Name: quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Huq Muhammad Aminul für die Unterstützung bei der Begutachtung des Manuskripts.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von den institutionellen Prüfungsausschüssen der Medizinischen Universität Aichi genehmigt (2017-H341, 2019-H137). Von jedem Teilnehmer wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.
1. Vorbereitung der Reagenzien
HINWEIS: Für die Durchführung des Sandwich-ELISA-Assays werden die Reagenzien wie unten beschrieben vorbereitet.
<ol><li>Puffer ...

<ol>
	<li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro.">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).</li><li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes.">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li><li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes:+Friend+or+foe.">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li><li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases.">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li><li>S&#248;rensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients.">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., K&#252;hn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis.">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li><li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps.">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology &amp; Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).</li><li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients.">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).</li><li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+extracellular+trap+(NET)+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB.">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587 (2017).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils.">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li><li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps.">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424 (2020).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19.">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).</li><li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+patients:+A+case+series+and+review+of+the+literature.">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li><li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis.">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).</li><li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis.">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li></ol>

Wir haben eine Sandwich-ELISA-Methode beschrieben, bei der MPO oder NE während der anfänglichen Inkubation von Proben, die MPO-DNA- oder NE-DNA-Komplexe enthalten, an eine Stelle des Fängerantikörpers bindet. Nach dem Waschen wird das "Sandwich" vervollständigt, indem die Proben mit einem Peroxidase-assoziierten monoklonalen Anti-DNA-Antikörper inkubiert werden. Nach der Entfernung des ungebundenen Sekundärantikörpers wird das gebundene Peroxidase-Konjugat durch Zugabe eines chromogenen ABTS-Peroxidase-Substrats ...

In diesem Artikel wird eine Methode zur Quantifizierung der Bildung von extrazellulären Fallen (NET) in biologischen Flüssigkeiten beschrieben, indem der Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) verwendet wird, um Komplexe von Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (NE) mit DNA 1,2 nachzuweisen. NETs bestehen aus einem DNA-Rückgrat, das mit antimikrobiellen Proteasen aus neutrophilen Granula dekoriert ist 3,4. Sowohl MPO-DNA- als auch NE-DNA-Komplexe sind wichtige und spezifische Bestandteile von NETs und werden als Abbauprodukte von NETsin den extrazellulären Raum freigesetzt 3,4.
Neben ihrer wichtigen physiologischen Rolle bei der antimikrobiellen Abwehr3 haben NETs auch verschiedene pathologische Wirkungen4,5, einschließlich der Förderung der Thrombogenese6 und der Verschlechterung der Sepsis7. Dementsprechend haben NETs in letzter Zeit an Aufmerksamkeit gewonnen. Nichtsdestotrotz hat sich die In-vivo-Quantifizierung von NETs als schwierig erwiesen, da es keine empfindliche, zuverlässige quantitative Assay-Methode gibt.
Es stehen einige Methoden zur Verfügung, darunter die direkte Messung von NETs mittels Fluoreszenzmikroskopie8,9 und Durchflusszytometrie 10 sowie die indirekte Messung von zirkulierender zellfreier DNA, Nukleosomen und citrulliniertem Histon H3, aber jede Methode hat ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen11. Obwohl die immunfluoreszenzmikroskopische Methode spezifisch für NETs ist und die Lokalisation und den Grad der NET-Bildung deutlich zeigt, sind die Proben auf Biopsiegewebe und sezernierte Materialien beschränkt. Darüber hinaus muss diese Methode von erfahrenen Forschern durchgeführt werden und erfordert eine lange Zeit, bis Ergebnisse vorliegen. Die Messung der zirkulierenden Konzentrationen von NET-bezogenen Komponenten mittels Durchflusszytometrie ist einfach und liefert schnell Ergebnisse. Die Methode ist jedoch nicht spezifisch für NETs12.
Wir13 und andere 1,2 haben einen hochempfindlichen und zuverlässigen Assay entwickelt, um die zirkulierenden NET-Komponenten, MPO-konjugierte oder NE-konjugierte DNA, in menschlichem Plasma mit einer modifizierten ELISA-Technik zu messen, die spezifische Antikörper für MPO oder NE als Fangantikörper und einen DNA-spezifischen Detektionsantikörper verwendet. Dieser Assay kann auch ex vivo verwendet werden, um NET-Komponenten in Zellkulturüberständen zu identifizieren, die von aktivierten Neutrophilen als Reaktion auf die Stimulation von Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) freigesetzt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Polymorphs</td>
			<td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td>
			<td>AN221725</td>
			<td>Isolation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>467466</td>
			<td>flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 530 001</td>
			<td>Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 521 001&#160;</td>
			<td>Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plastic cover, Axygen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14222348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>&#160;07-496-I</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NE antibody, clone AHN-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>MABS461</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biomedical Science</td>
			<td>BR-220700081</td>
			<td>Albumin from bovine fraction V. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 2 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303M</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG, rabbit, Isotype Control</td>
			<td>GENETEX, Inc.</td>
			<td>GTX35035</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>MABC002</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate mixer</td>
			<td>As one corporation</td>
			<td>NS-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax 190&#160;</td>
			<td>Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405&#8211;490 nm can use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader application</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SoftMax pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>1154467500</td>
			<td>&#160;bottle 2. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 1 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Activation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T9181</td>
			<td>Store at room temperature. Stable for 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot v14.5</td>
			<td>&#160;Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>190-14901</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa

Bestimmte Stimuli, wie z. B. Mikroorganismen, veranlassen Neutrophile, neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) freizusetzen, bei denen es sich im Wesentlichen um netzartige Strukturen handelt, die aus DNA mit Körnerproteinen wie Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (NE) sowie zytoplasmatischen und zytoskelettalen Proteinen bestehen. Obwohl das Interesse an NETs in letzter Zeit zugenommen hat, gibt es keine empfindliche, zuverlässige Testmethode für die Messung von NETs im klinischen Umfeld. Dieser Artikel beschreibt einen modifizierten Sandwich-Enzym-gekoppelten Immunosorbent-Assay zur quantitativen Messung von zwei Komponenten zirkulierender NETs, MPO-DNA und NE-DNA-Komplexe, die spezifische Bestandteile von NETs sind und als Abbauprodukte von NETs in den extrazellulären Raum freigesetzt werden. Der Assay verwendet spezifische monoklonale Antikörper gegen MPO oder NE als Fängerantikörper und einen DNA-spezifischen Detektionsantikörper. MPO oder NE bindet während der ersten Inkubation von Proben, die MPO-DNA- oder NE-DNA-Komplexe enthalten, an eine Stelle des Fängerantikörpers. Dieser Assay weist eine gute Linearität und eine hohe Präzision zwischen und innerhalb des Assays auf. Wir setzten es bei 16 Patienten mit COVID-19 und damit einhergehendem akutem Atemnotsyndrom ein und stellten fest, dass die Plasmakonzentrationen von MPO-DNA und NE-DNA signifikant höher waren als im Plasma gesunder Kontrollen. Dieser Detektionsassay ist eine zuverlässige, hochempfindliche und nützliche Methode zur Untersuchung der Eigenschaften von NETs in humanen Plasma- und Kulturüberständen.

Bei dieser Methode wurde ein Sandwich-ELISA mit monoklonalen Anti-MPO-, Anti-NE- und Anti-DNA-Antikörpern verwendet, um MPO-assoziierte und NE-assoziierte DNA zu messen (Abbildung 1). Bei dieser Methode wurden die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit einem MPO- oder NE-spezifischen monoklonalen Antikörper beschichtet, um DNA-assoziiertes MPO und DNA-assoziiertes NE sowie nicht-DNA-assoziiertes MPO und NE einzufangen. Zur Berechnung des Intra-Assay-Variabilitätskoeffizienten (CV) wurden...

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Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Wir präsentieren ein Protokoll für eine modifizierte Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Technik zur quantitativen Messung von zwei Komponenten von neutrophilen extrazellulären Fallenresten, Myeloperoxidase-konjugierter DNA und neutrophiler Elastase-konjugierter DNA-Komplexe, die von aktivierten Neutrophilen abgeleitet sind.

Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

NETs haben in jüngster Zeit Aufmerksamkeit erregt, aber die Quantifizierung von NETs in vivo hat sich als schwierig erwiesen. Dieses Protokoll bietet eine wünschenswerte, hochempfindliche und wertvolle Methode zur Untersuchung der Eigenschaften von NETs im klinischen Umfeld. Diese Technik sollte erweitert werden, um den Schweregrad der Sepsis oder des septischen ARDS, des akuten Atemnotsyndroms, zu beurteilen.Es ist allgemein anerkannt, dass die Regulierung von Dumps oder schadensassoziierten molekularen Mustern ein Schlüssel zur Verbesserung des klinischen Zustands der Sepsis ist. Der größte Vorteil dieser Methode ist die genaue Quantifizierung von zirkulierenden NET-Resten wie Myeloperoxidase-DNA und neutrophiler Elastase-DNA in kurzer Zeit. Es ist ratsam, die Proben vor dem Assay zu schleudern und wiederholtes Auftauen zu vermeiden.Es ist wichtig, die im Protokoll angegebenen Inkubationszeiten einzuhalten. Beginnen Sie mit der Verdünnung frisch isolierter polymorphkerniger Neutrophiler auf 10.000 Zellen pro Milliliter in phenolrotfreiem RPMI 1640. In 35-Millimeter-Kulturschalen sieben.Um neutrophile extrazelluläre Fallen oder NETs zu induzieren, stimulieren Sie zunächst die polymorphkernigen Neutrophilen mit 25 nanomolaren PMA. Dann werden die extrazellulären Fallen durch Zugabe von 0,6 Mikrogramm pro Milliliter DNase I teilweise verdaut und die Mischung 50 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Fügen Sie nun fünf-millimolares EDTA hinzu, um die DNase-Aktivität zu stoppen, und sammeln Sie das Medium, das die synthetisierten NETs enthält.Zentrifugieren, um die Zelltrümmer zu entfernen. Sammle die Überstände von vier gesunden Kontrollen. Mischen Sie sie und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius für die weitere Verwendung.Pipettieren Sie 100 Mikroliter verdünnte Antimyeloperoxidase mit 0,05 Mikrogramm des Antikörpers in eine ELISA-Platte. Decken Sie nun die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung ab, um die Verdunstung der Probe zu verhindern, und inkubieren Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius, um die Bindung der Fängerantikörper zu ermöglichen. Am nächsten Tag wird die verdünnte Antikörperlösung aus den Vertiefungen entsorgt und 300 Mikroliter Waschlösung in jede Vertiefung pipettiert.Klopfen Sie die Platte auf einem Papiertuch trocken, um den überschüssigen PBS zu entfernen. Blockieren Sie jede Vertiefung der Platte mit 200 Mikrolitern des Sperrpuffers. Decken Sie es mit einer selbstklebenden Plastikabdeckung ab und verstopfen Sie die Vertiefungen, indem Sie es inkubieren.Nachdem Sie die Blockierungslösung aus den Vertiefungen entsorgt und die Platte drei- bis viermal gewaschen haben, klopfen Sie sie auf einem Papiertuch trocken. Als nächstes pipettieren Sie 25 Mikroliter Plasma in alle Vertiefungen mit Ausnahme des Rohlings. Und verdünnen Sie es mit 75 Mikrolitern PBS, so dass das endgültige Well-Volumen 100 Mikroliter beträgt.Geben Sie dann 100 Mikroliter PBS in die leere Vertiefung. Mischen Sie die Proben, indem Sie die Platte 10 Sekunden lang bei 250 U/min bei Raumtemperatur auf einen Shaker legen. Geben Sie zwei Mikroliter 100 voll verdünnte DNase I in alle Vertiefungen und legen Sie die versiegelte Platte 10 Sekunden lang auf den Schüttler, um die Proben gründlich zu mischen.15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie einen Mikroliter 0,5 molar EDTA in jede Vertiefung, um die DNase-Reaktion zu stoppen. Legen Sie dann die versiegelte Platte für 15 Sekunden auf den Schüttler, um die Proben gründlich zu mischen.Zum Schluss wird die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert, damit sich die Proteinbausteine der NETs an die Fängerantikörper anlagern können. Am nächsten Tag entsorgen Sie die Lösung aus den Vertiefungen. Nach mehreren Well-Waschungen werden 100 Mikroliter des verdünnten Peroxidase-konjugierten Anti-DNA-Detektionsantikörpers in jede Vertiefung pipettiert.Die Platte 1 1/2 Stunden lang inkubieren und dann die Lösung in die Vertiefungen geben. Nach dem dreimaligen Waschen der Vertiefungen werden 100 Mikroliter ABTS-Substratlösung in jede Vertiefung pipettiert und die versiegelte Platte auf einem Schüttler im Dunkeln inkubiert. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 50 Mikroliter zweimolare Schwefelsäure hinzufügen.Mischen Sie den Inhalt der Vertiefung, indem Sie vorsichtig auf die Tellerränder klopfen. Schließen Sie als Nächstes den Mikroplatten-Reader an den Computer an und starten Sie die Softwareanwendung. Erstellen Sie in der Statusleiste ein neues Experiment, und geben Sie ihm einen Namen.Legen Sie dann die Parameter für das Ablesen der Platte fest, indem Sie Absorption als Lesetyp, Endpunkt als Lesemodus und zwei als Wellenlängen auswählen. Legen Sie als Nächstes Lambda eins auf 405 Nanometer und lambda zwei auf 490 Nanometer fest. Wählen Sie nun den Status "Aus" sowohl für "Automix" als auch für "Blanking" aus, während Sie die Option "AutoKalibrierung" auf "Ein" setzen.Wählen Sie dann unter "Streifen" die Option "Gesamte Platte lesen" aus.Legen Sie abschließend die Wellenlängenpriorität der Spalte mit Normal als Wagengeschwindigkeit fest, und wählen Sie dann unter AutoRead die Option Aus aus. Legen Sie die Platte gut in die Instrumentenschublade und schließen Sie sie. Klicken Sie auf Lesen, damit die Platte sofort gelesen wird.Lesen Sie die Absorption jedes Wells bei 405 Nanometern ab und führen Sie eine automatische Subtraktion der Absorption des Assaymediums von allen unbekannten Proben durch. Zuverlässige Standardkalibrierungskurven wurden sowohl für MPO-DNA als auch für NE-DNA erhalten, wenn die Absorptionswerte 0,93 bzw. 0,9 nicht überschritten. Die höchste OD wurde bei der Anwendung von 0,6 Mikrogramm pro Milliliter DNase I erzielt.Die Inter-Assay-Variabilitätskoeffizienten für die Komplexe bei gesunden Kontrollen betrugen 1,871 bzw. 0,987, während die COVID-19-Patienten Variabilitätskoeffizienten von 2,532 bzw. 2,010 aufwiesen. Die mittleren Inter-Assay-Variabilitätskoeffizienten für MPO-DNA und NE-DNA betrugen 6,524 bzw. 4,389. Die Spezifität der Fängerantikörper gegenüber den MPO-DNA- und NE-DNA-Komplexen zeigte, dass die Isotyp-Kontrollantikörper wenig auf die Komplexe reagierten.Der prozentuale Anteil beider Komplexe war im Plasma von Patienten mit COVID-19 höher als bei den gesunden Kontrollen. Die Verdauungszeit sollte optimiert werden, da sonst eine übermäßige Verdauung die Absorption verringert.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...