Name: quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

يشكر المؤلفون الدكتور حق محمد أمينول على مساعدته في مراجعة المخطوطة.

أجريت هذه الدراسة وفقا لإعلان هلسنكي وتمت الموافقة عليها من قبل مجالس المراجعة المؤسسية لجامعة أيشي الطبية (2017-H341 ، 2019-H137). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مشارك.
1. إعداد الكاشف
ملاحظة: لإجراء فحص شطيرة ELISA ، يتم تحضير الكواشف كما هو موضح أدناه.</...

<ol>
	<li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro.">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).</li><li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes.">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li><li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes:+Friend+or+foe.">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li><li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases.">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li><li>S&#248;rensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients.">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., K&#252;hn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis.">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li><li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps.">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology &amp; Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).</li><li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients.">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).</li><li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+extracellular+trap+(NET)+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB.">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587 (2017).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils.">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li><li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps.">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424 (2020).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19.">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).</li><li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+patients:+A+case+series+and+review+of+the+literature.">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li><li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis.">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).</li><li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis.">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li></ol>

لقد وصفنا طريقة شطيرة ELISA التي يرتبط فيها MPO أو NE بموقع واحد من الجسم المضاد الذي تم التقاطه أثناء الحضانة الأولية للعينات التي تحتوي على مجمعات MPO-DNA أو NE-DNA. بعد الغسيل ، يتم الانتهاء من "الساندويتش" عن طريق احتضان العينات بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للحمض النووي مرتبط بالبيروكسيداز. بعد إز...

توضح هذه المقالة طريقة لتحديد تكوين مصيدة العدلات خارج الخلية (NET) في السوائل البيولوجية باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم الساندويتش (ELISA) للكشف عن معقدات الميلوبيروكسيديز (MPO) وإيلاستاز العدلات (NE) مع الحمض النووي1،2. تتكون الشبكات من العمود الفقري للحمض النووي المزين بالبروتياز المضاد للميكروبات الناشئة من حبيبات العدلات 3,4. تعد كل من معقدات MPO-DNA و NE-DNA مكونات مهمة ومحددة للشبكات ويتم إطلاقها في الفضاء خارج الخلية كمنتجات انهيار ل NETs 3,4.
إلى جانب دورها الفسيولوجي الهام في الدفاع المضاد للميكروبات3 ، فإن الشبكات لها أيضا تأثيرات مرضية مختلفة 4,5 ، بما في ذلك تعزيز تكوين الخثار6 وتفاقم الإنتان7. وبناء على ذلك، حظيت الشبكات بالاهتمام في الآونة الأخيرة. ومع ذلك، فقد ثبت أن القياس الكمي للشبكات في الجسم الحي يمثل تحديا بسبب عدم وجود طريقة اختبار كمية حساسة وموثوقة.
تتوفر بعض الطرق ، بما في ذلك القياس المباشر للشبكات بواسطة المجهر الفلوري 8,9 وقياس التدفق الخلوي 10 والقياس غير المباشر للحمض النووي الخالي من الخلايا ، والنيوكليوسومات ، وهيستون سيترولين H3 ، ولكن كل طريقة لها مزاياها وقيودهاالخاصة 11. على الرغم من أن الطريقة المجهرية المناعية خاصة بالشبكات وتظهر بوضوح توطين ودرجة تكوين NET ، إلا أن العينات تقتصر على أنسجة الخزعة والمواد المفرزة. علاوة على ذلك ، يجب أن يتم تنفيذ هذه الطريقة من قبل باحثين مهرة وتتطلب وقتا طويلا للحصول على النتائج. يعد قياس المستويات المتداولة للمكونات المرتبطة بالشبكة عن طريق قياس التدفق الخلوي أمرا سهلا ويوفر نتائج سريعة ؛ ومع ذلك ، فإن الطريقة ليست خاصة بالشبكات12.
لقد طورنانحن 13 وآخرون 1,2 مقايسة حساسة للغاية وموثوقة لقياس مكونات NET المتداولة ، الحمض النووي المترافق MPO أو NE المترافق ، في البلازما البشرية باستخدام تقنية ELISA المعدلة التي تستخدم أجساما مضادة محددة ل MPO أو NE كأجسام مضادة للالتقاط وجسم مضاد للكشف عن الحمض النووي. يمكن أيضا استخدام هذا الاختبار خارج الجسم الحي لتحديد مكونات NET في طافات زراعة الخلايا التي تطلقها العدلات المنشطة استجابة لتحفيز phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Polymorphs</td>
			<td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td>
			<td>AN221725</td>
			<td>Isolation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>467466</td>
			<td>flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 530 001</td>
			<td>Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 521 001&#160;</td>
			<td>Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plastic cover, Axygen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14222348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>&#160;07-496-I</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NE antibody, clone AHN-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>MABS461</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biomedical Science</td>
			<td>BR-220700081</td>
			<td>Albumin from bovine fraction V. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 2 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303M</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG, rabbit, Isotype Control</td>
			<td>GENETEX, Inc.</td>
			<td>GTX35035</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>MABC002</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate mixer</td>
			<td>As one corporation</td>
			<td>NS-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax 190&#160;</td>
			<td>Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405&#8211;490 nm can use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader application</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SoftMax pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>1154467500</td>
			<td>&#160;bottle 2. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 1 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Activation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T9181</td>
			<td>Store at room temperature. Stable for 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot v14.5</td>
			<td>&#160;Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>190-14901</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa

تتسبب بعض المحفزات ، مثل الكائنات الحية الدقيقة ، في إطلاق العدلات لمصائد العدلات خارج الخلية (NETs) ، وهي في الأساس هياكل تشبه الويب تتكون من الحمض النووي مع البروتينات الحبيبية ، مثل الميلوبيروكسيديز (MPO) وإيلاستاز العدلات (NE) ، والبروتينات السيتوبلازمية والهيكلية الخلوية. على الرغم من أن الاهتمام بالشبكات قد زاد مؤخرا ، إلا أنه لا توجد طريقة فحص حساسة وموثوقة متاحة لقياس الشبكات في البيئات السريرية. تصف هذه المقالة مقايسة ممتز مناعي معدل مرتبط بالإنزيم لقياس مكونين من مكونات الشبكات المنتشرة كميا ، مجمعات MPO-DNA و NE-DNA ، وهي مكونات محددة من NETs ويتم إطلاقها في الفضاء خارج الخلية كمنتجات انهيار NETs. يستخدم الفحص أجساما مضادة وحيدة النسيلة محددة ل MPO أو NE كأجسام مضادة للالتقاط وجسم مضاد للكشف عن الحمض النووي. يرتبط MPO أو NE بموقع واحد من الجسم المضاد الذي يتم التقاطه أثناء الحضانة الأولية للعينات التي تحتوي على مجمعات MPO-DNA أو NE-DNA. يظهر هذا الفحص خطيا جيدا ودقة عالية بين المقايسة وداخل المقايسة. استخدمناه في 16 مريضا مصابا ب COVID-19 يعانون من متلازمة الضائقة التنفسية الحادة المصاحبة ووجدنا أن تركيزات البلازما من MPO-DNA و NE-DNA كانت أعلى بكثير من البلازما التي تم الحصول عليها من الضوابط الصحية. يعد اختبار الكشف هذا طريقة موثوقة وحساسة للغاية ومفيدة للتحقيق في خصائص الشبكات في البلازما البشرية وطافات الثقافة.

استخدمت هذه الطريقة شطيرة ELISA مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل MPO و anti-NE والمضادة للحمض النووي لقياس الحمض النووي المرتبط ب MPO والمرتبط ب NE (الشكل 1). في هذه الطريقة ، تم طلاء آبار صفيحة العيار الدقيق بجسم مضاد أحادي النسيلة خاص ب MPO أو خاص ب NE لالتقاط MPO المرتبط بالح?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

نقدم بروتوكولا لتقنية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم شطيرة معدلة لقياس مكونين من بقايا فخ العدلات خارج الخلية كميا ، وهما الحمض النووي المترافق للميلوبيروكسيديز ومجمعات الحمض النووي المترافق لإيلاستاز العدلات ، المشتقة من العدلات المنشطة.

القياس الكمي لمعقدات الميلوبيروكسيديز - الحمض النووي و Neutrophil Elastase-DNA من مصائد العدلات خارج الخلية باستخدام شطيرة ELISA المعدلة

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

وقد اجتذبت الشبكات اهتماما مؤخرا، ولكن ثبت أن تحديد كمية الشبكات في الجسم الحي يمثل تحديا. يوفر هذا البروتوكول طريقة مرغوبة وحساسة للغاية وقيمة للتحقيق في خصائص الشبكات في البيئات السريرية. يجب أن تمتد هذه التقنية لتقييم شدة الإنتان أو متلازمة الضائقة التنفسية الحادة ، متلازمة الضائقة التنفسية الحادة.من المقبول على نطاق واسع أن تنظيم المقالب أو الأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر هو مفتاح لتحسين الحالة السريرية للإنتان. تتضمن أكبر ميزة لهذه الطريقة القياس الكمي الدقيق للبقايا الصافية المتداولة مثل myeloperoxidase-DNA و edastrovail elastase-DNA في وقت قصير. ينصح بتدوير العينات قبل الفحص وتجنب الذوبان المتكرر.من المهم اتباع أوقات الحضانة كما هو موضح في البروتوكول. ابدأ بتخفيف العدلات متعددة الأشكال النووية المعزولة حديثا إلى 10،000 خلية لكل مليلتر في RPMI 1640 الخالي من الفينول الأحمر. غربالهم في أطباق ثقافة 35 ملم.للحث على مصائد العدلات خارج الخلية أو NETs ، قم أولا بتحفيز العدلات متعددة الأشكال النووية باستخدام 25 نانومولار PMA. ثم هضم جزئيا الفخاخ خارج الخلية عن طريق إضافة 0.6 ميكروغرام لكل ملليلتر من DNase I ، واحتضان الخليط لمدة 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الآن ، أضف خمسة ملليمولار EDTA لإيقاف نشاط DNase ، واجمع الوسط الذي يحتوي على الشبكات المركبة.أجهزة طرد مركزي لإزالة حطام الخلية. جمع المواد الطافية من أربعة ضوابط صحية. اخلطها وقم بتخزينها في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها مرة أخرى.ماصة 100 ميكرولتر من مضاد الميلوبيروكسيديز المخفف الذي يحتوي على 0.05 ميكروغرام من الجسم المضاد في لوحة ELISA. الآن ، قم بتغطية اللوحة بغطاء بلاستيكي لاصق لمنع تبخر العينة ، واحتضان العينة طوال الليل عند أربع درجات مئوية للسماح بربط الأجسام المضادة الملتقطة . في اليوم التالي ، تخلص من محلول الأجسام المضادة المخفف من الآبار ، وماصة 300 ميكرولتر من محلول الغسيل في كل بئر.اضغط على الطبق الجاف على منشفة ورقية لإزالة PBS الزائد. سد كل بئر من اللوحة مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر. قم بتغطيته بغطاء بلاستيكي لاصق ، وقم بإعاقة الآبار عن طريق احتضانه.بعد التخلص من محلول الحجب من الآبار وغسل اللوحة ثلاث إلى أربع مرات ، اضغط عليها جافة على منشفة ورقية. بعد ذلك ، ماصة 25 ميكرولتر من البلازما في جميع الآبار باستثناء الفراغ. وتخفيفه ب 75 ميكرولتر من PBS ، مما يجعل حجم البئر النهائي 100 ميكرولتر.ثم أضف 100 ميكرولتر من PBS إلى البئر الفارغة. امزج العينات عن طريق وضع اللوحة على شاكر لمدة 10 ثوان عند 250 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف ميكرولتر من 100 DNase I المخفف بالكامل إلى جميع الآبار ، وضع اللوحة المختومة على الخلاط لمدة 10 ثوان لخلط العينات جيدا.احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف ميكرولترا واحدا من 0.5 مولار EDTA إلى كل بئر لإيقاف تفاعل DNase. ثم ضع اللوحة المختومة على شاكر لمدة 15 ثانية لخلط العينات جيدا.أخيرا ، احتضان اللوحة طوال الليل عند أربع درجات مئوية للسماح لمكونات البروتين في الشبكات بالالتصاق بالأجسام المضادة الملتقطة . في اليوم التالي ، تخلص من المحلول من الآبار. بعد غسل الآبار عدة مرات ، ماصة 100 ميكرولتر من الجسم المضاد للكشف عن الحمض النووي المخفف المترافق بالبيروكسيديز في كل بئر.احتضان اللوحة لمدة 1 1/2 ساعة ، ثم تخلص من المحلول في الآبار. بعد غسل الآبار ثلاث مرات ، ماصة 100 ميكرولتر من محلول الركيزة ABTS في كل بئر ، واحتضان لوحة مختومة على شاكر في الظلام. أوقف التفاعل بإضافة 50 ميكرولترا من حمض الكبريتيك ثنائي الضرس.امزج محتويات البئر عن طريق النقر بعناية على جوانب اللوحة. بعد ذلك ، قم بتوصيل قارئ microplate بالكمبيوتر وابدأ تشغيل تطبيق البرنامج. من شريط الحالة، أنشئ تجربة جديدة وقم بتسميتها.ثم قم بتعيين معلمات قراءة اللوحة عن طريق تحديد Absorbance كنوع القراءة ، ونقطة النهاية كوضع القراءة ، واثنين كأطوال موجية. بعد ذلك ، اضبط لامدا واحد على أنه 405 نانومتر ، لامدا اثنان على أنه 490 نانومتر. الآن ، حدد حالة إيقاف التشغيل لكل من Automix و Blanking مع الاحتفاظ بالمعايرة التلقائية على أنها قيد التشغيل ، ثم حدد قراءة اللوحة بأكملها ضمن الشرائط.أخيرا ، قم بتعيين أولوية الطول الموجي للعمود مع عادي كسرعة النقل ، ثم حدد إيقاف ضمن القراءة التلقائية. ضع اللوحة جيدا في درج الأدوات وأغلقها. انقر فوق قراءة حتى تتم قراءة اللوحة على الفور.اقرأ امتصاص كل بئر عند 405 نانومتر ، وقم بإجراء الطرح التلقائي لامتصاص وسط الفحص من جميع العينات غير المعروفة. تم الحصول على منحنيات معايرة قياسية موثوقة لكل من MPO-DNA و NE-DNA عندما لم تتجاوز قيم الامتصاص 0.93 و 0.9 على التوالي. تم الحصول على أعلى OD عندما تم تطبيق 0.6 ميكروغرام لكل ملليلتر من DNase I.كانت معاملات التباين بين المقايسة للمجمعات في الضوابط الصحية 1.871 و 0.987 على التوالي ، بينما أظهر مرضى COVID-19 معاملات تقلب تبلغ 2.532 و 2.010 على التوالي. كان متوسط معاملات التباين بين المقايسة ل MPO-DNA و NE-DNA 6.524 و 4.389 على التوالي. أظهرت خصوصية الأجسام المضادة الملتقطة لمجمعات MPO-DNA و NE-DNA أن الأجسام المضادة للتحكم من نوع iso تفاعلت قليلا مع المجمعات.كانت النسبة المئوية لكلا المعقدين أعلى في البلازما من مرضى COVID-19 مقارنة بالضوابط الصحية. يجب تحسين وقت هضم إناز ، وإلا فإن الهضم المفرط سيقلل من الامتصاص.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

الفخاخ خارج الخلية العدلات : كيفية إنشاء وتصور لهم

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

المبسطة الإنسان الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) عزل والمناولة

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

طرق لدراسة الدهون التعديلات في العدلات وتشكيل لاحقة من الفخاخ خارج الخلية العدلات

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

والإسفار الفحص بسيطة لالكمي من الكلاب خارج الخلية العدلات فخ الإصدار

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

التلقائي القائم علي الصورة الكمية من الفخاخ العدلات خارج الخلية باستخدام NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

مقايسة الفائق تقييم وتقدير حجم تشكيل العَدلات فخ خارج الخلية

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

تحديد الفخاخ نيوتروفيل خارج الخلية في البارافين جزءا لا يتجزأ من الخيط الشرياني Thrombi باستخدام المجهر Immunofluorescence

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

التحليل المورفولوجي والتركيبي لمصائد العدلات خارج الخلية التي تسببها المحفزات الميكروبية والكيميائية

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

التصوير المناعي لمصائد العدلات خارج الخلية في الأنسجة البشرية والفأر

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...