Name: a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

Автор хотел бы выразить признательность подразделениям по содержанию животных в Лундском университете, Камилле Бьорклёв и Агнешке Чопек за их поддержку, а также Ричарду Уильямсу, Институт ревматологии Кеннеди, Оксфордский университет, Великобритания, за конструктивную критику и лингвистическую поддержку при создании этой рукописи.

Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с практикой Шведского совета по исследованиям животных и были одобрены Комитетом по этике животных, Лунд-Мальмё, Швеция (номер разрешения: M126-16).
ПРИМЕЧАНИЕ: Схематический поток метода описан на рисунке ...

<ol>
	<li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide:+Insights+from+the+Atlas+of+MS,+third+edition.">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li><li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+and+T+cells+driving+multiple+sclerosis:+identity,+mechanisms+and+potential+triggers.">B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers.</a> Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).</li><li>Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One,+No+One,+and+One+Hundred+Thousand:+T+Regulatory+Cells'+Multiple+Identities+in+Neuroimmunity.">One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).</li><li>Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+multiple+sclerosis--potentials+and+limitations.">Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations.</a> Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).</li><li>Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+in+Mice.">Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).</li><li>Topping, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+antigen-emulsion+preparations+for+the+induction+of+autoimmune+disease+models.">Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models.</a> Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).</li><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+vortex+method+for+preparing+antigen/adjuvant+emulsions+for+immunization.">A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).</li><li>M&#228;&#228;tt&#228;, J. A., Er&#228;linna, J. P., R&#246;ytt&#228;, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+state+of+the+neuroantigen+in+adjuvant+emulsions+determines+encephalitogenic+status+in+the+BALB/c+mouse.">Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).</li><li>Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+the+preparation+of+antigen+emulsions+for+immunization.">Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).</li><li>Waksman, B. H., Adams, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+neuritis:+an+experimental+disease+of+rabbits+induced+by+the+injection+of+peripheral+nervous+tissue+and+adjuvants.">Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants.</a> The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).</li><li>Vladutiu, A. O., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+murine+thyroiditis+relation+to+histocompatibility+(H-2)+type.">Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type.</a> Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).</li><li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+the+rat+and+mouse.">Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Tuzun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+standard+preclinical+experiments+in+the+mouse+model+of+myasthenia+gravis+induced+by+acetylcholine+receptor+immunization.">Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization.</a> Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).</li><li>Brinckerhoff, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+inhibit+proteolytic+degradation+of+an+immunogenic+MART-1(27-35)+peptide:+implications+for+peptide+vaccines.">Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines.</a> International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).</li><li>Kool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells.">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).</li><li>Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+induction+of+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice+for+the+longitudinal+study+of+pathology+and+repair.">Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair.</a> Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).</li><li>Freund, J., Lipton, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+after+the+excision+of+the+injection+site+of+antigen-adjuvant+emulsion.">Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion.</a> The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).</li><li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li><li>Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+unresponsiveness+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+resistant+mouse+strains+by+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge.">Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).</li><li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+to+assess+the+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+vivax+CS+synthetic+vaccine.">Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine.</a> Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+association+factors+for+developing+effective+peptide-based+cancer+vaccines.">Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).</li><li>Neninger Vinageras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+randomized+controlled+trial+of+an+epidermal+growth+factor+vaccine+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).</li></ol>

Эмульсии «вода в масле», такие как антиген / адъювант Фройнда, использовались более полувека для индуцирования EAE17. В настоящее время не существует стандартизированного метода получения антигенных эмульсий, который не зависел бы от влияния человека. Ручное смешивание с ис?...

Нарушение иммунологической толерантности может привести к генерации аутоиммунных расстройств, таких как рассеянный склероз (РС). По оценкам, 2,8 миллиона человек живут с РС во всем мире1. Хотя точная причина РС до сих пор в значительной степени неизвестна, дисрегуляция аутореактивных Т- и В-клеток, а также дефекты функции Treg играют важную роль в патогенезе заболевания 2,3.
Животные модели аутоиммунных заболеваний являются важными инструментами для исследования потенциальных терапевтических методов. Экспериментальная модель аутоиммунного энцефаломиелита (EAE) используется в течение почти столетия исследователями, заинтересованными в MS4. В ранних экспериментах заболеваемость была относительно низкой. Введение полного адъюванта Фройнда (CFA), содержащего микобактерии и токсин коклюша, позволило последовательно индукционировать EAE у мышей4. Самое главное, необходимо смешать CFA с антигеном, специфичным для центральной нервной системы (ЦНС), чтобы получить однородную эмульсию «вода в масле» для индуцирования EAE. Наиболее распространенные в настоящее время модели EAE основаны на активной иммунизации мышей энцефалогенными пептидами. Генетический фон мышей играет важную роль в восприимчивости к заболеванию, причем пептиды миелин-олигодендроцитарных гликопротеинов (MOG35-55) и протеолипидного белка миелина (PLP139-151) используются для индуцирования EAE у мышей C57BL/6J и SJL соответственно5. Тем не менее, другие мышиные штаммы и пептиды, полученные из ЦНС, также могут быть использованы.
Качество CFA/пептидной эмульсии является критическим фактором, определяющим пенетрантность заболевания в активной иммунизации EAE model6. Гомогенная эмульсия «вода в масле» должна быть получена путем смешивания энцефалтогенных пептидов, растворенных в водном буфере с CFA, иначе у животных не разовьется болезнь. Были опубликованы многочисленные протоколы по приготовлению CFA/пептидных эмульсий. Примеры включают использование вихря7, обработки ультразвуком8, шприцев и трехстороннего Т-образного разъема9 или одного шприца только5. Однако все эти методы трудно стандартизировать и часто связаны с длинными и сложными протоколами.
По сравнению со всеми вышеперечисленными методами, простой метод, описанный здесь для приготовления эмульсии, предлагает преимущества отсутствия различий между людьми и относительно быстроты. Эмульсия генерируется гомогенизатором, встряхивающим реагенты с заданной скоростью, временем и температурой, обеспечивая быстрые и последовательные результаты. В дополнение к индуцированию заболевания в модели EAE, этот метод также может быть использован для изучения других моделей аутоиммунных заболеваний, таких как коллаген-индуцированный артрит (CIA) и антиген-индуцированный артрит (AIA)6. Поэтому предполагается, что этот метод может быть использован для последовательного индуцирования заболевания на других животных моделях, которые зависят от эмульсий «вода в масле» с аутоантигенами, таких как экспериментальный аутоиммунный неврит (EAN)10, экспериментальный аутоиммунный тиреоидит (EAT)11, аутоиммунный увеит (EAU)12 и миастения (MG)13. Этот метод также вызывает общие иммунные реакции, такие как гиперчувствительность замедленного типа (DTH) последовательно6, и поэтому может быть использован для доставки противораковых и малярийных вакцин (см. обсуждение).
Таким образом, разработан и представлен здесь быстрый (общее время приготовления ~30 мин), простой (все реагенты могут быть приготовлены заранее и сохранены) и стандартизированный (эмульсия осуществляется с помощью встряхивающего гомогенизатора) способ. Эмульсии CFA/антигена, приготовленные с использованием этого протокола, последовательно индуцируют заболевание на аутоиммунных животных моделях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>9166017V&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 ml empty tubes with caps</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000944LYSK0A.0</td>
			<td>7 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bordetella pertussis toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2980</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersant, light mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsion kit</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>D34200.10 ea</td>
			<td>Containing a tube, cap, and plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#39;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F5506</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis, H37RA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF3114-33-8</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastersizer 2000&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Particle size analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys-Personal homogenizer</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Shaking homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG 35-55 Peptide&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Innovagen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montanide ISA 51 VG</td>
			<td>Seppic</td>
			<td>36362Z</td>
			<td>FDA-approved oil adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17124381</td>
			<td>Sterlie filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-Constrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0445832</td>
			<td>Autoclave and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648463</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) имеет сходные иммунологические и клинические особенности с рассеянным склерозом (РС) и поэтому широко используется в качестве модели для определения новых лекарственных мишеней для лучшего лечения пациентов. РС характеризуется несколькими различными течениями заболевания: рецидивирующе-ремиттирующий РС (РРМС), первично-прогрессирующий РС (ППМС), вторичный прогрессирующий РС (СПМС) и редкая прогрессирующая рецидивирующая форма РС (ПРМС). Хотя животные модели не точно имитируют все эти контрастные фенотипы заболеваний человека, существуют модели EAE, которые отражают некоторые из различных клинических проявлений РС. Например, миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин (MOG), индуцированный EAE у мышей C57BL/6J, имитирует человеческую PPMS, в то время как миелиновый протеолипидный белок (PLP), индуцированный EAE у мышей SJL / J, напоминает RRMS. Другие аутоантигены, такие как основной белок миелина (MBP), и ряд различных штаммов мышей также используются для изучения EAE. Чтобы вызвать заболевание в этих аутоантигенно-иммунизационных моделях EAE, готовят эмульсию «вода в масле» и вводят подкожно. Большинство моделей EAE также требуют инъекции коклюшного токсина для развития заболевания. Для последовательной и воспроизводимой индукции EAE необходим подробный протокол подготовки реагентов к получению эмульсий антигена/адъюванта. Метод, описанный здесь, использует преимущества стандартизированного метода для получения эмульсий «вода в масле». Он прост и быстр и использует встряхивающий гомогенизатор вместо шприцев для приготовления эмульсий с контролируемым качеством.

Быстрый, простой и стандартизированный протокол приготовления эмульсий CFA/MOG показан на рисунке 1. Этот метод недавно был описан в другом месте6. Эмульсии CFA/MOG также могут быть получены с помощью других способов, таких как традиционный шприцевой метод или пут...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Чтобы вызвать экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, животную модель рассеянного склероза, мышей иммунизируют эмульсией «вода в масле», содержащей аутоантиген и полный адъювант Фройнда. Хотя для приготовления этих эмульсий существует несколько протоколов, здесь представлен быстрый, простой и стандартизированный протокол гомогенизации для получения эмульсии.

Быстрый, простой и стандартизированный метод гомогенизации для получения антигенных / адъювантных эмульсий для индуцирования экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит или EAE - это животная модель, используемая для разработки новых и улучшенных методов лечения пациентов с рассеянным склерозом. Индуцирование заболевания в EAE требует идеальной масляной и водной эмульсии для достижения последовательных результатов. Представленный здесь способ получения эмульсии свободен от влияния человека, тем самым ограничивая несоответствия от одного эксперимента к другому.Несмотря на то, что метод был оптимизирован для EAE, он также может быть использован для другой модели аутоиммунных заболеваний, а также для тестирования противораковых вакцин. Для приготовления Суспензии CFA на 100 миллиграммах сублимированного M tuberculosis H37 RA и пяти, 3,2 миллиметровых стальных шариках до семимиллилитровой трубки. Встряхните трубку в гомогенизаторе в течение 60 секунд при максимальной скорости.Добавьте пять миллилитров адъюванта IFA в трубку и снова встряхните в течение 60 секунд на самой высокой скорости. Затем переложите суспензию в свежий тюбик с пипеткой, оставив бусины, и храните при четырех градусах Цельсия до использования. Чтобы приготовить эмульсию CFA/Peptide, загрузите дополнительный файл для расчета количества, необходимого для каждого реагента.Затем поместите завинчиваемую трубку и реагенты для использования на льду. Далее добавьте компоненты эмульсии. Сначала PBS, затем пептид, суспензия CFA.И, наконец, IFA. Плотно закройте трубку колпачком, затянув и ослабив ее несколько раз. Энергично встряхните трубку в течение 5-10 секунд вручную, чтобы предварительно смешать реагенты.Поместите трубку в встряхивающий гомогенизатор и закрепите ее стержнем. Установите максимальную настройку скорости и время 60 секунд. Как только пробег будет завершен, поместите трубку на лед на три минуты и повторите пробежку еще один или два раза с теми же настройками.Центрифугируйте трубку при 300 G в течение одной минуты, чтобы удалить захваченный воздух и уплотнить эмульсию. Снимите колпачок с трубки. Вставьте плунжер в трубку и медленно толкайте его вниз, пока он не достигнет верхней части эмульсии.Снимите защелкивающийся корпус в нижней части трубки, скрутив его. Затем снимите поршень со всех инъекционных шприцев и добавьте иглу к инъекционным шприцам. Затем прикрепите заднюю часть инъекционного шприца к специальному замку в нижней части трубки и зафиксируйте его коротким поворотом.Перенесите эмульсию из трубки в шприц для инъекций, осторожно толкнув плунжер. Прекращается, когда эмульсия достигает 0,15 миллилитра градуировки инъекционного шприца. Отделите инжекционный шприц от трубки и вставьте поршень, тщательно следя за тем, чтобы воздух не попадал в этот шприц.Толкайте плунжер до тех пор, пока эмульсия не выйдет из иглы, и повторите процесс для остальной части эмульсии, присутствующей в трубке. Чтобы проанализировать размер частиц воды и масла, добавьте крошечную каплю эмульсии на предметное стекло микроскопа, смажьте ее скольжением крышки, а затем сильно надавите круговыми движениями, чтобы сгладить эмульсию. Исследуйте смазанную эмульсию под фазово-контрастным микроскопом с 400-кратным увеличением и фокусируйтесь на поле с монослоем эмульсии.Убедитесь, что видны мелкие, однородные, серые или белые частицы. Эмульсии, полученные методом гомогенизации, отображали серые или белые бобообразные частицы, представляющие собой мельчайшие капли водных и масляных эмульсий. Напротив, капли эмульсии, полученные с использованием шприцевого метода, были больше и шире.В вихревом методе наблюдались крупные серые или черные частицы, соответствующие пузырькам воздуха, захваченным в эмульсии. Изменения в распределении частиц по размерам с течением времени, измеренные с помощью лазерного дефракционного анализатора размера частиц для водных и масляных эмульсий, не показали каких-либо изменений в размере частиц в течение шести недель. Свежие эмульсии 3-недельного и 15-недельного возраста индуцировали аналогичные заболевания EAE у всех животных, протестированных на протяжении всего эксперимента.Мыши развили аналогичную картину заболевания во всех экспериментах, показывающих, что метод гомогенизации, представленный здесь, производил эмульсии, которые индуцировали EAE последовательным и воспроизводимым образом. Прежде чем сделать эмульсию для эксперимента, загрузите дополнительный файл номер один, чтобы рассчитать количество каждого компонента, необходимого для минимизации отходов. Представленный здесь метод может быть использован для стандартизации препарата эмульсии не только для доклинических исследований, но и в дальнейшем для приготовления противораковых вакцин в клинике.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Подготовка Мышь гипофиза Иммуноген для индукции экспериментального аутоиммунного гипофизит

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Индукция экспериментального аутоиммунного гипофизит в SJL Мыши

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Преодоление невосприимчивости в экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) штаммов мыши по усыновлению и передачи Антигенная вызов

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Миелин олигодендроцитов гликопротеин (МОГ<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Индуцированные Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ) в C57BL / 6 мышей

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей и оценка болезни зависимого распределения иммунных клеток в различных тканях

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Простой проточной цитометрии метод измерения глюкозы и глюкозы Transporter выражение для моноцитов субпопуляциях в цельной крови

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Простое и эффективное производство и очистка мыши миелина олигодендроцитов гликопротеина для экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита исследований

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Визуализация обесценения эндотелия и глиальных барьеров нервно-сосудистого подразделения во время Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит в естественных условиях

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Цитометрический анализ инфильтрации лимфоцитов в Центральной нервной системе во время экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...