12 e la miastenia grave (MG)13. Questo metodo induce anche risposte immunitarie generali come l'ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) in modo coerente6, e potrebbe quindi essere utilizzato per la somministrazione di vaccini contro il cancro e la malaria (vedi discussione).
Pertanto, è stato sviluppato un metodo rapido (tempo di preparazione totale ~ 30 min), semplice (tutti i reagenti possono essere preparati in anticipo e conservati) e standardizzato (l'emulsione viene eseguita utilizzando un omogeneizzatore di agitazione) ed è presentato qui. Le emulsioni CFA/antigene preparate utilizzando questo protocollo inducono costantemente la malattia nei modelli animali autoimmuni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>9166017V&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 ml empty tubes with caps</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000944LYSK0A.0</td>
			<td>7 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bordetella pertussis toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2980</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersant, light mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsion kit</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>D34200.10 ea</td>
			<td>Containing a tube, cap, and plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#39;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F5506</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis, H37RA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF3114-33-8</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastersizer 2000&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Particle size analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys-Personal homogenizer</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Shaking homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG 35-55 Peptide&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Innovagen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montanide ISA 51 VG</td>
			<td>Seppic</td>
			<td>36362Z</td>
			<td>FDA-approved oil adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17124381</td>
			<td>Sterlie filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-Constrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0445832</td>
			<td>Autoclave and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648463</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) condivide caratteristiche immunologiche e cliniche simili alla sclerosi multipla (SM) ed è quindi ampiamente utilizzata come modello per identificare nuovi bersagli farmacologici per un migliore trattamento del paziente. La SM è caratterizzata da diversi decorsi di malattia: SM recidivante-remittente (SMRR), SM primaria progressiva (SMPP), SM secondaria progressiva (SPMS) e una rara forma progressiva-recidivante di SM (PRMS). Sebbene i modelli animali non imitino accuratamente tutti questi fenotipi contrastanti di malattia umana, ci sono modelli EAE che riflettono alcune delle diverse manifestazioni cliniche della SM. Ad esempio, l'EAE indotto dalla glicoproteina oligodendrocitaria mielina (MOG) nei topi C57BL / 6J imita la SMPP umana, mentre l'EAE indotto dalla proteina proteolipidica della mielina (PLP) nei topi SJL / J assomiglia alla SMRR. Altri autoantigeni, come la proteina basica della mielina (MBP), e un certo numero di diversi ceppi di topo sono anche usati per studiare EAE. Per indurre la malattia in questi modelli EAE di immunizzazione autoantigene, viene preparata e iniettata per via sottocutanea un'emulsione acqua-in-olio. La maggior parte dei modelli EAE richiede anche un'iniezione di tossina della pertosse per lo sviluppo della malattia. Per un'induzione EAE coerente e riproducibile, è necessario un protocollo dettagliato per preparare i reagenti a produrre emulsioni antigene/adiuvante. Il metodo qui descritto si avvale di un metodo standardizzato per generare emulsioni acqua-in-olio. È semplice e veloce e utilizza un omogeneizzatore agitatore al posto delle siringhe per preparare emulsioni di qualità controllata.

Il protocollo rapido, semplice e standardizzato per la preparazione delle emulsioni CFA/MOG è illustrato nella Figura 1. Questo metodo è stato recentemente descritto altrove6. Le emulsioni CFA/MOG possono essere preparate anche con altri metodi, come il tradizionale metodo a siringa o mediante vortice. Questi metodi sono stati confrontati qui valutando la qualità delle emulsioni. Tutti i metodi producevano emulsioni acqua-in-olio; L'omogeneità e la qualità di que...

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A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale, un modello animale di sclerosi multipla, i topi vengono immunizzati con un'emulsione acqua-in-olio contenente un autoantigene e un adiuvante completo di Freund. Mentre esistono diversi protocolli per la preparazione di queste emulsioni, qui viene presentato un protocollo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per la preparazione dell'emulsione.

Un metodo di omogeneizzazione rapido, semplice e standardizzato per preparare emulsioni antigene/adiuvanti per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

L'encefalomielite autoimmune sperimentale o EAE è un modello animale utilizzato per sviluppare trattamenti nuovi e migliorati per i pazienti con sclerosi multipla. L'induzione della malattia nell'EAE richiede un'emulsione perfetta di olio e acqua per ottenere risultati coerenti. Il metodo di preparazione dell'emulsione qui presentato è libero dall'influenza umana, limitando così le incongruenze da un esperimento all'altro.Anche se il metodo è stato ottimizzato per EAE, può essere utilizzato anche per altri modelli di malattie autoimmuni e anche per testare vaccini contro il cancro. Per preparare il liquame CFA a 100 milligrammi di tubercolosi M H37 RA liofilizzata e cinque perle di acciaio da 3,2 millimetri in un tubo da sette millilitri. Agitare il tubo nell'omogeneizzatore per 60 secondi alla massima velocità impostata.Aggiungere cinque millilitri di adiuvante IFA al tubo e agitare nuovamente per 60 secondi alla massima velocità. Quindi trasferire il liquame in un tubo fresco con una pipetta lasciando le perline dietro e conservare a quattro gradi Celsius fino all'uso. Per preparare un'emulsione CFA/Peptide, scaricare il file supplementare uno per calcolare la quantità necessaria per ciascun reagente.Quindi posizionare il tubo con tappo a vite e i reagenti da utilizzare sul ghiaccio. Quindi, aggiungere i componenti dell'emulsione. Prima PBS, poi il peptide, il liquame CFA.E infine, IFA. Chiudere saldamente il tubo con il tappo stringendolo e allentandolo più volte. Agitare vigorosamente il tubo per 5-10 secondi a mano per premiscelare i reagenti.Posizionare il tubo nell'omogeneizzatore agitatore e fissarlo con l'asta. Impostare la velocità sull'impostazione massima e il tempo su 60 secondi. Una volta terminata la corsa, posizionare il tubo sul ghiaccio per tre minuti e ripetere la corsa una o due volte con le stesse impostazioni.Centrifugare il tubo a 300 G da un minuto per rimuovere l'aria intrappolata e compattare l'emulsione. Rimuovere il tappo dal tubo. Inserire lo stantuffo nel tubo e spingerlo lentamente verso il basso fino a raggiungere la parte superiore dell'emulsione.Rimuovere la custodia a scatto nella parte inferiore del tubo ruotandola. Quindi, rimuovere lo stantuffo da tutte le siringhe per iniezione e aggiungere un ago alle siringhe per iniezione. Quindi attaccare la parte posteriore della siringa per iniezione alla serratura dedicata nella parte inferiore del tubo e bloccarla con una breve torsione.Trasferire l'emulsione dal tubo alla siringa per iniezione spingendo delicatamente lo stantuffo. Interrompere quando l'emulsione raggiunge la graduazione di 0,15 millilitri della siringa per iniezione. Separare la siringa per iniezione dal tubo e inserire lo stantuffo con cautela avendo cura che l'aria non entri in questa siringa.Spingere lo stantuffo fino a quando l'emulsione esce dall'ago e ripetere il processo per il resto dell'emulsione presente nel tubo. Per analizzare le dimensioni delle particelle di acqua e olio aggiungere una piccola goccia di emulsione a un vetrino da microscopio, spalmarlo con un vetrino di copertura e quindi spingere forte con un movimento circolare per appiattire l'emulsione. Esaminare l'emulsione spalmata al microscopio a contrasto di fase con ingrandimento 400 volte e concentrarsi su un campo con un monostrato dell'emulsione.Assicurarsi che siano visibili particelle piccole, uniformi, grigie o bianche. Le emulsioni prodotte con il metodo di omogeneizzazione mostravano particelle grigie o bianche a forma di fagiolo che rappresentavano minuscole goccioline di emulsioni di acqua e olio. Al contrario, le goccioline di emulsione prodotte utilizzando il metodo della siringa erano più grandi e più larghe.Nel metodo del vortice, sono state osservate grandi particelle grigie o nere corrispondenti a bolle d'aria intrappolate nell'emulsione. I cambiamenti nella distribuzione delle dimensioni delle particelle nel tempo misurati utilizzando un analizzatore granulometrico di defrazione laser per emulsioni di acqua e olio non hanno mostrato alcun cambiamento nella dimensione delle particelle in un periodo di sei settimane. Le emulsioni fresche di 3 settimane e 15 settimane hanno tutte indotto malattie EAE simili in tutti gli animali testati durante l'esperimento.I topi hanno sviluppato un modello di malattia simile in tutti gli esperimenti rivelando che il metodo di omogeneizzazione qui presentato ha prodotto emulsioni che hanno indotto EAE in modo coerente e riproducibile. Prima di realizzare l'emulsione per un esperimento, scaricare il file supplementare numero uno per calcolare la quantità di ciascun componente necessaria per ridurre al minimo gli sprechi. Il metodo qui presentato potrebbe essere utilizzato per standardizzare la preparazione dell'emulsione non solo per la ricerca preclinica, ma anche in futuro per preparare vaccini contro il cancro nella clinica.

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Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Indotta encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in C57BL / 6 Mice

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Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...