Name: a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

Författaren vill uppmärksamma djurhållningsenheterna vid Lunds universitet, Camilla Björklöv och Agnieszka Czopek, för deras stöd, och Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, Storbritannien, för konstruktiv kritik och språkligt stöd för att producera detta manuskript.

Alla djurförsök utfördes enligt Djurförsöksmyndighetens praxis och godkändes av djurförsöksetiska nämnden, Lund-Malmö (Tillståndsnummer: M126-16).
OBS: Ett schematiskt flöde av metoden beskrivs i figur 1.
1. Förberedelse av material
OBS: Förbered alla reagens aseptiskt i en steril huva och alikvotera och förvara vid angiven temperatur. Reagenserna kan lagras upp till 2 år utan a...

<ol>
	<li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide:+Insights+from+the+Atlas+of+MS,+third+edition.">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li><li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+and+T+cells+driving+multiple+sclerosis:+identity,+mechanisms+and+potential+triggers.">B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers.</a> Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).</li><li>Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One,+No+One,+and+One+Hundred+Thousand:+T+Regulatory+Cells'+Multiple+Identities+in+Neuroimmunity.">One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).</li><li>Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+multiple+sclerosis--potentials+and+limitations.">Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations.</a> Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).</li><li>Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+in+Mice.">Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).</li><li>Topping, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+antigen-emulsion+preparations+for+the+induction+of+autoimmune+disease+models.">Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models.</a> Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).</li><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+vortex+method+for+preparing+antigen/adjuvant+emulsions+for+immunization.">A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).</li><li>M&#228;&#228;tt&#228;, J. A., Er&#228;linna, J. P., R&#246;ytt&#228;, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+state+of+the+neuroantigen+in+adjuvant+emulsions+determines+encephalitogenic+status+in+the+BALB/c+mouse.">Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).</li><li>Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+the+preparation+of+antigen+emulsions+for+immunization.">Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).</li><li>Waksman, B. H., Adams, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergic+neuritis:+an+experimental+disease+of+rabbits+induced+by+the+injection+of+peripheral+nervous+tissue+and+adjuvants.">Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants.</a> The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).</li><li>Vladutiu, A. O., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+murine+thyroiditis+relation+to+histocompatibility+(H-2)+type.">Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type.</a> Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).</li><li>Caspi, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+the+rat+and+mouse.">Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Tuzun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+standard+preclinical+experiments+in+the+mouse+model+of+myasthenia+gravis+induced+by+acetylcholine+receptor+immunization.">Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization.</a> Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).</li><li>Brinckerhoff, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+modifications+inhibit+proteolytic+degradation+of+an+immunogenic+MART-1(27-35)+peptide:+implications+for+peptide+vaccines.">Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines.</a> International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).</li><li>Kool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells.">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).</li><li>Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+induction+of+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+C57BL/6+mice+for+the+longitudinal+study+of+pathology+and+repair.">Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair.</a> Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).</li><li>Freund, J., Lipton, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+allergic+encephalomyelitis+after+the+excision+of+the+injection+site+of+antigen-adjuvant+emulsion.">Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion.</a> The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).</li><li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li><li>Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+unresponsiveness+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+resistant+mouse+strains+by+adoptive+transfer+and+antigenic+challenge.">Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).</li><li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+clinical+trial+to+assess+the+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+vivax+CS+synthetic+vaccine.">Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine.</a> Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).</li><li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+association+factors+for+developing+effective+peptide-based+cancer+vaccines.">Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).</li><li>Neninger Vinageras, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+randomized+controlled+trial+of+an+epidermal+growth+factor+vaccine+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).</li></ol>

Vatten-i-olja-emulsioner, såsom antigen/Freunds adjuvans, har använts i mer än ett halvt sekel för att inducera EAE17. Det finns för närvarande ingen standardiserad metod för att framställa antigenemulsioner som är oberoende av mänsklig påverkan. Manuell blandning med sprutor är standard för de flesta laboratorier, men denna metod är tidskrävande, resulterar ofta i en överdriven förlust av material och kvaliteten skiljer sig beroende på forskaren som förbereder den.
<p class...

En nedbrytning av immunologisk tolerans kan resultera i generering av autoimmuna störningar, såsom multipel skleros (MS). Det uppskattas att 2,8 miljoner människor lever med MS över hela världen1. Även om den exakta orsaken till MS fortfarande är till stor del okänd, spelar dysreglering av autoreaktiva T- och B-celler, liksom defekter i Treg-funktionen, viktiga roller i patogenesen av sjukdomen 2,3.
Djurmodeller av autoimmuna sjukdomar är viktiga verktyg för att undersöka potentiella terapeutiska metoder. Den experimentella modellen för autoimmun encefalomyelit (EAE) har använts i nästan ett sekel av forskare som är intresserade av MS4. I tidiga experiment var förekomsten av sjukdomen relativt låg. Introduktionen av komplett Freunds adjuvans (CFA), innehållande Mycobacterium och kikhosttoxin, möjliggjorde konsekvent induktion av EAE i möss4. Viktigast av allt är att det är nödvändigt att blanda CFA med ett antigen i centrala nervsystemet (CNS) för att generera en homogen vatten-i-olja-emulsion för att inducera EAE. De vanligaste för närvarande tillgängliga EAE-modellerna är baserade på aktiv immunisering av möss med encefalitogena peptider. Mössens genetiska bakgrund spelar en viktig roll för sjukdomskänslighet, med myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG35-55) och myelinproteolipidprotein (PLP139-151) peptider som används för att inducera EAE i C57BL / 6J respektive SJL-möss5. Andra musstammar och CNS-härledda peptider kan dock också användas.
Kvaliteten på CFA/peptidemulsionen är en kritisk faktor som bestämmer sjukdomspenetransen i den aktiva immuniseringsmodellenEAE modell 6. En homogen vatten-i-olja-emulsion måste framställas genom att blanda de encefalitogena peptiderna upplösta i vattenhaltig buffert med CFA, annars kommer djur inte att utveckla sjukdomen. Många protokoll har publicerats om beredning av CFA/peptidemulsioner. Exempel inkluderar användning av en virvel7, ultraljudsbehandling8, sprutor och en trevägs T-kontakt9, eller en spruta endast5. Alla dessa metoder är dock svåra att standardisera och är ofta förknippade med långa och komplicerade protokoll.
Jämfört med alla ovanstående metoder erbjuder den enkla metoden som beskrivs här för emulsionsberedning fördelarna med att inte ha några person-till-person-skillnader och vara relativt snabb. Emulsionen genereras av en homogenisator som skakar reagenserna med en inställd hastighet, tid och temperatur, vilket säkerställer snabba och konsekventa resultat. Förutom att inducera sjukdom i EAE-modellen kan denna metod också användas för att studera andra autoimmuna sjukdomsmodeller såsom kollageninducerad artrit (CIA) och antigeninducerad artrit (AIA)6. Därför förväntas denna metod kunna användas för att konsekvent inducera sjukdom i andra djurmodeller som är beroende av vatten-i-olja-emulsioner med autoantigener, såsom experimentell autoimmun neurit (EAN)10, experimentell autoimmun tyreoidit (EAT)11, autoimmun uveit (EAU)12 och myasthenia gravis (MG)13. Denna metod inducerar också allmänna immunsvar som fördröjd överkänslighet (DTH) konsekvent6, och kan därför användas för att leverera cancer- och malariavacciner (se diskussion).
Således har en snabb (total beredningstid ~ 30 min), enkel (alla reagenser kan förberedas i förväg och lagras) och standardiserad (emulsionen uppnås med hjälp av en skakningshomogenisator) metod utvecklats och presenteras här. CFA/antigenemulsioner framställda med hjälp av detta protokoll inducerar konsekvent sjukdom i autoimmuna djurmodeller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>9166017V&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Injection syringe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z683531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 ml empty tubes with caps</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000944LYSK0A.0</td>
			<td>7 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10788561</td>
			<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bordetella pertussis toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2980</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersant, light mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emulsion kit</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>D34200.10 ea</td>
			<td>Containing a tube, cap, and plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#39;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F5506</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis, H37RA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF3114-33-8</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastersizer 2000&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Particle size analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minilys-Personal homogenizer</td>
			<td>Bertin-Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Shaking homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG 35-55 Peptide&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Innovagen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Montanide ISA 51 VG</td>
			<td>Seppic</td>
			<td>36362Z</td>
			<td>FDA-approved oil adjuvant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17124381</td>
			<td>Sterlie filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase-Constrast Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel Beads 3.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0445832</td>
			<td>Autoclave and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>648463</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid, simple, and standardized homogenization method to prepare antigen/adjuvant emulsions for inducing experimental autoimmune encephalomyelitis

Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) delar liknande immunologiska och kliniska egenskaper med multipel skleros (MS), och används därför i stor utsträckning som en modell för att identifiera nya läkemedelsmål för bättre patientbehandling. MS kännetecknas av flera olika sjukdomsförlopp: skovvis förlöpande MS (RRMS), primär progressiv MS (PPMS), sekundär progressiv MS (SPMS) och en sällsynt progressiv återfallande form av MS (PRMS). Även om djurmodeller inte exakt efterliknar alla dessa kontrasterande fenotyper av mänskliga sjukdomar, finns det EAE-modeller som återspeglar några av de olika kliniska manifestationerna av MS. Till exempel efterliknar myelinoligodendrocytglykoprotein (MOG) -inducerad EAE i C57BL / 6J-möss humant PPMS, medan myelinproteolipidprotein (PLP) -inducerad EAE i SJL / J-möss liknar RRMS. Andra autoantigener, såsom myelinbasiskt protein (MBP), och ett antal olika musstammar används också för att studera EAE. För att inducera sjukdom i dessa autoantigen-immunisering EAE-modeller framställs en vatten-i-olja-emulsion och injiceras subkutant. Majoriteten av EAE-modellerna kräver också en injektion av kikhosttoxin för att sjukdomen ska utvecklas. För konsekvent och reproducerbar EAE-induktion krävs ett detaljerat protokoll för att förbereda reagenserna för att producera antigen-/adjuvansemulsioner. Metoden som beskrivs här utnyttjar en standardiserad metod för att generera vatten-i-olja-emulsioner. Det är enkelt och snabbt och använder en skakande homogenisator istället för sprutor för att förbereda kvalitetskontrollerade emulsioner.

Det snabba, enkla och standardiserade protokollet för beredning av CFA/MOG-emulsioner visas i figur 1. Denna metod har nyligen beskrivits på annat håll6. CFA/MOG-emulsionerna kan också framställas med andra metoder, såsom den traditionella sprutmetoden eller genom virvel. Dessa metoder jämfördes här genom att bedöma kvaliteten på emulsionerna. Alla metoder producerade vatten-i-olja-emulsioner; Homogeniteten och kvaliteten på dessa emulsioner bedömdes geno...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.c

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

För att inducera experimentell autoimmun encefalomyelit, en djurmodell av multipel skleros, immuniseras möss med en vatten-i-olja-emulsion innehållande ett autoantigen och kompletterar Freunds adjuvans. Medan flera protokoll finns för beredning av dessa emulsioner, presenteras ett snabbt, enkelt och standardiserat homogeniseringsprotokoll för emulsionsberedning här.

En snabb, enkel och standardiserad homogeniseringsmetod för att framställa antigen/ adjuvansemulsioner för att inducera experimentell autoimmun encefalomyelit

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

Experimentell autoimmun encefalomyelit eller EAE är en djurmodell som används för att utveckla nya och förbättrade behandlingar för patienter med multipel skleros. Att inducera sjukdom i EAE kräver en perfekt olje- och vattenemulsion för att uppnå konsekventa resultat. Metoden för emulsionsberedning som presenteras här är fri från mänskligt inflytande, vilket begränsar inkonsekvenser från ett experiment till ett annat.Även om metoden har optimerats för EAE kan den också användas för andra autoimmuna sjukdomsmodeller och även för att testa cancervacciner. För att förbereda CFA-uppslamningen vid 100 milligram frystorkad M-tuberkulos H37 RA och fem, 3,2 millimeter stålpärlor till ett sju milliliter rör. Skaka röret i homogenisatorn i 60 sekunder med högsta hastighetsinställning.Tillsätt fem milliliter IFA-adjuvans i röret och skaka igen i 60 sekunder med högsta hastighet. Överför sedan uppslamningen till ett nytt rör med en pipett som lämnar pärlorna bakom och förvara vid fyra grader Celsius tills den används. För att förbereda en CFA / peptidemulsion, ladda ner kompletterande fil ett för att beräkna den mängd som behövs för varje reagens.Placera sedan skruvlocket och reagenserna som ska användas på is. Lägg sedan till emulsionskomponenterna. Först PBS, sedan peptiden, CFA-uppslamningen.Och slutligen, IFA. Stäng röret med locket ordentligt genom att dra åt och lossa det flera gånger. Skaka röret kraftigt i 5 till 10 sekunder för hand för att blanda reagenserna.Placera röret i skakningshomogenisatorn och säkra det med stången. Ställ in hastigheten till den högsta inställningen och tiden till 60 sekunder. När körningen är klar, placera röret på is i tre minuter och upprepa körningen en eller två gånger till med samma inställningar.Centrifugera röret vid 300 G från en minut för att avlägsna instängd luft och komprimera emulsionen. Ta bort locket från röret. Sätt in kolven i röret och tryck ner den långsamt tills den når toppen av emulsionen.Ta bort snäppet av höljet längst ner på röret genom att vrida det. Ta sedan bort kolven från alla injektionssprutor och tillsätt en nål till injektionssprutorna. Fäst sedan baksidan av injektionssprutan på det dedikerade låset längst ner på röret och lås det med en kort vridning.Överför emulsionen från röret till injektionssprutan genom att trycka försiktigt på kolven. Sluta när emulsionen når 0,15 ml gradering av injektionssprutan. Separera injektionssprutan från röret och sätt in kolven försiktigt och se till att ingen luft kommer in i sprutan.Tryck på kolven tills emulsionen kommer ut ur nålen och upprepa processen för resten av emulsionen som finns i röret. För att analysera storleken på vattnet och oljepartiklarna lägg till en liten droppe av emulsionen till ett mikroskopglas, smörj ut det med en täckglidning och tryck sedan hårt i en cirkulär rörelse för att platta ut emulsionen. Undersök den utsmyckade emulsionen under ett faskontrastmikroskop med 400 gånger förstoring och fokusera på ett fält med ett monolager av emulsionen.Se till att små, enhetliga, grå eller vita partiklar är synliga. Emulsioner framställda med homogeniseringsmetoden visade grå eller vita bönformade partiklar som representerar små droppar vatten och oljemulsioner. Däremot var emulsionsdropparna som producerades med sprutmetoden större och bredare.I virvelmetoden observerades stora grå eller svarta partiklar motsvarande luftbubblor fångade i emulsionen. Förändringar i partikelstorleksfördelning över tid mätt med hjälp av en laserdefraktionspartikelstorleksanalysator för vatten- och oljeemulsioner visade ingen förändring i partikelstorlek under en period av sex veckor. De färska 3 veckor gamla och 15 veckor gamla emulsionerna inducerade alla liknande EAE-sjukdomar hos alla djur som testades under hela experimentet.Möss utvecklade ett liknande sjukdomsmönster i alla experiment som avslöjade att homogeniseringsmetoden som presenteras här producerade emulsioner som inducerade EAE på ett konsekvent och reproducerbart sätt. Innan du gör emulsionen för ett experiment, ladda ner kompletterande fil nummer ett för att beräkna mängden av varje komponent som behövs för att minimera avfallet. Metoden som presenteras här kan användas för att standardisera emulsionspreparat inte bara för preklinisk forskning utan också i framtiden för att förbereda cancervacciner i kliniken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Beredning av Mouse Hypofys Immunogen för induktion av Experimentell Autoimmun Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Induktion av Experimentell Autoimmun Hypophysitis i SJL Möss

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Övervinna svarsbenägenhet i experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) Resistenta musstammar genom adoptiv överföring och Antigen Challenge

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE in C57BL/6 Mice

Myelin Oligodendrocyte glykoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Inducerad Experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) hos C57BL / 6 möss

Multiple sclerosis is a chronic neuroinflammatory demyelinating disorder of the central nervous system with a strong neurodegenerative component. While ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Induktion av experimentell autoimmun encefalomyelit hos möss och utvärdering av sjukdomen beroende Distribution av immunceller i olika vävnader

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

En enkel Flödescytometriska metod för att mäta glukosupptag och glukostransportör uttryck för monocyt Subpopulationer i helblod

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Enkel och effektiv produktion och rening av mus Myelin Oligodendrocyte Glykoprotein för experimentell autoimmun encefalomyelit Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Visualisera nedsättning av Endothelial och gliaceller hinder av neurovaskulära enheten under Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flöde Cytometric Analys av lymfocyt infiltration i centrala nervsystemet under experimentell autoimmun encefalomyelit

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...