Name: quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Huq Muhammad Aminul for at have hjulpet med at gennemgå manuskriptet.

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med Helsingforserklæringen og blev godkendt af de institutionelle bedømmelsesudvalg ved Aichi Medical University (2017-H341, 2019-H137). Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra hver deltager.
1. Fremstilling af reagens
BEMÆRK: For at udføre sandwich-ELISA-analysen fremstilles reagenserne som beskrevet nedenfor.
<ol><li>Belægning buffer:<ol><li>For at lave en 0,1 mol / L carbona...

<ol>
	<li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro.">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).</li><li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes.">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li><li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes:+Friend+or+foe.">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li><li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases.">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li><li>S&#248;rensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients.">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., K&#252;hn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis.">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li><li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps.">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology &amp; Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).</li><li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients.">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).</li><li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+extracellular+trap+(NET)+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB.">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587 (2017).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils.">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li><li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps.">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424 (2020).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19.">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).</li><li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+patients:+A+case+series+and+review+of+the+literature.">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li><li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis.">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).</li><li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis.">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li></ol>

Vi har beskrevet en sandwich ELISA-metode, hvor MPO eller NE binder til et sted af indfangningsantistoffet under den indledende inkubation af prøver indeholdende MPO-DNA eller NE-DNA-komplekser. Efter vask afsluttes "sandwich" ved at inkubere prøverne med et peroxidaseassocieret anti-DNA monoklonalt antistof. Efter fjernelse af ubundet sekundært antistof påvises det bundne peroxidasekonjugat ved tilsætning af et kromogent ABTS-peroxidasesubstrat, som giver et opløseligt slutprodukt, der kan aflæses spectrophotomet...

Denne artikel skitserer en metode til kvantificering af dannelse af neutrofil ekstracellulær fælde (NET) i biologiske væsker ved anvendelse af sandwichenzymbundet immunosorbentassay (ELISA) til påvisning af komplekser af myeloperoxidase (MPO) og neutrofilelastase (NE) med DNA 1,2. NETs består af en DNA-rygrad dekoreret med antimikrobielle proteaser, der stammer fra neutrofilgranulat 3,4. Både MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser er vigtige og specifikke komponenter i NETs og frigives i det ekstracellulære rum som nedbrydningsprodukter af NETs 3,4.
Udover deres vigtige fysiologiske rolle i antimikrobielt forsvar3 har NET'er også forskellige patologiske virkninger4,5, herunder fremme af trombogenese6 og forværring af sepsis7. Derfor har NETs fået opmærksomhed for nylig. Ikke desto mindre har in vivo-kvantificeringen af NETs vist sig at være en udfordring på grund af manglen på en følsom, pålidelig kvantitativ analysemetode.
Nogle få metoder er tilgængelige, herunder direkte måling af NET'er ved fluorescensmikroskopi8,9 og flowcytometri 10 og indirekte måling af cirkulerende cellefrit DNA, nukleosomer og citrullineret histon H3, men hver metode har sine egne fordele og begrænsninger11. Selvom den immunofluorescensmikroskopiske metode er specifik for NET'er og tydeligt viser lokalisering og grad af NET-dannelse, er prøver begrænset til biopsivæv og udskillede materialer. Desuden skal denne metode udføres af dygtige forskere og kræver lang tid for at opnå resultater. Måling af cirkulerende niveauer af NET-relaterede komponenter ved flowcytometri er let og giver resultater hurtigt; Metoden er imidlertid ikke specifik for NETs12.
Vi13 og andre1,2 har udviklet et meget følsomt og pålideligt assay til måling af de cirkulerende NET-komponenter, MPO-konjugeret eller NE-konjugeret DNA, i humant plasma med en modificeret ELISA-teknik, der bruger specifikke antistoffer til MPO eller NE som indfangningsantistoffer og et DNA-specifikt detektionsantistof. Dette assay kan også anvendes ex vivo til at identificere NET-komponenter i cellekultursupernatanter frigivet af aktiverede neutrofiler som reaktion på phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) stimulering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Polymorphs</td>
			<td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td>
			<td>AN221725</td>
			<td>Isolation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>467466</td>
			<td>flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 530 001</td>
			<td>Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 521 001&#160;</td>
			<td>Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plastic cover, Axygen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14222348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>&#160;07-496-I</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NE antibody, clone AHN-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>MABS461</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biomedical Science</td>
			<td>BR-220700081</td>
			<td>Albumin from bovine fraction V. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 2 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303M</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG, rabbit, Isotype Control</td>
			<td>GENETEX, Inc.</td>
			<td>GTX35035</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>MABC002</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate mixer</td>
			<td>As one corporation</td>
			<td>NS-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax 190&#160;</td>
			<td>Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405&#8211;490 nm can use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader application</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SoftMax pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>1154467500</td>
			<td>&#160;bottle 2. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 1 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Activation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T9181</td>
			<td>Store at room temperature. Stable for 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot v14.5</td>
			<td>&#160;Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>190-14901</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa

Visse stimuli, såsom mikroorganismer, får neutrofiler til at frigive neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er), som grundlæggende er weblignende strukturer sammensat af DNA med granulatproteiner, såsom myeloperoxidase (MPO) og neutrofil elastase (NE) og cytoplasmatiske og cytoskeletale proteiner. Selvom interessen for NETs er steget for nylig, findes der ingen følsom, pålidelig analysemetode til måling af NETs i kliniske omgivelser. Denne artikel beskriver et modificeret sandwichenzymbundet immunosorbentassay til kvantitativt at måle to komponenter i cirkulerende NET'er, MPO-DNA og NE-DNA-komplekser, som er specifikke komponenter i NET'er og frigives i det ekstracellulære rum som nedbrydningsprodukter af NET'er. Assayet bruger specifikke monoklonale antistoffer til MPO eller NE som indfangningsantistoffer og et DNA-specifikt detektionsantistof. MPO eller NE binder sig til et sted af indfangningsantistoffet under den indledende inkubation af prøver indeholdende MPO-DNA- eller NE-DNA-komplekser. Dette assay viser god linearitet og høj inter-assay og intra-assay præcision. Vi brugte det hos 16 patienter med COVID-19 med ledsagende akut respiratorisk distress syndrom og fandt ud af, at plasmakoncentrationerne af MPO-DNA og NE-DNA var signifikant højere end i plasma opnået fra raske kontroller. Denne detektionsanalyse er en pålidelig, meget følsom og nyttig metode til undersøgelse af NETs karakteristika i humane plasma- og kultursupernatanter.

Denne metode anvendte en sandwich ELISA med anti-MPO, anti-NE og anti-DNA monoklonale antistoffer til måling af MPO-associeret og NE-associeret DNA (figur 1). I denne metode blev brøndene i en mikrotiterplade belagt med et MPO-specifikt eller NE-specifikt monoklonalt antistof for at fange DNA-associeret MPO og DNA-associeret NE såvel som ikke-DNA-associeret MPO og NE. For at beregne intra-assay-variabilitetskoefficienten (CV) blev der udført dobbeltmålinger inden for samme plade for 30 ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Vi præsenterer en protokol for en modificeret sandwichenzymbundet immunosorbentassayteknik til kvantitativt at måle to komponenter af neutrofile ekstracellulære fælderester, myeloperoxidasekonjugeret DNA og neutrofilelastasekonjugerede DNA-komplekser, afledt af aktiverede neutrofiler.

Kvantificering af myeloperoxidase-DNA og neutrofile elastase-DNA-komplekser fra neutrofile ekstracellulære fælder ved hjælp af en modificeret sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

NETs har tiltrukket sig opmærksomhed på det seneste, men kvantificering af NETs in vivo har vist sig at være udfordrende. Denne protokol giver en ønskelig, meget følsom og værdifuld metode til at undersøge egenskaberne ved NETs i kliniske omgivelser. Denne teknik bør udvides til at evaluere sværhedsgraden af sepsis eller septisk ARDS, akut respiratorisk distress syndrom.Det er almindeligt accepteret, at regulering af dumper eller skadeassocierede molekylære mønstre er en nøgle til forbedring af den kliniske tilstand af sepsis. Den største fordel ved denne metode inkluderer den nøjagtige kvantificering af cirkulerende NET-rester som myeloperoxidase-DNA og neutrofil-elastase-DNA på kort tid. Det anbefales at dreje prøverne før analyse og undgå gentagen optøning.Det er vigtigt at følge inkubationstiderne som angivet i protokollen. Begynd med at fortynde frisk isolerede polymorfonukleære neutrofiler til 10.000 celler pr. Milliliter i phenol rødfri RPMI 1640. Sigt dem i 35 millimeter kulturretter.For at inducere neutrofile ekstracellulære fælder eller NET'er stimulerer først de polymorfonukleære neutrofiler med 25 nanomolære PMA. Derefter fordøjes de ekstracellulære fælder delvist ved at tilsætte 0,6 mikrogram pr. Milliliter DNase I, og inkubere blandingen i 50 minutter ved stuetemperatur. Tilføj nu fem millimolær EDTA for at stoppe DNase-aktiviteten, og saml mediet, der indeholder de syntetiserede NET'er.Centrifuger for at fjerne celleresterne. Supernatanterne samles fra fire sunde kontrolpersoner. Bland opbevar dem ved minus 80 grader Celsius til videre brug.Der pipetteres 100 mikroliter fortyndet anti-myeloperoxidase indeholdende 0,05 mikrogram antistof i en ELISA-plade. Dæk nu pladen med et klæbende plastdæksel for at forhindre fordampning af prøven, og inkuber prøven natten over ved fire grader Celsius for at tillade binding af indfangningsantistofferne. Den næste dag kasseres den fortyndede antistofopløsning fra brøndene, og pipette 300 mikroliter vaskeopløsning i hver brønd.Bank pladen tør på et køkkenrulle for at fjerne overskydende PBS. Bloker hver brønd på pladen med 200 mikroliter blokerende buffer. Dæk det med et klæbende plastdæksel, og obstruer brøndene ved at inkubere det.Når du har kasseret blokeringsopløsningen fra brøndene og vasket pladen tre til fire gange, skal du banke den tør på et papirhåndklæde. Derefter pipetteres 25 mikroliter plasma i alle brønde undtagen emnet. Og fortynd det med 75 mikroliter PBS, hvilket gør det endelige brøndvolumen 100 mikroliter.Derefter tilsættes 100 mikroliter PBS til den tomme brønd. Bland prøverne ved at placere pladen på en ryster i 10 sekunder ved 250 o/min ved stuetemperatur. Tilsæt to mikroliter 100 fuldt fortyndet DNase I til alle huller, og læg den forseglede plade på rysteren i 10 sekunder for at blande prøverne grundigt.Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur. Tilsæt en mikroliter 0,5 molær EDTA til hver brønd for at stoppe DNase-reaktionen. Anbring derefter den forseglede plade på rysteren i 15 sekunder for at blande prøverne grundigt.Til sidst inkuberes pladen natten over ved fire grader Celsius for at tillade proteinkomponenterne i NET'erne at binde sig til indfangningsantistofferne. Den næste dag kasseres opløsningen fra brøndene. Efter flere brøndskyl pipetteres 100 mikroliter af det fortyndede peroxidasekonjugerede anti-DNA-detektionsantistof i hvert hul.Inkuber pladen i 1 1/2 time, og kassér derefter opløsningen i brøndene. Efter vask af brøndene tre gange, pipette 100 mikroliter ABTS-substratopløsning i hvert hul og inkubere den forseglede plade på en ryster i mørket. Stop reaktionen ved at tilsætte 50 mikroliter to-molær svovlsyre.Bland brøndindholdet ved forsigtigt at banke på pladens sider. Tilslut derefter mikropladelæseren til computeren og start softwareapplikationen. Opret et nyt eksperiment på statuslinjen, og navngiv det.Indstil derefter pladeaflæsningsparametrene ved at vælge Absorbans som læsetype, Slutpunkt som læsetilstand og to som bølgelængder. Indstil derefter lambda en som 405 nanometer, lambda to som 490 nanometer. Vælg nu Fra-status for både Automix og Blanking, mens du beholder Autokalibrering som Til.Vælg derefter Læs hele pladen under Strimler.Til sidst skal du indstille kolonnebølgelængdeprioriteten med Normal som Vognhastighed og derefter vælge Fra under Autolæsning. Placer pladen godt i instrumentskuffen, og luk den. Klik på Læs, så pladen læses med det samme.Absorbansen af hvert hul aflæses ved 405 nanometer, og der udføres automatisk subtraktion af assaymediets absorbans fra alle ukendte prøver. Der blev opnået pålidelige standardkalibreringskurver for både MPO-DNA og NE-DNA, når absorbansværdierne ikke oversteg henholdsvis 0,93 og 0,9. Den højeste OD blev opnået, når 0,6 mikrogram pr. milliliter DNase I blev påført.Inter-assayvariabilitetskoefficienterne for komplekserne i raske kontroller var henholdsvis 1.871 og 0.987, mens COVID-19-patienterne viste variabilitetskoefficienter på henholdsvis 2.532 og 2.010. De gennemsnitlige inter-assayvariabilitetskoefficienter for MPO-DNA og NE-DNA var henholdsvis 6,524 og 4,389. Indfangningsantistoffernes specificitet over for MPO-DNA- og NE-DNA-komplekserne viste, at iso-type kontrolantistofferne reagerede lidt på komplekserne.Procentdelen af begge komplekser var højere i plasmaet fra patienter med COVID-19 i forhold til de raske kontroller. DNase-fordøjelsestiden bør optimeres, ellers vil overdreven fordøjelse reducere absorbansen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Forenklet human neutrofil Ekstracellulære Fælder (NET) Isolering og Håndtering

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder til at studere Lipidforandringer i neutrofiler og den efterfølgende dannelse af neutrofile ekstracellulær fælder

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

A Simple Fluorescens Assay for Kvantificering af Canine Neutrofil Ekstracellulær Trap Frigivelse

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatiseret billedbaseret kvantificering af neutrofile ekstracellulære fælder med NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

En høj overførselshastighed analyse til at vurdere og kvantificere neutrofile ekstracellulære fælde dannelse

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identifikation af neutrofile ekstracellulære fælder i paraffin-embedded feline arteriel trombose ved hjælp af Immunofluorescence Mikroskopi

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Morfologisk og sammensætningsanalyse af neutrofile ekstracellulære fælder induceret af mikrobielle og kemiske stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Immunofluorescensbilleddannelse af neutrofile ekstracellulære fælder i væv fra mennesker og mus

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...