Name: quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

המחברים מודים לד"ר הוק מוחמד אמינול על סיועו בעיון בכתב היד.

מחקר זה נערך בהתאם להצהרת הלסינקי ואושר על ידי מועצות הסקירה המוסדיות של האוניברסיטה הרפואית אאיצ'י (2017-H341, 2019-H137). התקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל משתתף.
1. הכנת מגיב
הערה: כדי לבצע את בדיקת הכריך ELISA, הריאגנטים מוכנים כמתואר להלן.
<ol><li>חיץ ציפוי:<ol><li>כדי ליצ...

<ol>
	<li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro.">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).</li><li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes.">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li><li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes:+Friend+or+foe.">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li><li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases.">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li><li>S&#248;rensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils.">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li><li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+(NETs)+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients.">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li><li>Brinkmann, V., Goosmann, C., K&#252;hn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation.">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).</li><li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis.">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li><li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps.">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology &amp; Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).</li><li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients.">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).</li><li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+extracellular+trap+(NET)+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB.">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587 (2017).</li><li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li><li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils.">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li><li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps.">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424 (2020).</li><li>Th&#229;lin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+citrullinated+histones:+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma.">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19.">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).</li><li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+(COVID-19)+patients:+A+case+series+and+review+of+the+literature.">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li><li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis.">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).</li><li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis.">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li></ol>

תיארנו שיטת סנדוויץ' ELISA שבה MPO או NE נקשרים לאתר אחד של נוגדן הלכידה במהלך הדגירה הראשונית של דגימות המכילות מתחמי MPO-DNA או NE-DNA. לאחר השטיפה, "הכריך" הושלם על ידי דגירה של הדגימות עם נוגדן חד שבטי הקשור לפרוקסידז נגד DNA. לאחר הסרת נוגדן משני לא קשור, מצומד הפרוקסידז הכבול מזוהה על ידי תוספת של מצ...

מאמר זה מתאר שיטה לכימות היווצרות מלכודת נויטרופילים חוץ-תאיים (NET) בנוזלים ביולוגיים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים סנדוויץ' (ELISA) כדי לזהות קומפלקסים של מיאלופרוקסידאז (MPO) ואלסטאז נויטרופילים (NE) עם DNA 1,2. NETs מורכבים מעמוד שדרה של DNA המעוטר בפרוטאזות אנטי-מיקרוביאליות שמקורן בגרגרי נויטרופילים 3,4. הן קומפלקסים MPO-DNA והן NE-DNA הם מרכיבים חשובים וספציפיים של NETs והם משוחררים לחלל החוץ תאי כתוצרי פירוק של NETs 3,4.
מלבד תפקידם הפיזיולוגי החשוב בהגנה אנטי-מיקרוביאלית3, ל-NETs יש גם השפעות פתולוגיות שונות4,5, כולל קידום טרומבוגנזה6 והחמרה באלח דם7. בהתאם לכך, רשתות צוברים תשומת לב לאחרונה. עם זאת, כימות in vivo של NETs הוכח כמאתגר בשל היעדר שיטת בדיקה כמותית רגישה ואמינה.
קיימות מספר שיטות, כולל מדידה ישירה של NETs במיקרוסקופ פלואורסצנטי8,9 וציטומטריית זרימה 10 ומדידה עקיפה של דנ"א נטול תאים במחזור, נוקלאוזומים והיסטון H3 ציטרולינציה, אך לכל שיטה יתרונות ומגבלות משלה11. למרות שהשיטה המיקרוסקופית האימונופלואורסצנטית היא ספציפית ל- NETs ומראה בבירור את הלוקליזציה ואת מידת היווצרות ה- NET, הדגימות מוגבלות לרקמת ביופסיה וחומרים מופרשים. יתר על כן, שיטה זו צריכה להתבצע על ידי חוקרים מיומנים ודורשת זמן רב לקבלת תוצאות. מדידת רמות במחזור של רכיבים הקשורים ל- NET באמצעות ציטומטריית זרימה היא קלה ומספקת תוצאות במהירות; עם זאת, השיטה אינה ספציפית ל- NETs12.
אנו13 ואחרים1,2 פיתחנו בדיקה רגישה ואמינה ביותר למדידת רכיבי NET במחזור, MPO-conjugated או NE-conjugated DNA, בפלזמה אנושית עם טכניקת ELISA שונה המשתמשת בנוגדנים ספציפיים עבור MPO או NE כנוגדנים ללכידה ונוגדן זיהוי ספציפי ל- DNA. בדיקה זו יכולה לשמש גם ex vivo כדי לזהות רכיבי NET בסופרנאטנטים של תרביות תאים המשתחררים על ידי נויטרופילים פעילים בתגובה לגירוי phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Step Polymorphs</td>
			<td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td>
			<td>AN221725</td>
			<td>Isolation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>467466</td>
			<td>flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 530 001</td>
			<td>Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABTS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>11 204 521 001&#160;</td>
			<td>Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plastic cover, Axygen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14222348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>&#160;07-496-I</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is rabbit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NE antibody, clone AHN-10</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>MABS461</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C. stable for 1 year. Host species is mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biomedical Science</td>
			<td>BR-220700081</td>
			<td>Albumin from bovine fraction V. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 2 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303M</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG, rabbit, Isotype Control</td>
			<td>GENETEX, Inc.</td>
			<td>GTX35035</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>MABC002</td>
			<td>Store as concentrated solution at 2&#8211;8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson and Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate mixer</td>
			<td>As one corporation</td>
			<td>NS-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax 190&#160;</td>
			<td>Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405&#8211;490 nm can use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader application</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SoftMax pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>1154467500</td>
			<td>&#160;bottle 2. Store at 2&#8211;8 &#176;C. stable for 1 year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Activation of PMN&#39;s from human blood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>T9181</td>
			<td>Store at room temperature. Stable for 6 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot v14.5</td>
			<td>&#160;Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>190-14901</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying myeloperoxidase-dna and neutrophil elastase-dna complexes from neutrophil extracellular traps by using a modified sandwich elisa

גירויים מסוימים, כגון מיקרואורגניזמים, גורמים לנויטרופילים לשחרר מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs), שהם בעצם מבנים דמויי רשת המורכבים מדנ"א עם חלבוני גרגירים, כגון myeloperoxidase (MPO) ואלסטאז נויטרופילים (NE), וחלבונים ציטופלזמיים וציטו-שלד. למרות שהעניין ב- NETs גדל לאחרונה, אין שיטת בדיקה רגישה ואמינה זמינה למדידת NETs במסגרות קליניות. מאמר זה מתאר בדיקה אימונוסורבנטית המקושרת לאנזים סנדוויץ' שונה כדי למדוד כמותית שני מרכיבים של NETs במחזור, MPO-DNA וקומפלקסים NE-DNA, שהם רכיבים ספציפיים של NETs ומשוחררים לחלל החוץ תאי כתוצרי פירוק של NETs. הבדיקה משתמשת בנוגדנים חד-שבטיים ספציפיים עבור MPO או NE כנוגדנים ללכידה ונוגדן זיהוי ספציפי ל- DNA. MPO או NE נקשר לאתר אחד של נוגדן הלכידה במהלך הדגירה הראשונית של דגימות המכילות מתחמי MPO-DNA או NE-DNA. בדיקה זו מראה ליניאריות טובה ודיוק גבוה בין בדיקות ותוך מבחנים. השתמשנו בו ב-16 חולי COVID-19 עם תסמונת מצוקה נשימתית חריפה נלווית ומצאנו כי ריכוזי ה-MPO-DNA וה-NE-DNA בפלזמה היו גבוהים משמעותית מאשר בפלזמה שהתקבלה מקבוצת ביקורת בריאה. בדיקת זיהוי זו היא שיטה אמינה, רגישה ביותר ושימושית לחקירת המאפיינים של NETs בפלזמה אנושית ובתרבית-על.

שיטה זו השתמשה בכריך ELISA עם נוגדנים חד-שבטיים אנטי-MPO, אנטי-NE ואנטי-דנ"א כדי למדוד דנ"א הקשור ל-MPO ול-NE (איור 1). בשיטה זו, הבארות של צלחת מיקרוטיטר צופו בנוגדן חד-שבטי ספציפי ל-MPO או NE ספציפי כדי ללכוד MPO הקשור ל-DNA ו-NE הקשור ל-DNA, כמו גם MPO ו-NE שאינם קשורים ל-DNA. כדי לחשב את מקדם השונות ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA at JoVE.com

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

אנו מציגים פרוטוקול לטכניקת בדיקה אימונוסורבית המקושרת לאנזים סנדוויץ' שונה כדי למדוד כמותית שני מרכיבים של שרידי מלכודת חוץ-תאיים של נויטרופילים, מיילאופרוקסידז מצומד-DNA וקומפלקסים של דנ"א מצומד אלסטאז נויטרופילים, הנגזרים מנויטרופילים פעילים.

כימות קומפלקסים של Myeloperoxidase-DNA ו-Neutrophil Elastase-DNA ממלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים באמצעות כריך ELISA שעבר שינוי

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

NETs משכו תשומת לב לאחרונה, אך כימות NETs in vivo הוכח כמאתגר. פרוטוקול זה מספק שיטה רצויה, רגישה ובעלת ערך רב לחקר המאפיינים של NETs במסגרות קליניות. טכניקה זו צריכה להרחיב כדי להעריך את חומרת אלח דם או ARDS, תסמונת מצוקה נשימתית חריפה.מקובל כי ויסות מזבלות או דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק הוא המפתח לשיפור המצב הקליני של אלח דם. היתרון הגדול ביותר של שיטה זו כולל כימות מדויק של שאריות NET במחזור כמו myeloperoxidase-DNA ו neutrophil elastase-DNA בזמן קצר. מומלץ לסובב את הדגימות לפני הבדיקה ולהימנע מהפשרה חוזרת.חשוב לעקוב אחר זמני הדגירה כפי שניתנו בפרוטוקול. התחל על ידי דילול נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים מבודדים טריים ל -10, 000 תאים למיליליטר ב- RPMI ללא אדום פנול 1640. מסננים אותם בצלחות תרבית של 35 מילימטר.כדי לגרום למלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות או NETs, תחילה לעורר את הנויטרופילים הפולימורפו-גרעיניים עם PMA ננו-מולרי של 25. לאחר מכן עיכלו חלקית את המלכודות החוץ תאיות על ידי הוספת 0.6 מיקרוגרם למיליליטר של DNase I, ודגרו על התערובת במשך 50 דקות בטמפרטורת החדר. כעת, הוסף EDTA של חמישה מילימולרים כדי לעצור את פעילות ה- DNase, ולאסוף את המדיום המכיל את רשתות המסונתזות.צנטריפוגה להסרת פסולת התא. אספו את הסופרנאטנטים מארבע בקרות בריאות. מערבבים, מאחסנים אותם בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף.פיפטה 100 מיקרוליטר של אנטי myeloperoxidase מדולל המכיל 0.05 מיקרוגרם של הנוגדן לתוך צלחת ELISA. כעת, כסו את הצלחת בכיסוי פלסטיק דביק למניעת אידוי הדגימה, ודגרו על הדגימה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר את קשירת נוגדני הלכידה. למחרת, להשליך את תמיסת הנוגדנים המדוללת מהבארות, ופיפטה 300 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה לכל באר.יש לייבש את הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את עודפי PBS. חסום כל באר של הצלחת עם 200 מיקרוליטר של חיץ החסימה. מכסים אותו בכיסוי פלסטיק דביק, וחוסמים את הבארות על ידי דגירה עליו.לאחר השלכת תמיסת החסימה מהבארות ושטיפת הצלחת שלוש עד ארבע פעמים, טפחו עליה יבשה על מגבת נייר. לאחר מכן, פיפטה 25 מיקרוליטר של פלזמה לתוך כל הבארות למעט הריק. ולדלל אותו עם 75 מיקרוליטר של PBS, מה שהופך את נפח הבאר הסופי 100 מיקרוליטר.לאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטר של PBS לבאר הריקה. ערבבו את הדגימות על ידי הנחת הצלחת על שייקר למשך 10 שניות ב-250 סל"ד בטמפרטורת החדר. הוסיפו שני מיקרוליטרים של 100 DNase I בדילול מלא לכל הבארות, והניחו את הצלחת האטומה על השייקר למשך 10 שניות כדי לערבב היטב את הדגימות.יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף מיקרוליטר אחד של 0.5 EDTA מולארי לכל באר כדי לעצור את תגובת DNase. לאחר מכן הניחו את הצלחת האטומה על השייקר למשך 15 שניות כדי לערבב היטב את הדגימות.לבסוף, לדגור על הצלחת במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר לרכיבי החלבון של ה- NETs להיצמד לנוגדנים לכידה. למחרת, השליכו את הפתרון מהבארות. לאחר שטיפות באר מרובות, פיפטה 100 מיקרוליטר של נוגדן אנטי DNA מצומד peroxidase מצומד לתוך כל באר.לדגור על הצלחת במשך 1 1/2 שעות, ולאחר מכן להשליך את הפתרון בארות. לאחר שטיפת הבארות שלוש פעמים, פיפטה 100 מיקרוליטר של מצע ABTS תמיסת מצע לתוך כל באר, ולדגור את הצלחת האטומה על שייקר בחושך. עצור את התגובה על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של חומצה גופרתית דו טוחנת.מערבבים את תכולת הבאר על ידי הקשה זהירה על דפנות הצלחת. לאחר מכן, חבר את קורא microplate למחשב ולהפעיל את יישום התוכנה. בשורת המצב, צור ניסוי חדש ותן לו שם.לאחר מכן הגדר את פרמטרי קריאת הלוחות על-ידי בחירה באפשרות 'בליעה' כסוג הקריאה, 'נקודת קצה' כמצב קריאה ושניים כאורכי הגל. לאחר מכן, קבעו למבדה אחת כ-405 ננומטר, למבדה שתיים כ-490 ננומטר. כעת, בחר את מצב כבוי הן עבור Automix והן עבור Blanking תוך שמירה על הכיול האוטומטי כמופעל.לאחר מכן בחר קרא את כל הצלחת תחת רצועות.לבסוף, הגדר את עדיפות אורך גל עמודה עם רגיל כמהירות גררה ולאחר מכן בחר כבוי תחת קריאה אוטומטית. הכניסו את הצלחת היטב למגירת המכשירים וסגרו אותה. לחץ על קרא כך שהצלחת תיקרא מיד.קרא את הספיגה של כל באר ב 405 ננומטר, ובצע חיסור אוטומטי של ספיגת מדיום הבדיקה מכל הדגימות הלא ידועות. עקומות כיול סטנדרטיות אמינות התקבלו הן עבור MPO-DNA והן עבור NE-DNA כאשר ערכי הספיגה לא עלו על 0.93 ו-0.9, בהתאמה. OD הגבוה ביותר התקבל כאשר 0.6 מיקרוגרם למיליליטר של DNase I יושם.מקדמי השונות בין הבדיקות עבור המתחמים בבקרות בריאות היו 1.871 ו-0.987, בהתאמה, ואילו חולי הקורונה הראו מקדמי שונות של 2.532 ו-2.010, בהתאמה. מקדמי השונות הממוצעים של MPO-DNA ו-NE-DNA היו 6.524 ו-4.389, בהתאמה. הספציפיות של נוגדני הלכידה לקומפלקסים MPO-DNA ו- NE-DNA הראתה כי נוגדני הבקרה מסוג ISO הגיבו מעט לקומפלקסים.אחוז שני המתחמים היה גבוה יותר בפלזמה מחולי קורונה ביחס לבקרות הבריאות. זמן העיכול של DNase צריך להיות אופטימלי, אחרת עיכול מוגזם יפחית את הספיגה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

פשוטה מלכודות תאיות נויטרופילים אדם בידוד (רשתות) וטיפול

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

ואלקטרופורזיס פשוט עבור כימות של שחרור מלכודת לכלבים נויטרופילים תאיים

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

זיהוי של המלכודות נויטרופילים מסחטות ב פרפין-מוטבע בעורקים בעורק החתולים באמצעות מיקרוסקופ אימונולומוטורנציה

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...