Name: a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00
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El autor desea agradecer a las unidades de alojamiento de animales de la Universidad de Lund, Camilla Björklöv y Agnieszka Czopek, por su apoyo, y a Richard Williams, del Instituto Kennedy de Reumatología, Universidad de Oxford, Reino Unido, por la crítica constructiva y el apoyo lingüístico que produce este manuscrito.

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las prácticas de la Junta Sueca de Investigación Animal y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal, Lund-Malmö, Suecia (Número de permiso: M126-16).
NOTA: En la figura 1 se describe un flujo esquemático del método.
1. Preparación del material
NOTA: Preparar todos los reactivos asépticamente en una campana estéri...

<ol>
	<li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide:+Insights+from+the+Atlas+of+MS,+third+edition.">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li><li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+and+T+cells+driving+multiple+sclerosis:+identity,+mechanisms+and+potential+triggers.">B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers.</a> Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).</li><li>Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One,+No+One,+and+One+Hundred+Thousand:+T+Regulatory+Cells'+Multiple+Identities+in+Neuroimmunity.">One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).</li><li>Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. 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M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li><li>Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+unresponsiveness+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+resistant+mouse+strains+by+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge.">Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).</li><li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+to+assess+the+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+vivax+CS+synthetic+vaccine.">Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine.</a> Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+association+factors+for+developing+effective+peptide-based+cancer+vaccines.">Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).</li><li>Neninger Vinageras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+randomized+controlled+trial+of+an+epidermal+growth+factor+vaccine+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).</li></ol>

Las emulsiones de agua en aceite, como el antígeno/adyuvante de Freund, se han utilizado durante más de medio siglo para inducir EAE17. Actualmente no existe un método estandarizado para preparar emulsiones de antígenos que sea independiente de la influencia humana. La mezcla manual con jeringas es estándar para la mayoría de los laboratorios, sin embargo, este método lleva mucho tiempo, a menudo resulta en una pérdida excesiva de material y la calidad difiere según el científico que lo ...

Una ruptura de la tolerancia inmunológica puede resultar en la generación de trastornos autoinmunes, como la esclerosis múltiple (EM). Se estima que 2,8 millones de personas viven con EM en todo el mundo1. Aunque la causa exacta de la EM es todavía en gran parte desconocida, la desregulación de las células T y B autorreactivas, así como los defectos en la función Treg, juegan un papel importante en la patogénesis de la enfermedad 2,3.
Los modelos animales de enfermedades autoinmunes son herramientas esenciales para investigar posibles modalidades terapéuticas. El modelo experimental de encefalomielitis autoinmune (EAE) ha sido utilizado durante casi un siglo por investigadores interesados en la EM4. En los primeros experimentos, la incidencia de la enfermedad era relativamente baja. La introducción del adyuvante completo de Freund (CFA), que contiene Mycobacterium y toxina pertussis, permitió la inducción consistente de EAE en ratones4. Lo más importante es que es necesario mezclar CFA con un antígeno específico del sistema nervioso central (SNC) para generar una emulsión homogénea de agua en aceite para inducir EAE. Los modelos EAE más comunes actualmente disponibles se basan en la inmunización activa de ratones con péptidos encefalitogénicos. Los antecedentes genéticos de los ratones juegan un papel importante en la susceptibilidad a la enfermedad, con péptidos de glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG35-55) y proteína proteolípida de mielina (PLP139-151) utilizados para inducir EAE en ratones C57BL / 6J y SJL, respectivamente5. Sin embargo, también se pueden usar otras cepas de ratón y péptidos derivados del SNC.
La calidad de la emulsión CFA/péptido es un factor crítico que determina la penetrancia de la enfermedad en el modelo6 de inmunización activa EAE. Se debe preparar una emulsión homogénea de agua en aceite mezclando los péptidos encefalitogénicos disueltos en tampón acuoso con CFA, de lo contrario los animales no desarrollarán la enfermedad. Se han publicado numerosos protocolos sobre la preparación de emulsiones CFA/péptidos. Los ejemplos incluyen el uso de un vórtice7, sonicación8, jeringas y un conector T de tres vías9, o una jeringa solo5. Sin embargo, todos estos métodos son difíciles de estandarizar y a menudo se asocian con protocolos largos y complicados.
En comparación con todos los métodos anteriores, el método simple descrito aquí para la preparación de emulsiones ofrece las ventajas de no tener diferencias de persona a persona y ser relativamente rápido. La emulsión es generada por un homogeneizador que agita los reactivos con una velocidad, tiempo y temperatura establecidos, asegurando resultados rápidos y consistentes. Además de inducir enfermedad en el modelo EAE, este método también puede ser utilizado para estudiar otros modelos de enfermedades autoinmunes como la artritis inducida por colágeno (CIA) y la artritis inducida por antígenos (AIA)6. Por lo tanto, se anticipa que este método puede ser utilizado para inducir consistentemente la enfermedad en otros modelos animales que dependen de emulsiones de agua en aceite con autoantígenos, como la neuritis autoinmune experimental (EAN)10, la tiroiditis autoinmune experimental (EAT)11, la uveítis autoinmune (EAU)12 y la miastenia gravis (MG)13. Este método también induce respuestas inmunes generales, como la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) de manera consistente6, y por lo tanto podría usarse para administrar vacunas contra el cáncer y la malaria (ver discusión).
Por lo tanto, se ha desarrollado un método rápido (tiempo total de preparación ~ 30 min), simple (todos los reactivos se pueden preparar y almacenar) y estandarizado (la emulsión se logra utilizando un homogeneizador de agitación) y se presenta aquí. Las emulsiones CFA/antígeno preparadas utilizando este protocolo inducen consistentemente la enfermedad en modelos animales autoinmunes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>9166017V&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 ml empty tubes with caps</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000944LYSK0A.0</td>
			<td>7 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bordetella pertussis toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2980</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersant, light mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsion kit</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>D34200.10 ea</td>
			<td>Containing a tube, cap, and plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#39;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F5506</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis, H37RA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF3114-33-8</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastersizer 2000&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Particle size analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys-Personal homogenizer</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Shaking homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG 35-55 Peptide&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Innovagen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montanide ISA 51 VG</td>
			<td>Seppic</td>
			<td>36362Z</td>
			<td>FDA-approved oil adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17124381</td>
			<td>Sterlie filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-Constrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0445832</td>
			<td>Autoclave and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648463</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) comparte características inmunológicas y clínicas similares con la esclerosis múltiple (EM) y, por lo tanto, se usa ampliamente como modelo para identificar nuevos objetivos farmacológicos para un mejor tratamiento del paciente. La EM se caracteriza por varios cursos diferentes de la enfermedad: EM recurrente-remitente (EMRR), EM progresiva primaria (EMPP), EM progresiva secundaria (EMSP) y una forma rara de EM progresiva-recurrente (EMPR). Aunque los modelos animales no imitan con precisión todos estos fenotipos contrastantes de enfermedades humanas, existen modelos EAE que reflejan algunas de las diferentes manifestaciones clínicas de la EM. Por ejemplo, la EAE inducida por la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) en ratones C57BL / 6J imita la EMPP humana, mientras que la EAE inducida por la proteína proteolípida de mielina (PLP) en ratones SJL / J se asemeja a RRMS. Otros autoantígenos, como la proteína básica de mielina (MBP), y una serie de cepas de ratón diferentes también se utilizan para estudiar la EAE. Para inducir la enfermedad en estos modelos EAE de autoinmunización con antígenos, se prepara una emulsión de agua en aceite y se inyecta por vía subcutánea. La mayoría de los modelos de EAE también requieren una inyección de toxina pertussis para que la enfermedad se desarrolle. Para una inducción EAE consistente y reproducible, es necesario un protocolo detallado para preparar los reactivos para producir emulsiones antígeno/adyuvantes. El método descrito aquí aprovecha un método estandarizado para generar emulsiones de agua en aceite. Es simple y rápido y utiliza un homogeneizador agitador en lugar de jeringas para preparar emulsiones de calidad controlada.

El protocolo rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones CFA/MOG se muestra en la Figura 1. Este método ha sido descrito recientemente en otra parte6. Las emulsiones CFA/MOG también se pueden preparar con otros métodos, como el método tradicional de jeringa o por vórtice. Estos métodos se compararon aquí evaluando la calidad de las emulsiones. Todos los métodos produjeron emulsiones de agua en aceite; La homogeneidad y la calidad de esta...

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A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple, los ratones son inmunizados con una emulsión de agua en aceite que contiene un autoantígeno y un adyuvante completo de Freund. Si bien existen varios protocolos para la preparación de estas emulsiones, aquí se presenta un protocolo de homogeneización rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones.

Un método de homogeneización rápido, simple y estandarizado para preparar emulsiones de antígeno/adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune experimental

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

La encefalomielitis autoinmune experimental o EAE es un modelo animal utilizado para desarrollar tratamientos nuevos y mejorados para pacientes con esclerosis múltiple. La inducción de enfermedades en EAE requiere una emulsión perfecta de aceite y agua para lograr resultados consistentes. El método de preparación de emulsión presentado aquí está libre de influencia humana, lo que limita las inconsistencias de un experimento a otro.Aunque el método ha sido optimizado para EAE, también se puede utilizar para otros modelos de enfermedades autoinmunes y también para probar vacunas contra el cáncer. Para preparar la suspensión CFA a 100 miligramos de M tuberculosis H37 RA liofilizada y cinco, perlas de acero de 3,2 milímetros a un tubo de siete mililitros. Agite el tubo en el homogeneizador durante 60 segundos a la velocidad más alta.Añadir cinco mililitros de adyuvante IFA al tubo y agitar de nuevo durante 60 segundos a la velocidad más alta. Luego transfiera la suspensión a un tubo fresco con una pipeta dejando las perlas y guárdela a cuatro grados centígrados hasta que la use. Para preparar una emulsión CFA/péptido, descargue el archivo suplementario uno para calcular la cantidad necesaria para cada reactivo.Luego coloque el tubo tapado con rosca y los reactivos que se utilizarán en hielo. A continuación, agregue los componentes de la emulsión. Primero PBS, luego el péptido, la suspensión CFA.Y finalmente, IFA. Cierre el tubo con la tapa firmemente apretándolo y aflojándolo varias veces. Agite el tubo vigorosamente durante 5 a 10 segundos con la mano para premezclar los reactivos.Coloque el tubo en el homogeneizador de agitación y asegúrelo con la varilla. Ajuste la velocidad a la configuración más alta y el tiempo a 60 segundos. Una vez finalizada la carrera, coloque el tubo en hielo durante tres minutos y repita la carrera una o dos veces más con los mismos ajustes.Centrifugar el tubo a 300 G de un minuto para eliminar el aire atrapado y compactar la emulsión. Retire la tapa del tubo. Inserte el émbolo en el tubo y empújelo lentamente hacia abajo hasta que llegue a la parte superior de la emulsión.Retire la carcasa a presión en la parte inferior del tubo girándola. A continuación, retire el émbolo de todas las jeringas de inyección y agregue una aguja a las jeringas de inyección. Luego conecte la parte posterior de la jeringa de inyección a la cerradura dedicada en la parte inferior del tubo y bloquéela con un giro corto.Transfiera la emulsión del tubo a la jeringa de inyección empujando suavemente el émbolo. Deténgase cuando la emulsión alcance la graduación de 0,15 mililitros de la jeringa de inyección. Separe la jeringa de inyección del tubo e inserte el émbolo cuidadosamente teniendo cuidado de que no entre aire en esta jeringa.Empuje el émbolo hasta que la emulsión salga de la aguja y repita el proceso para el resto de la emulsión presente en el tubo. Para analizar el tamaño de las partículas de agua y aceite, agregue una pequeña gota de la emulsión a un portaobjetos de microscopio, unte con un cubreobjetos y luego empuje con fuerza en un movimiento circular para aplanar la emulsión. Examine la emulsión manchada bajo un microscopio de contraste de fase con un aumento de 400 veces y concéntrese en un campo con una monocapa de la emulsión.Asegúrese de que las partículas pequeñas, uniformes, grises o blancas sean visibles. Las emulsiones producidas por el método de homogeneización mostraron partículas en forma de frijol gris o blanco que representan pequeñas gotas de emulsiones de agua y aceite. En contraste, las gotas de emulsión producidas usando el método de jeringa eran más grandes y anchas.En el método de vórtice, se observaron grandes partículas grises o negras correspondientes a burbujas de aire atrapadas en la emulsión. Los cambios en la distribución del tamaño de partícula a lo largo del tiempo medidos con un analizador de tamaño de partícula de defracción láser para emulsiones de agua y aceite no mostraron ningún cambio en el tamaño de partícula durante un período de seis semanas. Las emulsiones frescas de 3 semanas y 15 semanas de edad indujeron enfermedades EAE similares en todos los animales probados durante todo el experimento.Los ratones desarrollaron un patrón de enfermedad similar en todos los experimentos revelando que el método de homogeneización presentado aquí produjo emulsiones que indujeron EAE de manera consistente y reproducible. Antes de hacer la emulsión para un experimento, descargue el archivo suplementario número uno para calcular la cantidad de cada componente necesaria para minimizar el desperdicio. El método presentado aquí podría usarse para estandarizar la preparación de emulsiones no solo para la investigación preclínica, sino también en el futuro para preparar vacunas contra el cáncer en la clínica.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Preparación de inmunógeno ratón hipófisis para la inducción de la hipofisitis autoinmune experimental

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Investigación

Inmunología e Infección

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

La mielina glicoproteína del oligodendrocito (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Inducida por la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratones C57BL / 6 ratones

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

La inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones y evaluación de la distribución de la enfermedad dependiente de las células inmunes en diversos tejidos

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Una citometría de flujo simple método para medir la captación de glucosa y la expresión del transportador de la glucosa por monocitos subpoblaciones en sangre entera

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Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Producción simple y eficiente y purificación de ratón mielina de oligodendrocitos de la glucoproteína de la encefalomielitis autoinmune experimental Estudios

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Visualizar el deterioro de las barreras endoteliales y Glial de la unidad Neurovascular durante la encefalomielitis Autoinmune Experimental In Vivo

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Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...