Name: a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

Forfatteren ønsker å anerkjenne dyreboligene ved Lunds universitet, Camilla Björklöv og Agnieszka Czopek, for deres støtte, og Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, Storbritannia, for konstruktiv kritikk og språklig støtte som produserer dette manuskriptet.

Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til praksisen til det svenske styret for dyreforsøk og ble godkjent av Animal Ethics Committee, Lund-Malmö, Sverige (Tillatelsesnummer: M126-16).
MERK: En skjematisk flyt av metoden er beskrevet i figur 1.
1. Materiell forberedelse
MERK: Forbered alle reagensene aseptisk i en steril hette, og aliquot og oppbevar ved den angitte temperaturen. Reagensen...

<ol>
	<li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide:+Insights+from+the+Atlas+of+MS,+third+edition.">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li><li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+and+T+cells+driving+multiple+sclerosis:+identity,+mechanisms+and+potential+triggers.">B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers.</a> Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).</li><li>Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One,+No+One,+and+One+Hundred+Thousand:+T+Regulatory+Cells'+Multiple+Identities+in+Neuroimmunity.">One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).</li><li>Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+multiple+sclerosis--potentials+and+limitations.">Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations.</a> Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).</li><li>Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+in+Mice.">Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).</li><li>Topping, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+antigen-emulsion+preparations+for+the+induction+of+autoimmune+disease+models.">Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models.</a> Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).</li><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+vortex+method+for+preparing+antigen/adjuvant+emulsions+for+immunization.">A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).</li><li>M&#228;&#228;tt&#228;, J. A., Er&#228;linna, J. P., R&#246;ytt&#228;, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+state+of+the+neuroantigen+in+adjuvant+emulsions+determines+encephalitogenic+status+in+the+BALB/c+mouse.">Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).</li><li>Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+the+preparation+of+antigen+emulsions+for+immunization.">Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).</li><li>Waksman, B. H., Adams, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+neuritis:+an+experimental+disease+of+rabbits+induced+by+the+injection+of+peripheral+nervous+tissue+and+adjuvants.">Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants.</a> The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).</li><li>Vladutiu, A. O., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+murine+thyroiditis+relation+to+histocompatibility+(H-2)+type.">Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type.</a> Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).</li><li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+the+rat+and+mouse.">Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Tuzun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+standard+preclinical+experiments+in+the+mouse+model+of+myasthenia+gravis+induced+by+acetylcholine+receptor+immunization.">Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization.</a> Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).</li><li>Brinckerhoff, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+inhibit+proteolytic+degradation+of+an+immunogenic+MART-1(27-35)+peptide:+implications+for+peptide+vaccines.">Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines.</a> International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).</li><li>Kool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells.">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).</li><li>Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+induction+of+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice+for+the+longitudinal+study+of+pathology+and+repair.">Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair.</a> Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).</li><li>Freund, J., Lipton, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+after+the+excision+of+the+injection+site+of+antigen-adjuvant+emulsion.">Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion.</a> The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).</li><li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li><li>Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+unresponsiveness+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+resistant+mouse+strains+by+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge.">Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).</li><li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+to+assess+the+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+vivax+CS+synthetic+vaccine.">Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine.</a> Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+association+factors+for+developing+effective+peptide-based+cancer+vaccines.">Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).</li><li>Neninger Vinageras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+randomized+controlled+trial+of+an+epidermal+growth+factor+vaccine+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).</li></ol>

Vann-i-olje-emulsjoner, som antigen / Freunds adjuvans, har blitt brukt i mer enn et halvt århundre for å indusere EAE17. Det er for tiden ingen standardisert metode for å fremstille antigenemulsjoner som er uavhengig av menneskelig påvirkning. Manuell blanding ved hjelp av sprøyter er standard for de fleste laboratorier, men denne metoden er tidkrevende, resulterer ofte i et overdreven tap av materiale, og kvaliteten varierer avhengig av forskeren som forbereder den.
<p class="jove_conte...

En sammenbrudd av immunologisk toleranse kan resultere i generering av autoimmune lidelser, som multippel sklerose (MS). Det anslås at 2,8 millioner mennesker lever medMS over hele verden 1. Selv om den eksakte årsaken til MS fortsatt i stor grad er ukjent, spiller dysregulering av autoreaktive T- og B-celler, samt defekter i Treg-funksjonen, viktige roller i patogenesen av sykdommen 2,3.
Dyremodeller av autoimmune sykdommer er viktige verktøy for å undersøke potensielle terapeutiske modaliteter. Den eksperimentelle autoimmune encefalomyelitt (EAE) -modellen har blitt brukt i nesten et århundre av forskere interessert i MS4. I tidlige eksperimenter var forekomsten av sykdommen relativt lav. Introduksjonen av komplett Freunds adjuvans (CFA), som inneholder Mycobacterium og kikhostetoksin, muliggjorde konsekvent induksjon av EAE hos mus4. Viktigst er det nødvendig å blande CFA med et sentralnervesystemet (CNS) -spesifikt antigen for å generere en homogen vann-i-olje-emulsjon for å indusere EAE. De vanligste tilgjengelige EAE-modellene er basert på aktiv immunisering av mus med encefalitogene peptider. Den genetiske bakgrunnen til musene spiller en viktig rolle i sykdomsfølsomhet, med myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG35-55) og myelin proteolipidprotein (PLP139-151) peptider som brukes til å indusere EAE i henholdsvis C57BL / 6J og SJL mus, henholdsvis5. Imidlertid kan andre musestammer og CNS-avledede peptider også brukes.
Kvaliteten på CFA/peptidemulsjonen er en kritisk faktor som bestemmer sykdomspenetrans i den aktive immuniseringen EAE modell6. En homogen vann-i-olje-emulsjon må fremstilles ved å blande de encefalitogene peptidene oppløst i vandig buffer med CFA, ellers vil dyr ikke utvikle sykdommen. Tallrike protokoller er publisert om fremstilling av CFA / peptidemulsjoner. Eksempler inkluderer bruk av en vortex7, sonikering8, sprøyter og en treveis T-kontakt9, eller en sprøyte bare5. Imidlertid er alle disse metodene vanskelige å standardisere og er ofte forbundet med lange og kompliserte protokoller.
Sammenlignet med alle de ovennevnte metodene, gir den enkle metoden beskrevet her for emulsjonsfremstilling fordelene ved å ikke ha noen person-til-person-forskjeller og være relativt rask. Emulsjonen genereres av en homogenisator som rister reagensene med en angitt hastighet, tid og temperatur, noe som sikrer raske og konsistente resultater. I tillegg til å indusere sykdom i EAE-modellen, kan denne metoden også brukes til å studere andre autoimmune sykdomsmodeller som kollagenindusert artritt (CIA) og antigenindusert artritt (AIA)6. Derfor forventes det at denne metoden kan brukes til konsekvent å indusere sykdom i andre dyremodeller som er avhengige av vann-i-olje-emulsjoner med autoantigener, som eksperimentell autoimmun neuritt (EAN)10, eksperimentell autoimmun tyroiditt (EAT)11, autoimmun uveitt (EAU)12 og myasthenia gravis (MG)13. Denne metoden induserer også generelle immunresponser som forsinket hypersensitivitet (DTH) konsekvent6, og kan derfor brukes til å levere kreft- og malariavaksiner (se diskusjon).
Således er det utviklet en rask (total forberedelsestid ~ 30 min), enkel (alle reagenser kan fremstilles på forhånd og lagres) og standardisert (emulsjonen oppnås ved hjelp av en risting homogenisator) metode og presenteres her. CFA / antigenemulsjonene fremstilt ved bruk av denne protokollen induserer konsekvent sykdom i autoimmune dyremodeller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>9166017V&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 ml empty tubes with caps</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000944LYSK0A.0</td>
			<td>7 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bordetella pertussis toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2980</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersant, light mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsion kit</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>D34200.10 ea</td>
			<td>Containing a tube, cap, and plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#39;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F5506</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis, H37RA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF3114-33-8</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastersizer 2000&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Particle size analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys-Personal homogenizer</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Shaking homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG 35-55 Peptide&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Innovagen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montanide ISA 51 VG</td>
			<td>Seppic</td>
			<td>36362Z</td>
			<td>FDA-approved oil adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17124381</td>
			<td>Sterlie filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-Constrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0445832</td>
			<td>Autoclave and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648463</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis

Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) deler lignende immunologiske og kliniske trekk med multippel sklerose (MS), og er derfor mye brukt som modell for å identifisere nye legemiddelmål for bedre pasientbehandling. MS er preget av flere forskjellige sykdomsforløp: relapsing-remitting MS (RRMS), primær progressiv MS (PPMS), sekundær progressiv MS (SPMS), og en sjelden progressiv-relapsing form for MS (PRMS). Selv om dyremodeller ikke nøyaktig etterligner alle disse kontrasterende humane sykdomsfenotypene, er det EAE-modeller som gjenspeiler noen av de forskjellige kliniske manifestasjonene av MS. For eksempel etterligner myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG) -indusert EAE i C57BL / 6J mus human PPMS, mens myelin proteolipidprotein (PLP) -indusert EAE i SJL / J mus ligner RRMS. Andre autoantigener, som myelin basisk protein (MBP), og en rekke forskjellige musestammer brukes også til å studere EAE. For å indusere sykdom i disse autoantigen-immunisering EAE-modellene, fremstilles en vann-i-olje-emulsjon og injiseres subkutant. De fleste EAE-modeller krever også en injeksjon av kikhostetoksin for at sykdommen skal utvikle seg. For konsistent og reproduserbar EAE-induksjon er det nødvendig med en detaljert protokoll for å fremstille reagensene for å produsere antigen / adjuvante emulsjoner. Metoden beskrevet her utnytter en standardisert metode for å generere vann-i-olje-emulsjoner. Det er enkelt og raskt og bruker en risting homogenisator i stedet for sprøyter for å forberede kvalitetskontrollerte emulsjoner.

Den raske, enkle og standardiserte protokollen for fremstilling av CFA / MOG-emulsjoner er avbildet i figur 1. Denne metoden er nylig beskrevet andre steder6. CFA/MOG-emulsjonene kan også fremstilles med andre metoder, for eksempel den tradisjonelle sprøytemetoden eller ved vortexing. Disse metodene ble sammenlignet her ved å vurdere kvaliteten på emulsjonene. Alle metodene produserte vann-i-olje-emulsjoner; Homogeniteten og kvaliteten på disse emulsjonene ble vu...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

For å indusere eksperimentell autoimmun encefalomyelitt, en dyremodell av multippel sklerose, immuniseres mus med en vann-i-olje-emulsjon som inneholder et autoantigen og fullfører Freunds adjuvans. Mens det finnes flere protokoller for fremstilling av disse emulsjonene, presenteres en rask, enkel og standardisert homogeniseringsprotokoll for emulsjonsfremstilling her.

En rask, enkel og standardisert homogeniseringsmetode for å fremstille antigen / adjuvante emulsjoner for å indusere eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt eller EAE er en dyremodell som brukes til å utvikle nye og forbedrede behandlinger for pasienter med multippel sklerose. Induserende sykdom i EAE krever en perfekt olje- og vannemulsjon for å oppnå konsistente resultater. Metoden for emulsjonsfremstilling som presenteres her, er fri for menneskelig påvirkning, og begrenser dermed inkonsekvenser fra ett eksperiment til et annet.Selv om metoden er optimalisert for EAE, kan den også brukes til andre autoimmune sykdomsmodeller og også til å teste kreftvaksiner. For å forberede CFA-oppslemmingen ved 100 milligram frysetørket M tuberculosis H37 RA og fem, 3,2 millimeter stålperler til et syv milliliter rør. Rist røret i homogenisatoren i 60 sekunder ved høyeste hastighetsinnstilling.Tilsett fem milliliter IFA-adjuvans i røret og rist igjen i 60 sekunder med høyeste hastighet. Overfør deretter oppslemmingen til et nytt rør med en pipette som forlater perlene og oppbevar ved fire grader Celsius til bruk. For å fremstille en CFA / peptidemulsjon, last ned tilleggsfil en for å beregne mengden som trengs for hvert reagens.Plasser deretter det skruekappede røret og reagensene som skal brukes på is. Deretter legger du til emulsjonskomponentene. Først PBS, deretter peptidet, CFA-oppslemmingen.Og til slutt, IFA. Lukk røret med hetten godt ved å stramme og løsne det flere ganger. Rist røret kraftig i 5 til 10 sekunder for hånd for å premikse reagensene.Plasser røret i den ristende homogenisatoren og fest den med stangen. Still hastigheten til den høyeste innstillingen og tiden til 60 sekunder. Når løpet er ferdig, legg røret på is i tre minutter og gjenta løpet en eller to ganger til med de samme innstillingene.Sentrifuger røret ved 300 G fra ett minutt for å fjerne fanget luft og komprimere emulsjonen. Fjern hetten fra røret. Sett stempelet inn i røret, og skyv det sakte ned til det når toppen av emulsjonen.Fjern snap off-kabinettet i bunnen av røret ved å vri det. Fjern deretter stempelet fra alle injeksjonssprøyter og tilsett en kanyle i injeksjonssprøytene. Fest deretter baksiden av injeksjonssprøyten til den dedikerte låsen i bunnen av røret og lås den med en kort vri.Overfør emulsjonen fra slangen til injeksjonssprøyten ved å trykke forsiktig på stempelet. Stopp når emulsjonen når 0, 15 milliliter gradering av injeksjonssprøyten. Skill injeksjonssprøyten fra slangen og sett stempelet forsiktig inn og pass på at det ikke kommer luft inn i denne sprøyten.Skyv stempelet til emulsjonen kommer ut av nålen og gjenta prosessen for resten av emulsjonen som er tilstede i røret. For å analysere størrelsen på vann- og oljepartiklene, legg til en liten dråpe av emulsjonen til et mikroskopglass, smør det ut med en dekselglid, og skyv deretter hardt i en sirkulær bevegelse for å flate ut emulsjonen. Undersøk den smurte emulsjonen under et fasekontrastmikroskop med 400 ganger forstørrelse og fokuser på et felt med et monolag av emulsjonen.Sørg for at små, ensartede, grå eller hvite partikler er synlige. Emulsjoner produsert ved homogeniseringsmetoden viste grå eller hvite bønneformede partikler som representerte små dråper vann og oljeemulsjoner. I motsetning til dette var emulsjonsdråpene produsert ved hjelp av sprøytemetoden større og bredere.I virvelmetoden ble det observert store grå eller svarte partikler tilsvarende luftbobler fanget i emulsjonen. Endringer i partikkelstørrelsesfordeling over tid målt ved hjelp av en laserbrytningspartikkelstørrelsesanalysator for vann- og oljeemulsjoner viste ingen endring i partikkelstørrelse over en periode på seks uker. De friske 3 uker gamle og 15 uker gamle emulsjonene induserte alle lignende EAE-sykdommer hos alle dyr som ble testet gjennom hele forsøket.Mus utviklet et lignende sykdomsmønster i alle eksperimenter som avslørte at homogeniseringsmetoden som ble presentert her, produserte emulsjoner som induserte EAE på en konsistent og reproduserbar måte. Før du lager emulsjonen for et eksperiment, last ned tilleggsfil nummer én for å beregne mengden av hver komponent som trengs for å minimere avfall. Metoden som presenteres her, kan brukes til å standardisere emulsjonspreparat, ikke bare for preklinisk forskning, men også i fremtiden for å forberede kreftvaksiner i klinikken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overvinne manglende respons i Eksperimentelle Autoimmune encefalomyelitt (EAE) Resistente musestammer av adoptivforeldre Transfer og antigen Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myelin oligodendrocyte Glycoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induced Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) i C57BL / 6 Mus

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induksjon av eksperimentell autoimmun encefalomyelitt hos mus og evaluering av sykdom avhengige Fordeling av immunceller i ulike vev

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

En enkel Flowcytometriske metode for å måle glukoseopptak og Glukose Transporter Expression for Monocyttnivåene subpopulasjoner i fullblod

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Enkel og effektiv produksjon og rensing av Mouse Myelin oligodendrocyte glykoprotein for eksperimentell autoimmun encefalomyelitt Studier

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Visualisere nedsatt Endothelial og Glial barrierer av nevrovaskulære under eksperimentelle Autoimmune immunsviktvirus i Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow Cytometric Analyse av lymfocytt infiltrasjon i sentralnervesystemet under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...