Name: quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Les auteurs remercient le Dr Huq Muhammad Aminul pour leur aide dans la révision du manuscrit.

Cette étude a été menée conformément à la Déclaration d’Helsinki et a été approuvée par les comités d’examen institutionnels de l’Université de médecine d’Aichi (2017-H341, 2019-H137). Le consentement éclairé écrit de chaque participant a été obtenu.
1. Préparation des réactifs
REMARQUE : Pour effectuer le test ELISA sandwich, les réactifs sont préparés comme décrit ci-dessous.
<ol><li>Tampon de revêtement :<ol><...

<ol>
	<li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro.">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).</li><li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes.">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li><li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes:+Friend+or+foe.">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li><li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases.">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li><li>S&#248;rensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients.">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., K&#252;hn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis.">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li><li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps.">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology &amp; Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).</li><li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients.">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).</li><li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+extracellular+trap+(NET)+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB.">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587 (2017).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils.">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li><li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps.">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424 (2020).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19.">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).</li><li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+patients:+A+case+series+and+review+of+the+literature.">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li><li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis.">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).</li><li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis.">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li></ol>

Nous avons décrit une méthode ELISA sandwich dans laquelle MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Après le lavage, le « sandwich » est complété par l’incubation des échantillons avec un anticorps monoclonal anti-ADN associé à la peroxydase. Après l’élimination de l’anticorps secondaire non lié, le conjugué peroxydase lié est détecté par l’ajout d’un substrat chromogène ABTS peroxydase,...

Cet article décrit une méthode permettant de quantifier la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (NET) dans les fluides biologiques en utilisant le test immuno-enzymatique sandwich (ELISA) pour détecter les complexes de myéloperoxydase (MPO) et d’élastase neutrophile (NE) avec l’ADN 1,2. Les TNE sont composées d’un squelette d’ADN décoré de protéases antimicrobiennes provenant de granules de neutrophiles 3,4. Les complexes MPO-ADN et ADN-E sont tous deux des composants importants et spécifiques des TNE et sont libérés dans l’espace extracellulaire en tant que produits de dégradation des TNE 3,4.
Outre leur rôle physiologique important dans la défense antimicrobienne3, les TNE ont également divers effets pathologiques4,5, notamment la promotion de la thrombogenèse6 et l’aggravation de la septicémie7. Par conséquent, les TNE ont récemment attiré l’attention. Néanmoins, la quantification in vivo des TNE s’est avérée difficile en raison de l’absence d’une méthode de dosage quantitative sensible et fiable.
Quelques méthodes sont disponibles, notamment la mesure directe des TNE par microscopie à fluorescence8,9 et cytométrie en flux 10 et la mesure indirecte de l’ADN acellulaire circulant, des nucléosomes et de l’histone H3 citrulliée, mais chaque méthode a ses propres avantages et limites11. Bien que la méthode microscopique d’immunofluorescence soit spécifique aux TNE et montre clairement la localisation et le degré de formation des TNE, les échantillons sont limités aux tissus de biopsie et aux matériaux sécrétés. De plus, cette méthode doit être réalisée par des chercheurs qualifiés et nécessite beaucoup de temps pour obtenir des résultats. La mesure des niveaux circulants de composants liés aux TNE par cytométrie en flux est facile et fournit des résultats rapidement ; cependant, la méthode n’est pas spécifique aux TNE12.
Nous13 et al. 1,2 avons mis au point un test très sensible et fiable pour mesurer les composants TNE circulants, l’ADN conjugué MPO ou l’ADN conjugué NE, dans le plasma humain avec une technique ELISA modifiée qui utilise des anticorps spécifiques pour MPO ou NE comme anticorps de capture et un anticorps de détection spécifique à l’ADN. Ce test peut également être utilisé ex vivo pour identifier les composants TNE dans les surnageants de culture cellulaire libérés par les neutrophiles activés en réponse à la stimulation du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Polymorphs</td>
			<td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td>
			<td>AN221725</td>
			<td>Isolation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>467466</td>
			<td>flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 530 001</td>
			<td>Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 521 001&#160;</td>
			<td>Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plastic cover, Axygen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14222348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>&#160;07-496-I</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NE antibody, clone AHN-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>MABS461</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biomedical Science</td>
			<td>BR-220700081</td>
			<td>Albumin from bovine fraction V. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 2 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303M</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG, rabbit, Isotype Control</td>
			<td>GENETEX, Inc.</td>
			<td>GTX35035</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>MABC002</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate mixer</td>
			<td>As one corporation</td>
			<td>NS-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax 190&#160;</td>
			<td>Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405&#8211;490 nm can use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader application</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SoftMax pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>1154467500</td>
			<td>&#160;bottle 2. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 1 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Activation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T9181</td>
			<td>Store at room temperature. Stable for 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot v14.5</td>
			<td>&#160;Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>190-14901</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa

Certains stimuli, tels que les micro-organismes, amènent les neutrophiles à libérer des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), qui sont essentiellement des structures en forme de toile composées d’ADN avec des protéines granulaires, telles que la myéloperoxydase (MPO) et l’élastase neutrophile (NE), et des protéines cytoplasmiques et cytosquelettiques. Bien que l’intérêt pour les TNE ait augmenté récemment, il n’existe pas de méthode de dosage sensible et fiable pour mesurer les TNE en milieu clinique. Cet article décrit un test immuno-enzymatique sandwich modifié pour mesurer quantitativement deux composants des TNE circulantes, l’ADN-MPO et les complexes ADN-NE, qui sont des composants spécifiques des TNE et qui sont libérés dans l’espace extracellulaire en tant que produits de dégradation des TNE. Le test utilise des anticorps monoclonaux spécifiques pour MPO ou NE comme anticorps de capture et un anticorps de détection spécifique de l’ADN. MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Ce test montre une bonne linéarité et une grande précision inter-essais et intra-essais. Nous l’avons utilisé chez 16 patients atteints de COVID-19 avec le syndrome de détresse respiratoire aiguë qui l’accompagne et avons constaté que les concentrations plasmatiques de MPO-ADN et d’ADN-NE étaient significativement plus élevées que dans le plasma obtenu à partir de témoins sains. Ce test de détection est une méthode fiable, très sensible et utile pour étudier les caractéristiques des TNE dans le plasma humain et les surnageants en culture.

Cette méthode a utilisé un test ELISA sandwich avec des anticorps monoclonaux anti-MPO, anti-NE et anti-ADN pour mesurer l’ADN associé au MPO et l’ADN associé à l’EN (Figure 1). Dans cette méthode, les puits d’une plaque de microtitration ont été recouverts d’un anticorps monoclonal spécifique ou spécifique de l’ON pour capturer le MPO associé à l’ADN et l’ON associé à l’ADN, ainsi que le MPO et l’EN non associés à l’ADN. Pour calculer le coefficient de ...

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Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Nous présentons un protocole pour une technique modifiée de dosage immuno-enzymatique sandwich permettant de mesurer quantitativement deux composants des restes de pièges extracellulaires neutrophiles, l’ADN conjugué myéloperoxydase et les complexes ADN conjugués à l’élastase neutrophile, dérivés de neutrophiles activés.

Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Les TNE ont récemment attiré l’attention, mais la quantification des TNE in vivo s’est avérée difficile. Ce protocole fournit une méthode souhaitable, très sensible et précieuse pour étudier les caractéristiques des TNE en milieu clinique. Cette technique devrait s’étendre à l’évaluation de la sévérité de la septicémie ou du SDRA septique, du syndrome de détresse respiratoire aiguë.Il est largement admis que la régulation des décharges ou des modèles moléculaires associés aux dommages est essentielle pour améliorer l’état clinique de la septicémie. Le plus grand avantage de cette méthode est la quantification précise des restes de TNE circulants tels que l’ADN myéloperoxydase et l’ADN élastase neutrophile en peu de temps. Il est conseillé de faire tourner les échantillons avant le dosage et d’éviter les décongélations répétées.Il est important de respecter les temps d’incubation indiqués dans le protocole. Commencez par diluer les neutrophiles polymorphonucléaires fraîchement isolés à 10 000 cellules par millilitre dans du RPMI 1640 sans rouge de phénol. Tamisez-les dans des boîtes de culture de 35 millimètres.Pour induire des pièges extracellulaires neutrophiles ou NET, stimulez d’abord les polynunucléaires neutrophiles avec 25 nanomolaires PMA. Ensuite, digérez partiellement les pièges extracellulaires en ajoutant 0,6 microgramme par millilitre de DNase I, et incubez le mélange pendant 50 minutes à température ambiante. Maintenant, ajoutez de l’EDTA de cinq millimolaires pour arrêter l’activité de la DNase et collectez le milieu contenant les TNE synthétisées.Centrifugeuse pour éliminer les débris cellulaires. Collectez les surnageants de quatre témoins sains. Mélangez-les à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure.Pipeter 100 microlitres d’anti-myéloperoxydase diluée contenant 0,05 microgramme de l’anticorps dans une plaque ELISA. Maintenant, couvrez la plaque avec un couvercle en plastique adhésif pour empêcher l’évaporation de l’échantillon et incubez l’échantillon pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour permettre la liaison des anticorps de capture. Le lendemain, jetez la solution d’anticorps diluée des puits et pipetez 300 microlitres de solution de lavage dans chaque puits.Séchez l’assiette sur une serviette en papier pour enlever l’excédent de PBS. Bloquez chaque puits de la plaque avec 200 microlitres de tampon de blocage. Couvrez-le d’un couvercle en plastique adhésif et obstruez les puits en l’incubant.Après avoir éliminé la solution de blocage des puits et lavé la plaque trois à quatre fois, séchez-la sur une serviette en papier. Ensuite, pipetez 25 microlitres de plasma dans tous les puits, à l’exception du blanc. Et diluez-le avec 75 microlitres de PBS, ce qui donne le volume final du puits à 100 microlitres.Ajoutez ensuite 100 microlitres de PBS dans le puits vierge. Mélangez les échantillons en plaçant la plaque sur un shaker pendant 10 secondes à 250 tr/min à température ambiante. Ajouter deux microlitres de DNase I diluée à 100 dans tous les puits et placer la plaque scellée sur l’agitateur pendant 10 secondes pour bien mélanger les échantillons.Incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Ajoutez un microlitre d’EDTA de 0,5 molaire dans chaque puits pour arrêter la réaction de DNase. Placez ensuite la plaque scellée sur le shaker pendant 15 secondes pour bien mélanger les échantillons.Enfin, incubez la plaque pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour permettre aux composants protéiques des TNE de se fixer aux anticorps de capture. Le lendemain, jetez la solution des puits. Après plusieurs lavages de puits, pipeter 100 microlitres d’anticorps de détection anti-ADN conjugué à la peroxydase diluée dans chaque puits.Incubez la plaque pendant 1 1/2 heure, puis jetez la solution dans les puits. Après avoir lavé les puits trois fois, pipetez 100 microlitres de solution de substrat ABTS dans chaque puits et incubez la plaque scellée sur un agitateur dans l’obscurité. Arrêtez la réaction en ajoutant 50 microlitres d’acide sulfurique à deux molaires.Mélangez le contenu du puits en tapotant soigneusement les côtés de l’assiette. Ensuite, connectez le lecteur de microplaques à l’ordinateur et lancez l’application logicielle. Dans la barre d’état, créez un nouveau test et nommez-le.Définissez ensuite les paramètres de lecture de la plaque en sélectionnant Absorbance comme type de lecture, Endpoint comme mode de lecture et deux comme longueurs d’onde. Ensuite, définissez lambda un sur 405 nanomètres, lambda deux sur 490 nanomètres. Maintenant, sélectionnez l’état Désactivé pour le mélange automatique et l’effacement tout en gardant l’étalonnage automatique sur Activé.Sélectionnez ensuite Lire la plaque entière sous Bandes.Enfin, définissez la priorité de longueur d’onde de la colonne avec Normal comme vitesse de chariot, puis sélectionnez Désactivé sous Lecture automatique. Placez bien la plaque dans le tiroir à instruments et fermez-le. Cliquez sur Lire pour que la plaque soit lue immédiatement.Lisez l’absorbance de chaque puits à 405 nanomètres et soustrayez automatiquement l’absorbance du milieu d’analyse de tous les échantillons inconnus. Des courbes d’étalonnage standard fiables ont été obtenues pour l’ADN-MPO et l’ADN-E lorsque les valeurs d’absorbance ne dépassaient pas 0,93 et 0,9, respectivement. La dose d’OD la plus élevée a été obtenue lorsque 0,6 microgramme par millilitre de DNase I a été appliqué.Les coefficients de variabilité inter-essais pour les complexes chez les témoins sains étaient respectivement de 1,871 et 0,987, tandis que les patients atteints de COVID-19 présentaient des coefficients de variabilité de 2,532 et 2,010, respectivement. Les coefficients moyens de variabilité inter-essais pour l’ADN-MPO et l’ADN-E étaient respectivement de 6,524 et 4,389. La spécificité des anticorps de capture aux complexes MPO-ADN et NE-ADN a montré que les anticorps témoins de type iso réagissaient peu aux complexes.Le pourcentage des deux complexes était plus élevé dans le plasma des patients atteints de COVID-19 par rapport aux témoins sains. Le temps de digestion de la DNase doit être optimisé, sinon une digestion excessive réduira l’absorbance.

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